Extracto
Homeobox D10 (HoxD10) juega un papel importante en la diferenciación de células embrionarias y la progresión del cáncer de mama. Nuestro informe anterior reveló que el factor de crecimiento similar a la insulina fue regulada por HoxD10 en células de cáncer gástrico proteína de unión-3 (IGFBP3); sin embargo, los papeles funcionales y los mecanismos subyacentes de la IGFBP3 en el cáncer gástrico no están claros. Aquí, se encontró que la expresión de IGFBP3 se upregulated después de la expresión ectópica de HoxD10 en células de cáncer gástrico. ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina mostró que HoxD10 obligado a tres regiones potenciales de promotor IGFBP3. Exógenos HoxD10 mejora de forma significativa la actividad de informador de luciferasa que contiene estas regiones de unión en células de cáncer gástrico. Otros datos mostraron que todos estos sitios de unión tenían Hox de unión al elemento "ttat". resultados de tinción inmunohistoquímicos revelaron que la expresión de IGFBP3 se downregulated significativamente en 86 tejidos adenocarcinomas gástricos en relación con sus tejidos no cancerosos adyacentes (p & lt; 0,001). Además, la expresión IGFBP3 fue significativamente menor en tumor gástrico con metástasis en los ganglios linfáticos en comparación con la metástasis en los ganglios linfáticos sin (p = 0,045). Los pacientes con alto nivel de expresión de IGFBP3 mostraron supervivencia global a los 5 año agradable (p = 0,011). Desmontables de IGFBP3 aceleró la migración de células de cáncer gástrico y la invasión y se indujo la expresión de factores invasivos incluyendo MMP14, uPA y uPAR. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que el gen diana IGFBP3-HoxD10 puede suprimir la invasión de células de cáncer gástrico y favorece la supervivencia de pacientes con cáncer gástrico
Visto:. Xue M, Fang Y, Sun G, W Zhuo, Zhong J, Qian C, et al. (2013) IGFBP3, un objetivo transcripcional de Homeobox D10, se correlaciona con el pronóstico del cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10.1371 /journal.pone.0081423
Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de junio de 2013; Aceptado: October 13, 2013; Publicado: December 27, 2013
Derechos de Autor © 2013 Xue et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Programa Nacional de Investigación básica de China (973 programas) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) y el Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de Educación Superior de China, (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más frecuente y en la actualidad es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1]. Casi la mitad de los pacientes Caner gástricos ya han avanzado a la etapa tardía con linfático o metástasis a distancia en el diagnóstico y perder la oportunidad para la cirugía [2]. Estos pacientes tienen un mal resultado y la tasa de supervivencia de cinco años para aquellos con metástasis a distancia es inferior al 5% [3]. La progresión del cáncer gástrico se considera que es un proceso de múltiples pasos que implica la activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores. Hemos presentado anteriormente que homeobox D10 (HoxD10) sirvió como un supresor de tumor suprimiendo el crecimiento del tumor y la invasión, que fue silenciado epigenetically en el cáncer gástrico [4].
HoxD10 gen pertenece a la superfamilia homeobox, que codifican factores de transcripción y ejercer funciones principalmente a través de la activación o represión de los genes diana [5]. brazo Amino-terminal del homeodominio Hox tiene varios elementos de unión de consenso de base, incluidos ttat, TAAT y TTAC [6,7]. Por ejemplo, HoxC8 se une a estos elementos en regiones promotoras y modula la actividad transcripcional de PEDF, NCAM, ZAC1, OPN y Cdh11, como se determina por ensayos de alto a lo largo de la cromatina de inmunoprecipitación y análisis global sitio HoxC8 de unión al ADN [7]. Los estudios han demostrado que inhibe la motilidad HoxD10 angiogénesis y celular en el cáncer de endometrio (CE) [8] y perjudica la invasión de células de cáncer gástrico y de mama [4,9]. Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos de cómo HoxD10 ejerce sus funciones en la carcinogénesis y la progresión tumoral. Hemos analizado sistemáticamente los objetivos potenciales de HoxD10 por cDNA microarray y se identificaron varios genes, incluyendo la unión del factor de crecimiento similar a la insulina proteína-3 (IGFBP3) que podría ser responsable del efecto supresor de tumores de HoxD10 en el cáncer gástrico [4].
IGFBP3 es una de las principales especies de IGFBP en circulación, la unión más del 75% del circulante factor de crecimiento insulínico I (IGF-I) [10]. Se podría inhibir la proliferación celular e inducir la apoptosis de las células de varios tipos de cáncer, incluyendo el de próstata y el cáncer gástrico [11,12]. Varios estudios han confirmado que IGFBP3 suprime la invasividad del cáncer de endometrio (CE) células [13], la metástasis en el cáncer de próstata [14], y la angiogénesis en carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) [15]. En general se consideró que IGFBP3 podría bloquear la región de unión de IGF-I en su receptor IGF-IR, por lo tanto suprimir el efecto de IGF /IGF-IR eje. Además la dependencia del eje IGF /IGF-IR, existe IGF /maneras independientes y nucleares de IGF-IR alternativas de translocación [10]. Muchos factores han aclarado para regular la expresión de IGFBP3, incluyendo el ácido retinoico, factor de necrosis tumoral-α, tricostatina A, tipo caudal homeobox 2 (CDX2) y el estado de metilación de por sí [10,16]. Nuestros estudios anteriores mostraron que IGFBP3 se upregulated en células AGS y MKN28 que sobreexpresa HoxD10 [4]. Considerando región promotora de IGFBP3 tiene varios posibles sitios de unión para HoxD10, predichos por Promo, un programa para la predicción de sitios de unión del factor de transcripción [17], HoxD10 podría interjuego directamente con IGFBP3 en la regulación de la invasión de células de cáncer gástrico. La elucidación de esta red sería facilitar la comprensión de la función de la IGFBP3 en el cáncer gástrico.
En el presente estudio, se identificó que HoxD10 podría unirse directamente las regiones promotoras de IGFBP3 potencialmente a través del elemento ttat, por lo tanto regula transcripcionalmente su expresión en el cáncer gástrico. Además, el nivel de expresión de IGFBP3 es frecuentemente downregulated en tejidos de cáncer gástrico y en relación con la supervivencia global, lo que sugiere que IGFBP3 juega un papel importante en la progresión del cáncer gástrico. Funcionalmente, IGFBP3 podría suprimir la migración y la invasión de células de cáncer gástrico, al menos en parte, a través de la regulación de los factores invasivos, incluyendo la metaloproteinasa-14 (MMP14) y de tipo uroquinasa activador del plasminógeno (uPA).
materiales y Métodos
cultivo de células
Ocho líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 y SGC7901) se obtuvieron a partir de Riken gene Bank (Tsukuba, Japón) y la American Type Culture Collection (Manassas, EE.UU.). Uno no malignas de línea celular gástrica (GES-1) se obtuvo de Beijing Instituto de Investigación del Cáncer (Pekín, China). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Sijiqing, Huzhou, China), y se incubaron a 5% de CO
2, 37 ° C y 95% de humedad.
Construcción de plásmidos informadores de luciferasa IGFBP3
Tres fragmentos diferentes de la región promotora de IGFBP3, incluyendo -2282 a 56 pb (2,3 kb, pIGFBP3), -2.251 -2.073 ~ pb (HoxD10 sitio de I, HBSI) y -1727 ~ -943 pb (HBSII), fueron amplificados por PCR usando ADN genómico extraído a partir de células HEK-293T silvestres como la plantilla de unión. HBSI abarca HBS1 y 2, HBSII contiene de HBS3, 4 y 5, en el que se predice por HBS1-5 PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. secuencias de cebadores HBS fueron los siguientes: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'y 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'y 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'y 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. Los fragmentos de PCR se ligaron en PGM-T vector (Tiangen, Beijing, China), se digirió con KpnI /BglII (Promega, Madison, EE.UU.) y después se subclonó en los sitios KpnI /BgIII en el vector pGL3-basic (Promeg) para generar plásmidos informadores de luciferasa pGL3-pIGFBP3-básica, y el vector del promotor pGL3 (Promega) para generar (II) plásmidos informadores de luciferasa pGL3--promoter HBSI. Todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación de ADN.
Construcción de plásmidos informadores de luciferasa de HBSS
Hemos sintetizado oligonucleótidos con sitios predichos Hox de unión (HBSS) en las regiones promotoras de IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) y cada uno con un punto único sitio mutante (A → C), los oligonucleótidos fueron las siguientes:
HBS3, 5'-CTCTTTTTATTA-3 'y 5'-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3';
HBS3 mutante, 5'-CTCTTTTTCTTA-3 'y 5'-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3';
HBS4, 5'-CATTTGCTATTA-3 'y 5'-CATGGTAAACGATAATCTAG-3';
HBS4 mutante, 5'-CCTTTGCTCTTA-3 'y 5'-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3';
HBS5, 5'-CCTTTATTATTA-3 'y 5'-CATGGGAAATAATAATCTAG-3';
HBS5 mutante, 5'-CCTTTCTTCTTA-3 'y 5'-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3'.
El HBSS de doble cadena se hibridaron y se inserta en la corriente arriba del promotor pGL3 vectorial para generar plásmidos informadores de luciferasa [18]. Todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación de ADN.
Transfección de células
células el Cancer gástrico (BGC823 y SGC7901) fueron transfectadas con pcDNA3.1-HoxD10 o pcDNA3.1 vector vacío usando Fugene HD (Promega) . Para generar líneas celulares estables HoxD10 sobreexpresión, por encima de las células transfectadas se seleccionaron por 400 g /ml G418 (Merck, Darmstadt, Alemania) durante otros 14 días. Por gen desmontables siRNA mediada, BGC823 y SGC7901 células fueron transfectadas con el control negativo siRNA o IGFBP3-dirigido siRNA (Qiagen, Hilden, Alemania), células HGC27 fueron transfectadas con el control negativo siRNA o HoxD10 orientada siRNA (Genepharma, Shanghai, China) usando el reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).
La actividad de luciferasa ensayo
1.0 × 10
5 BGC823 y SGC7901 células fueron sembradas en placas de 24 pocillos durante 24 h, a continuación, transfectadas con pcDNA3.1 0.4μg vector vacío o pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3-básica (promotor) vector vacío o pGL3-pIGFBP3 (HBS) -Básico (promotor), y 0.004μg pRL-TK vector (Promega) que contiene renilla control de referencia utilizando Fugene HD [18]. La actividad de luciferasa se analizó mediante el sistema de ensayo indicador de luciferasa doble después de 48h de acuerdo con los protocolos del fabricante (Promega).
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
En estable HoxD10 sobreexpresa líneas celulares BGC823 y SGC7901, la cromatina se inmunoprecipitó con anticuerpo monoclonal HoxD10 (conejo, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, EE.UU.) [19] o IgG de conejo normal (control negativo) de acuerdo con el Kit de chip enzimática cromatina IP simple (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , ESTADOS UNIDOS). ADN precipitada o muestras de entrada 2% de ADN genómico a partir de células HEK-293T salvajes fueron amplificados con Taq ADN polimerasa (Takara, Otsu, Japón) [20,21]. Cuatro cebadores que abarcan HBSS en los diferentes sitios de promotor IGFBP3 fueron diseñados como sigue: A1 (-2251 ~ -2073 pb, para HBS1 y 2,), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 'y 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3'; A2 (-1765 ~ -1633 pb, para HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'y 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470 ~ -1364bp, por HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'y 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; A4 (-1153 ~ -877bp, por HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 'y 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3'.
PCR con transcripción inversa
El ARN total se aisló con reactivo Trizol (Cwbiotech, Pekín, china). La transcripción inversa (RT) -PCR se determinaron con M-MLV transcriptasa inversa (Takara) y Taq ADN polimerasa. Los siguientes cebadores se utilizaron para la amplificación:
GAPDH, 5 'GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3' y 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 '; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'y 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'y 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3';
MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'y 5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3';
MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'y 5'-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3';
MMP9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'y 5'-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3';
MMP14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'y 5'-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3';
inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 'y 5' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ';
TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'y 5'-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3';
UPA, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'y 5'-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3'; uPAR, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'y 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'.
Western Blot
Las proteínas totales se extrajeron usando tampón de lisis RIPA (Beyotime, Haimen, China). X-100 de tampón de lisis Triton se utilizó para extraer soluble E-cadherina y ß-catenina, se utilizó tampón de lisis SDS para extraer insoluble complejo E-cadherina /ß-catenina [22]. Los lisados se resolvieron en gel de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Bedford, EE.UU.). Las transferencias se sondearon con HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), E-cadherina (1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), ß-catenina ( 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.) o GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) anticuerpos. Las transferencias se visualizaron utilizando un quimioluminiscencia con Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokio, Japón). Las densidades relativas de proteínas se cuantificó con el software Image J. y se normalizaron a GAPDH [20].
cicatrización de heridas ensayo
BGC823 y SGC7901 células fueron transfectadas con siRNA IGFBP3 o siRNA control negativo placas de seis pocillos y luego se rascaban con una punta de pipeta de p10 para crear un vacío. Los pocillos se enjuagaron con PBS para eliminar las células desplazadas y medio fresco (1% de FBS para BGC823 y libre para SGC7901 suero) se añadió. Tres imágenes aleatorias de las áreas rayadas se tomaron (ampliación × 40) sobre 0h, 12h y 24h [23].
migración y la invasión ensayos Transwell
La migración celular y la invasión fueron evaluados por Boyden modificada cámaras transwell (Corning Inc., Corning, EE.UU.), recubiertas con (la invasión) o sin (por migración) matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, EE.UU.). transfección las células y la inanición de siRNA se sembraron a la cámara superior en un medio de cultivo que contiene 1% de FBS (BGC823) o no hay FBS (SGC7901), medio que contiene 15% de FBS se añadió a la cámara inferior, las células en la cámara superior se retiraron cuidadosamente después de la incubación durante 16 horas (para la migración) o 36h (para la invasión). Las células migradas se tiñeron con 0.5μg /ml Solución de tinción DAPI (Roche, Penzberg, Alemania). El número de células se contaron al azar en cinco campos (× 400 aumentos) [24]. células invadidas se incubaron con solución de tinción de la célula (Millipore) y se fotografiaron (× 200). La mezcla de colorantes se lavó por Extraction Buffer y se transfiere a un 96 pocillos para la medición colorimétrica a 560 nm en un lector de microplacas (Thermo, Boston, EE.UU.) [25,26].
Pacientes y muestras
86 cirugía de adenocarcinoma gástrico se inscribieron entre mayo de 2007 febrero de 2008 tras la firma del consentimiento informado. Este estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital de Sir Run Run Shaw, de la Universidad de Zhejiang. Se obtuvieron tejidos tumorales emparejados y tejidos adyacentes libres de tumor. los datos clínico-patológicas de los pacientes incluyendo el género, la edad, estadios TNM y grados patológicos fueron recuperados de los registros médicos. El seguimiento se lleva a cabo en un intervalo de 1 año después de la cirugía, los antecedentes médicos se registró cuando el paciente vino para su posterior visita. El tiempo de corte de seguimiento fue de Agosto de 2012, y el tiempo medio de seguimiento fue de 35 meses (rango, 1-63 meses).
microarrays de tejidos y la tinción inmunohistoquímica
Núcleos de medición de 1,5 mm en la mayor dimensión fueron perforados de áreas no necróticas de los tejidos tumorales emparejados y tejidos adyacentes libres de tumor. diapositivas de microarrays de tejidos que contienen secciones de 4 micras de espesor de microarrays se construyeron utilizando técnicas estándar (en colaboración con Shanghai Superchip Company, Ltd., Shanghai, China). Las láminas fueron incubadas con el anticuerpo IGFBP3 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) durante la noche a 4 ° C, y después se incubó con el sistema Envision-plus de detección (Envision ™ + /HRP /Rb, Dako, Copenhagen, Dinamarca). Las secciones se desarrollaron en la solución de 3,3'-diaminobencidina bajo observación microscópica y contratinción con hematoxilina [27]. Los tejidos de cáncer de mama avanzado se tiñeron como control positivo [28]. La proporción de células positivas en cada muestra se cuantificó bajo el microscopio y se clasifica en cuatro grupos. 0: 0-5% de células positivas; 1: 6% a 50% de células positivas; 2: 51% a 75% de células positivas y 3: 76-100% de células positivas. La intensidad de la tinción IGFBP3 se calificó como sigue: ninguna tinción = 0; tinción débil = 1; tinción moderada = 2; densa tinción = 3. La puntuación de la intensidad, más la proporción de tinción positiva se definió como IGFBP3 puntuación de tinción. Una puntuación de 0-3 se considera como baja expresión y 4-9 como alta expresión.
El análisis estadístico
La expresión diferencial de IGFBP3 entre el tejido tumoral y el tejido no tumoral se determinó mediante la U de Mann-Whitney U-test. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado para analizar las relaciones entre las características clínico-patológicas y las puntuaciones de tinción IGFBP3. La probabilidad de supervivencia global se calculó con el método de Kaplan-Meier y la diferencia entre las curvas se evaluó con la prueba de log-rank. Un punto de corte de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
HoxD10 favorece la expresión de la expresión de IGFBP3
análisis
Todo el genoma revelaron que varios genes, incluyendo IGFBP3 estaban regulados. por HoxD10 en células de cáncer gástrico en nuestro estudio anterior (4). Para determinar si HoxD10 podría regular transcripcionalmente la expresión de IGFBP3 en células de cáncer gástrico, se observó el nivel de expresión de IGFBP3 después de introducir de manera estable genes HoxD10 en BGC823 y SGC7901 células, o transitoriamente derribando de HoxD10 en HGC27 células. RT-PCR y los resultados de transferencia Western mostraron consistentemente que la expresión de IGFBP3 se upregulated significativamente en células HoxD10 sobreexpresados (Figura 1A y 1B), mientras que downregulated después de silenciamiento de HoxD10 en HGC27 células (Figura 1C y 1D).
La expresión de IGFBP3 se detectó mediante RT-PCR convencional (a, C) y transferencia Western (B, D) después transfectadas con pcDNA3.1 vector vacío o pcDNA3.1-HoxD10 en BGC823 y SGC7901 células, y el control negativo siRNA (Ne -Si) o dos de HoxD10 siRNA (H-Si1 y Si2 H-) en células HGC27. GAPDH se utilizó como control interno. valores de densitometría se expresan como factor de cambio en comparación con los valores de ARNsi de control negativo normalizado a 1. vector pCDNA3.1 o (E) y BGC823 SGC7901 fueron co-transfectadas con pcDNA3.1 vector vacío o pcDNA3.1-HoxD10, pGL3-basic vector o pGL3- (pIGFBP3) -Básico y pRL-TK del vector. luciérnaga actividad relativa se expresó normalizó a la actividad de Renilla en PRL-TK del vector. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. ** Indica de p & lt; 0,01.
Una secuencia de 2,3 kb (-2.282 a +56 pb) en la región aguas arriba de IGFBP3 se clonó en el vector pGL3-básico y se utiliza para evaluar la actividad de la luciferasa por los ensayos de reportero de luciferasa dual. Los resultados demostraron que la actividad del promotor de IGFBP3 en BGC823 y SGC7901 células se mejoró en 4,2 y 3,8 respectivamente, después de pliegues co-transfectadas con pcDNA3.1-HoxD10 con relación a los transfectantes del vector pcDNA3.1 (P & lt; 0,01, Figura 1E). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que podría regular al alza HoxD10 transcripcionalmente la expresión de IGFBP3 en células de cáncer gástrico.
Identificación de las regiones reguladoras novedosos en el promotor IGFBP3 responsables de HoxD10
A continuación analizaron el potencial HoxD10 sitios en el promotor IGFBP3 unión. La secuencia aguas arriba de 2,3 kb del gen IGFBP3 se introduce en PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/), un programa para la predicción de factor de transcripción sitios en una sola secuencia o en un grupo de secuencias relacionadas de unión (17 ), y 5 sitios potenciales de unión HoxD10 (HBS1 ~ 5) se predijo (Tabla S1). Como se muestra en la figura 2A, estos cinco HBSS se localiza en -2191 ~ -2182bp (HBS1), -2111 ~ -2102bp (HBS2), -1700 ~ -1691bp (HBS3), -1418 ~ -1409bp (HBS4) y -953 ~ -944bp (HBS5) respectivamente. En estable HoxD10 sobreexpresa BGC823 y SGC7901 células, regiones de unión al promotor IGFBP3 fueron investigados por los ensayos de chip. Se identificaron que la cromatina precipitada por anticuerpos específicos HoxD10 se amplificó utilizando A2, A3 y A4 cebadores, que abarcan HBS3, HBS4 y HBS5 respectivamente, mientras que no se observó amplificación con los cebadores A1 que abarcan HBS1 y 2 (Figura 2B).
(A) Representación esquemática del promotor IGFBP3 con los posibles sitios de unión para HoxD10 (HBS1-5) y cuatro fragmentos (A1-A4) que abarcan cinco HBSS a la región promotora IGFBP3 se han diseñado para el análisis de PCR en los ensayos de chip (A1-A4). (B) HoxD10 sobreexpresa BGC823 y las células fueron SGC7901 reticulado por el formaldehído y se lisaron. Los lisados celulares se sometieron a inmunoprecipitación con un anticuerpo de conejo para HoxD10 o IgG de conejo normal. ADN genómico y ADN de entrada 2% se utilizaron como control positivo.
Para obtener más en los segmentos reguladores de promotor IGFBP3 por HoxD10, hemos clonado 2 fragmentos de ADN diferentes, que abarcan HBSI (HBS1 y 2) y HBSII (HBS3, 4 y 5), respectivamente, en SV40 reporteros promotor de luciferasa. Los resultados mostraron que la co-transfectadas con HoxD10, HBSII mejorada SV40 actividad promotora de 4,0 veces en comparación con los transfectantes de vector vacío en BGC823 células (P & lt; 0,01, Figura 3A). Por el contrario, HBSI no mostró ningún efecto significativo sobre la actividad del promotor de SV40 (figura 3A). Resultados similares se revelan en otras células SGC7901 independientes, los cambios en la actividad del promotor SV40 fueron 3,3 y 0,9 veces por HBSII y HBSI, respectivamente (Figura S1A en S1 File).
BGC823 células (A) fueron transfectadas con pcDNA3.1 vector vacío o pcDNA3.1-HoxD10, promotor pGL3 vector o pGL3-HBSI (II) -promoter y PRL-TK del vector. (B) Los diferentes oligonucleótidos que contienen secuencias mutantes silvestres o punto de HBS3, HBS4 y HBS5 se clonaron en pGL3-HBS-promotor. luciérnaga actividad relativa se expresó normalizó a la actividad de Renilla en PRL-TK del vector. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. ** Indica de p & lt; 0,01.
HBS3, 4 y 5 compartida común de unión al elemento "ttat", mientras que HBS1 o HBS2 no tienen ninguno de estos elementos. Nos hipótesis de que HoxD10 se une directamente al promotor de IGFBP3 en los sitios "ttat". Para confirmar esto, se sintetizó 10BP oligonucleótidos que contienen las secuencias de HBS3, HBS4 y HBS5 respectivamente. Como se muestra en la Figura 3B, el promotor de SV40 actividades se han mejorado por 1,8, 2,0, y 2,7 respectivamente pliegues cuando se co-transfectaron con plásmido HoxD10 en BGC823 células, mientras que los mutantes puntuales de HBS3, HBS4 y HBS5 no mostraron cambios significativos. Hemos reproducido resultados similares en SGC7901 células (Figura S1B en Archivo S1).
En conjunto, los resultados anteriores indican que IGFBP3 es un objetivo directo de HoxD10 en células de cáncer gástrico. Se identificaron tres sitios de enlaces funcionales entre -1727 ~ -943bp en el sentido ascendente del gen responsable de IGFBP3 HoxD10. HoxD10 podría unirse directamente al promotor de IGFBP3 potencialmente a través del elemento de unión Hox "ttat".
IGFBP3 está regulado por disminución en el cáncer gástrico y relacionado con el pronóstico de los pacientes
Para determinar el patrón de expresión de IGFBP3 en el cáncer gástrico, 86 pares de muestras quirúrgicas de cáncer gástrico humano y de acuerdo gástrica adyacente no canceroso se examinaron los tejidos. La intensidad de la tinción IGFBP3 se puntuó como 0 (negativo), 1 (débil), 2 (moderado) o 3 (denso), tal como se determina de forma independiente por dos patólogos (figura S2 S1 en el archivo). Los resultados mostraron que el nivel de expresión de IGFBP3 en los tejidos tumorales fue significativamente menor que en los tejidos libres de tumor adyacentes (P & lt; 0,001, Figura 4A y 4B). Además, la expresión IGFBP3 se evaluó con respecto a las características clinicopatológicas de los pacientes. IGFBP3 expresión fue significativamente menor en tumor gástrico con metástasis en los ganglios linfáticos (p = 0,045). Además, la expresión de alto IGFBP3 en los tumores de tamaño pequeño (T1 + T2, 8/12) se observó con mayor frecuencia en relación a la de las grandes (T3 + T4, 36/74), aunque con diferencias significativas (p = 0,062) . Tampoco hubo correlación significativa entre la expresión de IGFBP3 y las características clínico-patológicas incluyendo el género, la edad y el grado patológico (Tabla 1).
(A) Los niveles de expresión de IGFBP3 se detectaron por análisis de inmunoquímica en 86 pares de tumor gástrico y los tejidos normales adyacentes emparejados. fotos representativos se muestran en 3 tumor emparejado (T) y los tejidos normales (N). (B) La comparación de las puntuaciones de tinción de IGFBP3 entre tumor gástrico y los tejidos libres de tumor adyacente. curvas (C) de supervivencia se representan gráficamente en función del análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. El nivel de expresión de IGFBP3 se utilizó como la variable para separar dos líneas.
IGFBP3 inmunotinción intensidad
Clasificación clínica
Número total
baja (número)
alta (número)
p value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644<60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. El género, la edad y las características y resultados de inmunohistoquímica de muestras de tejido tumoral gástrico.
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Además, se analizó la correlación entre la expresión de IGFBP3 y la supervivencia global del cáncer gástrico pacientes. De la expresión de IGFBP3 se asoció con mayor tiempo de supervivencia en los 5 años de seguimiento (p = 0,011, de Kaplan-Meier de supervivencia Log-rank test) (Figura 4C).
Desmontables de gen IGFBP3 promueve celular de cáncer gástrico migración y la invasión
Para evaluar el papel funcional de IGFBP3 en el cáncer gástrico, se determinó la migración celular y la invasión después knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 se knockdowned selectivamente por interferencia de ARN en BGC823 y SGC7901 células (Figura 5A y 5B), que tenía un alto nivel relativo de IGFBP3 endógeno en un panel de líneas de células gástricas (Figura S3 en S1 File). Los resultados mostraron que la expresión de IGFBP3 mejora de forma significativa la migración de células, tanto en los ensayos de migración transwell (Figura 5C y 5D) y ensayo de rayado (Figura S4 en S1 File), silenciando cuando se compara con la de control negativo siRNA. Además, knockdowning IGFBP3 muestra una actividad significativamente más alta de la invasión celular en los ensayos Transwell (Figura 5E y 5F).
La expresión de IGFBP3 en BGC823 y SGC7901 células fueron detectados por RT-PCR convencional (A) y transferencia Western (B) después transfectadas con control negativo siRNA (Ne-Si) o IGFBP3 siRNA (I3-Si) . valores de densitometría se expresan como factor de cambio en comparación con los valores de ARNsi de control negativo normalizado a 1. (C) la migración celular se evaluó mediante modificado Boyden transwell ensayos de cámaras. Después de la incubación durante 16 h, las células que migraron a la parte inferior de la membrana se tiñeron con DAPI. (D) El número medio de células migratorias visibles se contaron en cinco campos de alta potencia aleatorios. Estos experimentos se realizaron por triplicado. ** Indica de p & lt; 0,01. cámaras recubiertos (E) BD Matrigel se utilizaron para evaluar la invasión de células. células invadidas en la parte inferior de la membrana se tiñeron con solución de tinción celular. (F) células invadidas se lavaron por Extraction Buffer y se detectaron en un lector de microplacas (560 nm). ** Indica de p & lt; 0,01.
IGFBP3 modula la expresión de MMP14, uPA y uPAR
Para averiguar los posibles mecanismos de cómo IGFBP3 regular la invasividad de las células de cáncer gástrico, se examinaron los niveles de ARNm de la MMP-2 /MMP7 /MMP9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, uPA y su receptor uPAR, todos los cuales son factores relacionados con la invasión, especialmente en el cáncer gástrico. Después transitoriamente transfectadas con siRNA IGFBP3 durante 72 h en BGC823 y SGC7901 células, los niveles de expresión de ARNm de MMP14, uPA y uPAR aumentado, mientras que no se observó ningún cambio significativo de MMP2, MMP7, MMP9 o TIMP1 /TIMP2 (Figura 6A). E-cadherina, ß-catenina y complejo /ß-catenina E-cadherina se extrajeron mediante diferentes lisados, sus niveles no tenían ningún cambio significativo después de silenciar IGFBP3 en BGC823 células (Figura S5 en S1 Archivo). Estos resultados indicaron que IGFBP3 inhibe la invasión de células de cáncer gástrico a través de, al menos en parte, la modulación de la expresión de MMP14, uPA y uPAR (Figura 6B).
MMPs (A) (2,7,9, 14), TIMPs (1,2), uPA y uPAR en BGC823 y SGC7901 células fueron detectados por RT-PCR convencional después transfectadas con ARNsi de control negativo (Ne-Si) o IGFBP3 siRNA (I3-Si). (B) la comprensión sistémica de las vías para la regulación HoxD10-IGFBP3 de la migración celular y la invasión de cáncer gástrico.
Discusión
Hox superfamilia son un grupo de importantes factores de transcripción que podrían regular la proliferación y diferenciación de células embronic [29,30]. Además, la expresión aberrante de Hox también juega un papel crítico en la progresión de varios tipos de cáncer [31]. Hox proteínas tienen una red de regulación aguas abajo grandes y ejercen sus funciones principalmente a través de estos genes diana [5]. análisis de todo el genoma se ha llevado a cabo para examinar los genes aguas abajo de HoxD10 durante el desarrollo de la médula espinal y en células de cáncer gástrico [4,32]. Nosotros y otros han puesto de manifiesto una IGFBP3 gen objetivo común, que se ha informado para servir como un supresor de tumores [10].
Nuestros estudios proporcionan la primera evidencia para demostrar que HoxD10 se une directamente al promotor IGFBP3 para activar la expresión de IGFBP3 en células de cáncer gástrico. HoxD10 proteína podría ser reclutado a la región promotora del gen IGFBP3 específica, lo que indica que HoxD10 podría unirse directamente al gen IGFBP3. La actividad de la luciferasa con salvaje, mientras que no mutante, HBS3, HBS4 o HBS5 se mejoró significativamente por la sobreexpresión de HoxD10, lo que sugiere que HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) y HBS5 (CTTTATTATT) eran tres sitios de unión HoxD10 funcionales en la región promotora de IGFBP3. Como era de esperar, el nivel de expresión del ARNm y la proteína IGFBP3 se upregulated por la expresión forzada de HoxD10 en diferentes líneas celulares de cáncer gástrico [4]. Los estudios han demostrado que las proteínas Hox tienen algunos elementos de unión al núcleo de consenso, incluyendo ttat, TAAT y TTAC [7]. mutación Point con "ttat" a "TTCT" o "TCTT" a "TATT" en la región promotora de IGFBP3 en el presente estudio indican que "ttat" o "TATT" son sitios de unión importantes para HoxD10. proteínas Hox podrían regular directamente el proceso de transcripción de los genes diana como monómeros o homodímeros [33]. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.