Extracto
Antecedentes y Objetivo
hipermetilación aberrante de genes relacionados con el cáncer se ha convertido en una estrategia prometedora para el desarrollo de biomarcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos en cáncer humano, incluyendo el cáncer colorrectal ( CRC). El objetivo de este estudio fue realizar un análisis sistemático e integral de un panel de genes CRC-específicos como potenciales biomarcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos en una gran cohorte CRC basado en la población.
Pacientes y métodos
el estado de metilación de los genes
SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4 y miR137
fue estudiada por bisulfito cuantitativa pirosecuenciación en una cohorte de base poblacional de 425 pacientes con CCR.
resultados
los niveles de metilación de todos los genes analizados fueron significativamente mayores en los tejidos tumorales en comparación con la mucosa normal (p & lt; 0,0001); Sin embargo, se observó con mayor frecuencia hipermetilación asociada al cáncer de
miR137 gratis (86,7%) y
IGFBP3 gratis (83%) en pacientes con CCR. El análisis de metilación usando la combinación de estos dos genes demostró mayor precisión para la identificación de tumores de colon (sensibilidad 95,5%, especificidad 90,5%). Los bajos niveles de
IGFBP3
la metilación del promotor surgieron como un factor de riesgo independiente para la predicción pobre supervivencia libre de enfermedad en estadio II y III pacientes de CRC (HR = 0,49 IC del 95%: 0,28 hasta 0,85, p = 0,01). Nuestros resultados también sugieren que la etapa II & amp; III pacientes de CRC con altos niveles de
IGFBP3
metilación no se benefician de la quimioterapia adyuvante basada en 5-FU.
Conclusión
Mediante el análisis de una cohorte de base poblacional amplia CRC, nos demostrar el potencial importancia clínica de
miR137
y
IGFBP3
hipermetilación como biomarcadores de diagnóstico prometedores en el CCR. Nuestros datos también revelaron que
IGFBP3 hiper
metilación puede servir como un biomarcador pronóstico y predictivo independiente en estadio II y III pacientes de CRC
Visto:. Pérez-Carbonell L, M Balaguer, Toiyama Y, Egoavil C, Rojas E, Guarinos C, et al. (2014)
IGFBP3
La metilación es un biomarcador de diagnóstico y predictivo Novel en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (8): e104285. doi: 10.1371 /journal.pone.0104285
Editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Abril 2014; Aceptado: 7 Julio 2014; Publicado: 15 de agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Pérez-Carbonell et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. El presente trabajo fue apoyado por la subvención R01 CA72851 y CA181572 del Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud y los fondos del Instituto de Investigación de Baylor. Lucía Pérez-Carbonell es un beneficiario de una beca post-doctoral 2012 de la Fundación Alfonso Martín Escudero. Francesc Balaguer es un beneficiario de una subvención del Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). CIBEREHD está financiado por el Instituto de Salud Carlos III. Carla Guarinos es un receptor de una subvención de la Generalitat Valenciana (Vali + D Acif /2010/018). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Ajay Goel es un PLOS ONE Miembro del Comité Editorial. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más comunes en los países occidentales, y es el segundo líder causa de muerte por cáncer en adultos [1]. La acumulación de pruebas indica que los cambios epigenéticos juegan un papel esencial en la patogénesis de la CRC. la metilación del ADN aberrante representa uno de la alteración epigenética más estudiado, y se entiende bien que los genes supresores de tumores son frecuentemente silenciados por metilación de islas CpG que comúnmente residen en las regiones 5 'de aproximadamente la mitad de todos los genes humanos [2], [3 ], [4]. silenciamiento transcripcional de los genes supresores de tumores ha surgido como un paso importante en el proceso por etapas de la carcinogénesis colorrectal. Alteraciones epigenéticas, en particular la hipermetilación del ADN, se pueden utilizar para la detección temprana de lesiones premalignas, incluyendo pólipos adenomatosos en el colon, y está presente en los tejidos no neoplásicas adyacentes a pólipos adenomatosos y cánceres en el colon [5], [6] . Además de su uso como biomarcadores de diagnóstico, los cambios epigenéticos son prometedores como determinantes del pronóstico del cáncer, así como biomarcadores de respuesta a las quimioterapias específicas [7], [8].
En el CRC, los enfoques sistemáticos de todo el genoma han identificado varios genes que muestran hipermetilación del promotor específico de tumor que potencialmente pueden transformarse en biomarcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos clínicamente relevantes. En el contexto de la CRC, varios de estos biomarcadores se han descrito recientemente como biomarcadores de diagnóstico potencialmente prometedores, entre ellos:
SEPT9 gratis (Septin 9), un miembro de la familia de septinas implicados en la citocinesis y el control del ciclo celular [9], [10], [11];
ALX4
, un factor de transcripción implicado en el cráneo y el desarrollo de las extremidades [12], [13] (Aristaless 4 similar a la proteína Homeobox);
TWIST1 gratis (torcedura homólogo 1), un factor de transcripción antiapoptótico y pro-metastásico [14], [15];
IGFBP3
, un miembro de la familia del factor de crecimiento proteína de unión similar a la insulina (factor de crecimiento similar a la insulina proteína transportadora 3) [16];
GAS7 gratis (detención del crecimiento específica 7), que desempeña un papel putativo en el desarrollo neuronal [17], [18]; y
miR137
, un microARN no codificante que está incrustado en una isla CpG [17], [19], [20], [21]. Sin embargo, hasta la fecha, ninguno de estos marcadores de metilación han sido objeto de una validación sistemática en una gran cohorte de pacientes con CRC para determinar plenamente su potencial como biomarcadores de diagnóstico, pronóstico o predictivos clínicamente útiles. Por esta razón, el objetivo de explorar el valor diagnóstico, pronóstico y predictivo de
SEPT9, TWIST1, ALX4, IGFBP3, GAS7
, y
miR137
promotor hipermetilación en un grande, bien caracterizado, basado en la población CRC cohorte. Además, se examinaron las asociaciones entre el estado de metilación de los marcadores individuales y su combinación con las características clínico-patológicos en estos CRC primarias, y por primera vez que el informe
IGFBP3
hipermetilación es un biomarcador de diagnóstico y predictivo prometedora en pacientes con CCR.
material y Métodos
los pacientes
Este estudio incluyó a 425 pacientes con CCR que fueron incluidos como parte del proyecto EPICOLON-I, que es un ensayo basado en la población de CRC como descrito anteriormente [22], [23], [24]. Dado que este estudio tuvo como objetivo determinar el potencial de pronóstico y predictivo de los biomarcadores de metilación, las muestras de los pacientes incluidos en este estudio fueron seleccionados al azar de una cohorte previamente descrita de pacientes para los que se disponía de datos de seguimiento [7], [25], [26 ]. Las características demográficas, clínicas y relacionadas con el tumor de probandos, así como una historia familiar detallada, se obtuvieron mediante un cuestionario previamente establecido [22]. características clínico-patológicas y moleculares de los pacientes incluidos en estos estudios se describen en la Tabla S1. El estudio fue aprobado por el comité de ética de todos los hospitales participantes en la cohorte EPICOLON (Hospital 12 de Octubre, Madrid, Hospital Clinic, Barcelona, el Hospital Clínico Universitario de Zaragoza, el Hospital Cristal-Piñor, Complexo Hospitalario de Ourense; Parc de Salut Mar, de barcelona, el hospital Donostia, CIBERehd, Universidad del País Vasco, San Sebastián; hospital general Universitario de Alicante, hospital general de Granollers; hospital general de Vic, del hospital general Universitario de Guadalajara y la Fundación para la Formación e Investigación Sanitarias de Murcia; hospital general Universitario de Valencia), y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente. El estado de metilación de los seis genes (
SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4
y
miR-137
) se analizó en todos los 425 pacientes con CRC, así como en la mucosa colónica normal desde 21 individuos sanos con una colonoscopia normal.
extracción de ADN y modificación con bisulfito
ADN genómico fue extraído a partir de tejido tumoral incluido en parafina (FFPE) los especímenes en el estudio EPICOLON-I. Bajo la supervisión del patólogo estudio, las secciones de tejido se examinaron cuidadosamente, regiones enriquecidas-tumorales identificados y diseccionaron cuidadosamente para la extracción de ADN. Después de la retirada de parafina por xileno, el ADN fue aislado utilizando QIAamp DNA Mini kits, según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA). El ADN genómico resultante se modificó con sodio-bisulfito usando el kit EZ metilación Gold (Zymo Research, Orange, CA).
El análisis de metilación de ADN
pirosecuenciación bisulfito se realizó para el análisis de metilación cuantitativa como anteriormente descrito (Figura S1) [7], [25], [26]. Los cebadores utilizados fueron diseñados utilizando el software de diseño PyroMark 1.0, y los ensayos de pirosecuenciación se llevaron a cabo sobre el ADN modificado con bisulfito (Tabla S2 y S1 Información). Mean metilación porcentaje para todos los sitios CpG en cada ensayo se calcula para cada gen /marcador. los valores de corte de metilación se determinaron para cada marcador en base a los niveles promedio de metilación observados en la mucosa colónica normal de individuos sanos +2 desviaciones estándar. el análisis de metilación de confirmación adicionales para
IGFBP3
también se llevó a cabo mediante un ensayo cuantitativo MSP (qMSP) para el promotor /exón 1 isla CpG utilizando los cebadores y condiciones de PCR como se describe anteriormente [27].
CpG isla methylator fenotipo (CIMP) y la inestabilidad de microsatélites (MSI) estado
el estado CIMP de las muestras de CRC de la cohorte EPICOLON-I previamente se determinó a través de pirosecuenciación bisulfito de los marcadores CIMP
CACNAG1
,
SOCS1
,
RUNX3
,
Neurog1
, y
MLH1
, como se informó anteriormente [7]. Un CRC se consideró CIMP-positivo si se metilado al menos 3/5 promotores [7]. pruebas de inestabilidad de microsatélites (MSI) se realizó utilizando marcadores BAT26 y quasimonomorphic NR24 como se describe anteriormente [28]. Los tumores fueron clasificados como MSI-positivo cuando se mutó los marcadores de papel, y se consideraron de microsatélites estables (MSS) cuando ni marcador demostró ninguna evidencia de inestabilidad genética.
BRAF mutación
Presencia de la
se detectó la mutación V600E BRAF
en muestras de CRC utilizando sondas TaqMan y un ABI Prism 7500 sistema de detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, CA), con la discriminación alélica, tal como se describe anteriormente [29]. Análisis FODA
estadística
Las variables continuas se expresan como la desviación estándar (SD) + media, mientras que las variables categóricas se citan como frecuencia o porcentajes. Se analizaron las diferencias estadísticas de las características basales entre los grupos utilizando la χ
2 test para datos categóricos, seguido de la aplicación de la corrección de Yates y la prueba de Mann-Whitney para el análisis de datos cuantitativos. Los resultados primarios de este estudio fueron la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de enfermedad (DFS). Los análisis de los resultados tanto se llevaron a cabo para toda la cohorte CRC, y por separado en el subconjunto de pacientes en estadio II y III de CRC con el fin de evaluar específicamente el efecto de estado de metilación en el pronóstico y la respuesta a la quimioterapia adyuvante. OS se definió como el tiempo desde la inscripción hasta la muerte, y DFS se definió como el tiempo desde la inscripción hasta la muerte por cualquier causa o la primera recaída. Los datos sobre la SG y SLE fueron censurados en 1100 días desde la fecha de diagnóstico de cáncer. CRC tumores se clasificaron en grupos de alto y bajo estado de metilación utilizando la curva de características de funcionamiento del receptor análisis (ROC). El análisis de Kaplan-Meier se realizó para estimar las distribuciones de SLE y la SG en fase II y III de pacientes. distribuciones de supervivencia se compararon mediante la prueba de log-rank. Un análisis multivariado para la determinación de los coeficientes de riesgo de muerte o recurrencia del tumor se realizó mediante diversas variables, incluyendo, metástasis en los ganglios linfáticos, el estadio TNM, estado MMR, el grado de diferenciación del tumor, la edad y la quimioterapia adyuvante. Otros análisis se realizaron mediante regresión de riesgos proporcionales de Cox de una manera escalonada para probar el efecto de estado de metilación de un gen /marcador dado con DFS y su interacción con la quimioterapia. Las razones de riesgo y el intervalo de confianza del 95% (IC 95%) para la muerte se calcularon utilizando modelos de supervivencia de Cox. Todos los valores p reportados son dos caras, y los valores & lt; p 0,05 se consideraron significativos. Todos los cálculos se realizaron con SPSS 10.0 o GraphPad Prism 4.0 software estadístico.
Resultados
En nuestra serie de 425 casos de CCR, la media ± desviación estándar de edad de los pacientes fue de 70,4 + -11 años, y hubo más pacientes varones que en las mujeres (252/425; 60,3%). De los 425 tumores, 117 (27,9%) se localizaron en el colon proximal, 151 (36,2%) estaban en el colon distal, y 150 (35,9%) se encuentra en el recto. Aproximadamente el 12,8% de los casos fueron estadio I, el 33,7% en estadio II, el 39,7% en estadio III y 13,7% tumores en etapa IV. Se encontró que 35/425 (8,2%) fueron los CRC MSI, 90/303 (29,7%) eran CIMP-positivo, y 21/191 (10,9%) albergaban una mutación V600E somática en el
BRAF
gen. Como era de esperar, el fenotipo CIMP-positivo se asocia con más frecuencia de MSI y la presencia de
BRAF V600E
mutación (22,3% vs. 2,3%, p & lt; 0,0001 para el fenotipo de MSI, y el 31% frente a 1,5% , p & lt; 0,0001 para la
BRAF V600E
mutación)
importancia diagnóstica de los marcadores de metilación en el CRC
los niveles de metilación de medias para cada gen en los tejidos CRC primarias fueron:. 23.8 % para
SEPT9
, el 50,5% de
TWIST1
, el 44,9% de
IGFBP3
, el 50,2% de
GAS7
, el 36,5% de
ALX4
y 35.3% para
miR137
. Como se muestra en la Figura 1, los niveles de metilación de cada gen fueron significativamente mayores en comparación con CRC mucosa normal de sujetos sanos (
p
& lt; 0,0001 a
p
& lt; 0,0005 para todas las comparaciones). Estos resultados demuestran que el cáncer-especificidad para la hipermetilación de estos genes y establecer un fundamento para su explotación como potenciales biomarcadores de diagnóstico para el CRC, teniendo en cuenta que los 6 marcadores demostraron hipermetilación en todas las etapas del CRC (Figura 2).
bisulfito resultados de pirosecuenciación para la metilación de
SEPT9 gratis (A),
TWIST1 gratis (B),
IGFBP3 gratis (C),
ALX4 gratis (D),
GAS7 gratis (e) y los genes
miR137 gratis (F) comparando la mucosa normal de los controles sanos (N-N) y los tumores primarios de pacientes con CRC.
pirosecuenciación bisulfito resultados de metilación de
SEPT9 gratis (a),
TWIST1 gratis (b),
IGFBP3 gratis (c),
alx4 gratis (d),
gas7
(e) y
mir137
(f) la comparación de mucosa normal de pacientes sanos (nn) y los tumores primarios de pacientes con CRC de todos los estadios TNM I-IV. n (número de sujetos); mediana de metilación (%).
Con el fin de evaluar el desempeño de cada marcador de metilación de forma individual para el diagnóstico de CRC, los resultados de metilación se analizaron como una variable categórica. En consecuencia, cada gen se clasificó como metilado cuando los niveles de metilación medias fueron superiores a 7.1% para
SEPT9
, el 35,7% de
TWIST
, el 27,5% de
IGFBP3
, el 53,5%
GAS7
, el 28,5% de
ALX4
, y el 11,9% para
miR137
. En base a estos análisis, los marcadores más frecuentemente metilados en los tejidos CRC fueron los
miR-137
gen (302/344, 87,7%), seguido por
IGFBP3 gratis (289/348, 83% ),
TWIST1 gratis (269/356, 75,6%),
SEPT9 gratis (244/346, 70,5%),
ALX4 gratis (214/350, 61,1%), y
GAS7 gratis (164/378, 43,3%). A fin de evaluar si una combinación de marcadores mejoraría aún más la precisión diagnóstica del ensayo, se analizaron los paneles combinación de marcadores y encontramos que el
miR137
+
IGFBP3
combinación produjo una precisión diagnóstica del 86% , seguido por
TWIST1
+
IGFBP3 gratis (82,7%) y
TWIST1
+
miR137 gratis (78,5%). Además, hemos encontrado que la combinación de
miR137
+
IGFBP3
+ TWIST1 metilación tuvo la mayor precisión diagnóstica, el 92%, como se muestra en la Tabla 1.
características clínico-patológicas asociadas con biomarcadores de metilación
a continuación se investigó la relación entre las diversas características clínico-patológicas y moleculares y su asociación con la metilación aberrante de los seis genes analizados en este estudio. Las variables clínico incluyen la edad, el género, la estadificación TNM y la localización del tumor, y los factores moleculares incluyen el estado MMR, fenotipo CIMP y el
BRAF
estado mutacional. localización del tumor y estadios TNM no se asociaron con el estado de metilación de cualquiera de los marcadores de genes. Curiosamente,
SEPT9
metilación se asoció significativamente con el sexo masculino (p & lt; 0,05; Tabla S3). Cuando la metilación se analizó como una variable continua, se observó una tendencia para una mayor metilación de
TWIST1
,
IGFBP3, ALX4
, y
GAS7 gratis (p & lt; 0,05) y mayores pacientes con CCR; Sin embargo, no hemos encontrado una correlación positiva entre la metilación normal de la mucosa del colon en estos genes y la edad en individuos sanos. (Figuras 3 y 4 amp;)
En cuanto a las asociaciones moleculares,
TWIST1
niveles de metilación fueron más altos en comparación con MSS MSI CRCs (51% vs 40,3%; p & lt; 0,05) (Tabla 2). La metilación de cuatro genes,
ALX4, IGFBP3, GAS7
, y
miR137
, se correlacionó significativamente con CIMP-positivo tumores (p & lt; 0,001). Por otra parte, como se muestra en la Tabla 2, los CRC con
ALX4
y
IGFBP3
metilación se asociaron con mayor frecuencia con una somática
BRAF V600E
mutación (13,5% frente a 1,8%, p & lt; 0,05 para
ALX4
, y el 12,4% frente al 0%, p & lt; 0,05 para
IGBFP3
) guía empresas
hipermetilación aberrante de genes y su influencia en. CRC pronóstico del paciente
la mediana de seguimiento de la serie de 425 pacientes incluidos en este estudio fue de 1268 días (3,4 años, rango 0-2204 días). Al final del período de seguimiento, 169 pacientes habían muerto (39,7%), y la mediana de seguimiento de este grupo fue de 671 ± 513 días (1,8 ± 1,4 años). La información relativa a la causa de la muerte fue disponible en 99 pacientes; 67,7% (67/99) murió debido a las complicaciones de la progresión tumoral, el 18,2% (18/99) murió debido a complicaciones de la quimioterapia, y el 14,1% (14/99) sucumbió a la muerte por otras causas, incluidas las complicaciones post-operatorias. Se observó recurrencia tumoral en pacientes 116/370 (31,3%), con una duración mediana de tiempo de 644 ± 448 días (1,7 ± 1,2 años) después de la cirugía.
Para determinar el significado pronóstico del estado de metilación de cada gen, todos los CRC se clasificaron en dos grupos en función de sus niveles de metilación (alta versus baja), y la relación dosis-respuesta entre el grado de metilación y la supervivencia libre de eventos fue examinado por análisis de la curva ROC. En general, los altos niveles de metilación de la
GAS7 gratis (valor de corte pronóstico = 52.62%; metilación de alta: 43,3%, bajo la metilación: 56,7%; χ
2 p = 0,03) y
ALX4
genes (valor de corte pronóstico = 25,8%; metilación de alta: 67,1%, bajo metilación: 32,9%; χ
2 p = 0,005) asociada a la mala DFS en pacientes con CCR (datos no mostrado). En contraste, los niveles bajos de
IGFBP3
metilación demostraron una asociación con una cantidad significativamente peores DFS según el análisis no ajustado (valor de corte pronóstico = 53,1%; metilación de alta: 30,9%, bajo metilación: 69,1%; χ
2 p = 0,01; Figuras 5A y B). Tras el análisis de regresión de Cox, donde se analizaron múltiples variables, sólo los bajos niveles de
IGFBP3
metilación surgió como un factor de riesgo independiente de mal DFS en fase II y III pacientes de CRC (HR = 0,49; IC del 95%: 0.28- 0,85, p & lt; 0,01). Por otra parte, el estado de metilación de la
IGFBP3
gen era el único factor de riesgo estadísticamente significativo para la etapa II CRC, después del ajuste para otros factores de pronóstico, tales como la edad, el adyuvante con 5-FU (5-fluorouracilo) quimioterapia o estado de MSI (HR = 0,28; IC del 95%: 0,12 a 0,70, p = 0,006, Tabla 3)
(a) la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con estadio II y III CRC, según
IGFBP3
estado de metilación (alta metilación, n = 73, (30,3%) baja metilación, n = 168, (69,7%). (b) la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con enfermedad en estadio II, según
IGFBP3
metilación (alta metilación, n = 45, (32,4%);. baja metilación, n = 94, (67,6%) (c) supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con estadio II y III de la enfermedad, en la escuela
IGFBP3
tumores de metilación basado en la quimioterapia adyuvante (quimioterapia, n = 20, (22,5%);. ninguna quimioterapia, n = 69, (77,5%) (d) la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con estadio II y III de la enfermedad, en baja
IGFBP3
tumores de metilación de acuerdo a la quimioterapia adyuvante (Chemotherapyc n = 83, (52,7%); NO quimioterapia, n = 74, (47,2%).
aberrante hipermetilación de genes y su influencia en la supervivencia del paciente después del tratamiento de quimioterapia
El tratamiento quimioterapéutico fue dado a 257/425 pacientes (60,5%), principalmente utilizando 5FU + leucovorina (236; 91,8% de los pacientes). Entre toda la cohorte, 315 pacientes (74,1%) tenían o bien una etapa II o III de la enfermedad, y 155 (49,2%) de ellos recibieron quimioterapia adyuvante basada en 5-FU. Sólo el 9 etapas II y III los pacientes recibieron otros tratamientos quimioterapéuticos, y se excluyeron del análisis adicional. Después de una mediana de seguimiento de 1221 días (3,3 años), 92 (31,2%) pacientes con estadio II y III, se observó recurrencia del tumor, y para el final del período de seguimiento, 101 (34,2%) de los pacientes de estos grupos tenían murió
la quimioterapia adyuvante proporciona una mejora significativa en la SG en pacientes en estadio II y III del CRC en comparación con los pacientes que no recibieron quimioterapia (quimioterapia: 49.1%, sin quimioterapia:. 50,9%; χ
2 p = 0,0001). Estas diferencias en el sistema operativo también estuvieron presentes en el análisis multivariado que controló la edad, el sexo, la metástasis de los ganglios linfáticos, MMR, y el estado fenotipo CIMP. (HR = 0,55 IC del 95%: 0,36 a 0,85; p = 0,007)
Curiosamente, entre los 6 marcadores de metilación investigados, sólo el
IGFBP3
los niveles de metilación fueron predictivos de la respuesta a la quimioterapia con 5-FU. De acuerdo con nuestros resultados, los pacientes con baja
IGFBP3
los niveles de metilación tenían ya OS (p = 0,0007) y DFS (p = 0,05) cuando recibieron quimioterapia. Por el contrario, en pacientes con alto
IGFBP3
metilación, la quimioterapia adyuvante no mejoró OS (p = 0,4) o DFS (p = 0,3; Figura 5C y D). Utilizando el análisis multivariado de regresión de Cox (tabla 4), en pacientes con baja
IGFBP3
metilación, la quimioterapia adyuvante predecían de forma independiente una mejor SG (HR = 0,49; IC del 95%: 0,29 a 0,80; p = 0,004); sin embargo, no influyó significativamente en la SSE (p = 0,08). Por otro lado, el estado de MMR fue la única variable que predijo independientemente OS (p = 0,05) y DFS (p = 0,04) en pacientes con alto
IGFBP3
metilación (Tabla 4). En la cohorte de pacientes tratados con 5-FU quimioterapia adyuvante,
IGFBP3
estado de metilación no predijeron de forma independiente del sistema operativo y DFS. Por el contrario, la SSE fue afectada positivamente por
IGFBP3
estado de metilación en los pacientes que no recibieron quimioterapia adyuvante. (HR = 0,41 IC del 95%: 0,18 a 0,91; p = 0,02) guía empresas
Discusión
En los últimos años, un número de prometer la metilación de genes basado en los biomarcadores de diagnóstico que incluyen
SEPT9, TWIST 1, IGFBP3, GAS7, ALX4
, y
miR137
se han propuesto para la detección precoz de la neoplasia colorrectal. Sin embargo, la mayoría de estos marcadores se han limitado a estudios iniciales de descubrimiento de pequeña escala, y no se han desarrollado en la práctica clínica, ya que no se han validado de forma sistemática en grandes cohortes independientes de pacientes con CRC. En vista de esta brecha en el conocimiento, se diseñó este estudio para confirmar el potencial diagnóstico de estos biomarcadores, y para determinar sus valores pronósticos y predictivos en el CCR. Además, estábamos interesados en examinar la asociación entre la hipermetilación aberrante de estos genes y las características clínico mediante el análisis de un bien caracterizado cohorte poblacional grande, de pacientes con CRC.
Sobre la base de nuestro análisis de metilación cuantitativa, todos seis genes interrogó cumplen los criterios para el uso clínico potencial como biomarcadores de diagnóstico de CCR. Estos criterios incluyen: a) la metilación de cada gen se produjo de una manera específica de tumor; b) los niveles de metilación de cada gen en los tejidos neoplásicos fueron significativamente mayores que en mucosa colónica normal; y c) ninguno de los genes mostraron un aumento dependiente de la edad en la metilación del ADN en la mucosa colónica normal [30], [31]. los niveles de metilación de cada gen nos permitió clasificar los tejidos colorrectales como normales o neoplásicas. Entre todos los marcadores investigados,
IGFBP3
y
miR137
los niveles de metilación mostraron la mayor precisión diagnóstica como marcadores de genes individuales para la identificación de los CRC primarios (83% y 78,3%, respectivamente). Esta precisión de diagnóstico ha mejorado aún más mediante la combinación del estado de metilación de dos marcadores de genes; en particular, el estado de metilación de
IGFBP3 + TWIST1
o
IGFBP3
+
miR137
tenían los más altos valores de precisión de 86% y 82,7%, respectivamente, con valores de sensibilidad y especificidad & gt; 80%.
Se investigaron las características moleculares asociados a los niveles de metilación tumoral de estos genes. Esto fue de particular interés como la clasificación molecular basado en MSI y el estado CIMP se ha convertido cada vez más importante [32] para su pronóstico [33], [34], [35] y el papel predictivo en pacientes con CRC [7], [34], [ ,,,0],36]. En este estudio, cuatro de los seis genes se asociaron positivamente con el fenotipo CIMP (
ALX4, IGFBP3, GAS7
, y
miR137
). Por otra parte, una correlación positiva entre la
BRAF V600E
mutación y la metilación del
ALX4
y
IGFBP3
genes se asoció con CIMP-alta en el CCR [37], [38] . Como era de esperar, la metilación del
ALX4
y
IGFBP3
genes se asoció con la presencia de la
BRAF
mutación genética.
TWIST1
los niveles de metilación fueron mayores en pacientes con tumores triple vírica con dominio en comparación con los tumores MSI; Sin embargo, en nuestra cohorte, sólo una pequeña proporción de los CCR eran deficientes de MMR (5%), y las correlaciones entre el estado de metilación y marcadores MMR se pueden haber perdido al analizar el grupo en su conjunto.
En el estadio pacientes II y III CRC sometidos a resección potencialmente curativa, el pronóstico depende de la recurrencia de la enfermedad, que se asocia principalmente con metástasis a distancia. Además, el beneficio de la quimioterapia adyuvante, especialmente para los pacientes en estadio II CRC ha seguido siendo un área de controversia y resistencia a la quimioterapia sigue siendo un problema importante en estos pacientes. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevos biomarcadores de pronóstico y de predicción que puede ayudar a identificar la etapa II y III los pacientes que están en alto riesgo de recurrencia y metástasis, puede mejorar la estrategia actual de CRC estratificación de los pacientes y la gestión de la terapia. A lo mejor de nuestro conocimiento, ningún estudio previo ha examinado la relación entre la metilación del
SEPT9, IGFBP3, TWIST1, GAS7, ALX4
, y
miR137
genes con el pronóstico en pacientes con CCR, así como la capacidad de estos biomarcadores para predecir la respuesta a la quimioterapia adyuvante a base de 5-FU. Sobre la base de nuestros resultados en esta gran cohorte de base poblacional, bien caracterizado, etapa II y III CRC pacientes con bajos niveles de
IGFBP3
la metilación del promotor tuvieron una SG más baja y DFS en comparación con aquellos con altos niveles de hipermetilación del ADN. En cuanto a la respuesta a la quimioterapia, la quimioterapia adyuvante basada en 5-FU se administró a la Fase II y III CRC pacientes, sólo aquellos pacientes con niveles bajos de
IGFBP3
tumores -methylated se vieron afectados positivamente, lo que resulta en más tiempo y DFS veces OS, lo que indica que el beneficio de la quimioterapia se limitó a este grupo de pacientes con CRC. Curiosamente, este efecto de
IGFBP3
metilación fue independiente de la CIMP. Sin embargo, es importante señalar que a pesar de
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estado de metilación emergió como el único factor independiente que predice la probabilidad pobres DFS entre los pacientes en estadio II CRC, se requieren estudios clínicos independientes adicionales para demostrar que
IGFBP3
los niveles de metilación en el CCR podría representar un potencial de prueba de rutina para el pronóstico de los pacientes con CRC, y en la mejora de la gestión de los pacientes con enfermedad localizada en combinación con herramientas clínico-patológicos y moleculares actuales.
Otros estudios han observado una relación entre el alto niveles de
IGFBP3
metilación y los pobres resultados clínicos en el pulmón y el cáncer de ovario [39], [40], y más recientemente en pacientes con CRC [27]. informes discrepantes utilizando marcadores de metilación puede ser debido a la utilización de diferentes metodologías y el análisis de diferentes lugares de secuencia dentro de las islas CpG. En este estudio, hemos utilizado pirosecuenciación bisulfito para el análisis de metilación, que es un enfoque cuantitativo fiable para sólido análisis de la metilación del ADN en comparación con la metilación convencional PCR específica (MSP), que carece de la cuantificación proporcionada por pirosecuenciación bisulfato de [27], [39], [40]. Además, para garantizar aún más la precisión de los resultados de metilación, también llevamos a cabo un análisis cuantitativo-MSP (qMSP) dentro de la región de las islas CpG ya examinada en el CCR [41]. Como se muestra en la Figura 6, se confirmó que los resultados de metilación pirosecuenciación bisulfito se correlacionaron positivamente con los resultados obtenidos dentro de la región de las islas CpG estudiado previamente [27], [39], [40].
(a) Esquema visión general del factor de crecimiento similar a la insulina gen de la proteína 3 (IGFBP3) de unión. exones se representan mediante cuadros de color azul, intrones con líneas azules, y la región del promotor mediante líneas azules discontinuas. la
IGFBP3
gen tiene uno-fosfato-guanina citosina isla (CPG) en en la región promotora y exon1 que subraya el potencial de modular la expresión de genes por medio de la hipermetilación CPG, y esto está representado por una caja verde. hemos realizado dos ensayos diferentes que cubren ambas islas GPC (indicados por flechas verdes) utilizando dos métodos cuantitativos: pirosecuenciación y qmsp el fin de correlacionar los niveles de metilación de estas dos ubicaciones. (B) Análisis de regresión lineal comparando
IGFBP3
los niveles de metilación por pirosecuenciación (% de metilación) en 348 muestras de pacientes y ensayos qmsp (PMR) en los tejidos CRC (n = 197).
Aunque hay algunas diferencias entre este estudio y estudios publicados anteriormente, creemos que este trabajo es más sólida y completa, como la nuestra emplea la mayor cohorte de pacientes, es basado en la población, e incluye un grupo control de pacientes no tratados CRC para la comparación. El papel biológico y el momento de
IGFBP3
metilación en el CCR es poco conocida;