Extracto
La interleucina-26 (IL-26) es una de las citoquinas secretadas por células Th17, cuyo papel en los tumores humanos sigue siendo desconocido. A continuación, se determinó la expresión y el papel potencial de la IL-26 en el cáncer gástrico humano (GC). La expresión de IL-26 y moléculas relacionadas, tales como IL-20R1, STAT1 y STAT3 se examinó mediante PCR en tiempo real y inmunohistoquímica. Los efectos de la IL-26 sobre la proliferación celular y la apoptosis inducida por cisplatino se analizaron mediante el ensayo de cooperación BrdU y PI-Anexina V co-tinción, respectivamente. siRNA mediada Lentiviral fue utilizado para explorar su mecanismo de acción, y la señalización relacionada IL-26 se analizó por Western Blot. GC tejidos humanos mostraron un aumento de los niveles de IL-26 y sus moléculas relacionadas y la activación de la señalización de STAT3, mientras que la activación de STAT1 no difirió significativamente entre GC y tejidos gástricos normales. Por otra parte, IL-26 se produce principalmente por las células Th17 y NK. IL-26 promueve la proliferación y la supervivencia de MKN45 y células de cáncer gástrico SGC-7901 de una manera dependiente de la dosis. Además, IL-20R2 e IL-10R1, que son dos receptores esenciales para IL-26 de señalización, se expresaron en ambas líneas celulares. IL-26 activan STAT1 y STAT3 señalización; sin embargo, la regulación positiva de la expresión de Bcl-2, Bcl-XL y c-myc indicó que el efecto de la IL-26 está mediada por la activación de STAT3. Desmontables de STAT1 y STAT3 expresión sugiere que los efectos proliferativos y anti-apoptóticos de la IL-26 están mediados por la modulación de la activación /STAT3 STAT1. En resumen, los niveles elevados de IL-26 en GC humana promueven la proliferación y la supervivencia mediante la modulación de la señalización de STAT1 /STAT3
Visto:. Usted W, Tang Q, Zhang C, Wu J, Gu C, Wu Z, et Alabama. (2013) IL-26 promueve la proliferación y supervivencia de las células del cáncer gástrico humano mediante la regulación del equilibrio de STAT1 y STAT3 activación. PLoS ONE 8 (5): e63588. doi: 10.1371 /journal.pone.0063588
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Octubre, 2012; Aceptado: April 2, 2013; Publicado: 21 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Usted et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (81170415 para XC) y el Programa de Talentos clave Provincial de la provincia de Jiangsu (RC2011079 de QT y RC2007056 para XC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es la segunda causa más común de muerte por cáncer en el mundo. GC es difícil de curar incluso en los países occidentales, ya que a menudo no se detecta hasta las etapas avanzadas de la enfermedad [1]. Aunque un número de factores están asociados con el desarrollo y la progresión de la GC, una relación entre la inflamación gástrica crónica como la gastritis atrófica inducida por Helicobacter pylori y el riesgo de GC se ha hecho evidente en los últimos años [2]. La inflamación crónica que conduce a GC es un proceso largo y complicado que se produce durante muchos años y se caracteriza por el daño inflamatorio a la proliferación de la mucosa gástrica, la síntesis de ADN inducida por citoquinas y células, hiperplasia y la carcinogénesis [3].
La asociación entre la inflamación crónica y el sistema inmune ha sido bien estudiado, y los linfocitos son los principales mediadores de la inflamación carcinogénesis-promovido [4]. células Th17 son un nuevo tipo de linfocitos T que expresan RORγT y secretan varias citoquinas, incluyendo IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22 e IL-26. La diferenciación de las células Th17 está regulado por varias citoquinas, incluyendo IL-1β, IL-6, IL-23, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la transformación del factor de crecimiento beta (TGF-β) [5], [6] . Los estudios clínicos recientes mostraron que las células Th17 pueden estar estrechamente relacionados con la patología asociada a H. pylori y la carcinogénesis de GC [7], [8], [9], [10]. Aunque varias citocinas relacionadas Th17 se han estudiado, se sabe poco acerca de la interleucina-26 (IL-26) en relación con los tumores gástricos.
IL-26 es una proteína secretada que funciona o bien como un monómero o un homodímero. Fue descrito originalmente por Knappe et al. [11] con el nombre de AK155. IL-26 tiene débil pero significativa homología de secuencia con IL-10, y por lo tanto su proteína codificada es un miembro de la familia IL-10 de citoquinas, que en su mayoría pertenecen a la familia de citoquinas de clase 2. IL-26 puede ser secretada por las células T primarias, células NK y clones de células T y es generalmente co-expresado con otras importantes citoquinas relacionadas con IL-10, tales como IL-22 [12], [13]. IL-26 se une a un complejo receptor de superficie celular distinta que consta de las cadenas de IL-20R1 e IL-10R2, y sus actividades funcionales son diferentes de aquellas mediadas por la IL-10. funciones de IL-20R1 como la cadena de unión a ligando específico para IL-26 e IL-10R2 es una segunda cadena esencial para completar el montaje del complejo receptor activo. Los anticuerpos neutralizantes contra de cualquiera de las cadenas de IL-10R2 IL-20R1 o puede bloquear la inducción de IL-26 de señalización [12]. Una vez ensamblado, el complejo receptor experimenta un cambio (s) conformacional que induce la activación de las tirosina quinasas Janus asociadas al receptor, Jak1 y Tyk2, y posterior acoplamiento transitorio y la fosforilación de las proteínas STAT, STAT1 y STAT3 [14], [15 ].
como una citoquina relacionada Th17, el papel de la IL-26 en los tumores no se ha investigado. A continuación, se analizó la posible participación de IL-26 en GC humana por primera vez y exploramos su favor de la supervivencia y efectos proliferativos
in vitro
.
Materiales y Métodos
los pacientes
el presente estudio incluyó a 60 pacientes con GC que se sometieron a cirugía de 2006 a 2009 en el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Nanjing, Nanjing, provincia de Jiangsu (Tabla 1). Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. consentimiento informado por escrito para la expresión de genes análisis en los tejidos se obtuvieron de todos los pacientes antes de la cirugía o el examen endoscópico. Los procedimientos de protocolo y el consentimiento de estudio fueron aprobados por el comité de ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing. El diagnóstico y la estadificación del cáncer gástrico se realizó de acuerdo a la AJCC (TNM) Sistema de estadificación.
Cuantitativo PCR en tiempo real
Transcripción reversa reacciones se realizaron con el superíndice primer capítulo Sistema de síntesis (Invitrogen, CA) después del tratamiento de las plantillas de ARN con ADNasa I para evitar la contaminación de ADN genómico. Para determinar el nivel relativo de ADNc en las muestras a transcripción inversa, PCR en tiempo real se realizó con el Roche LightCycler480 (Roche Diagnostics IN, EE.UU.) utilizando cebadores para la IL-26 de la siguiente manera: adelante, AAGCAACGATTCCAGAAGACC y marcha atrás, AAGTCCTCCACAAAGCGTATTTT, con una amplificada longitud de 175 pb. GAPDH se utilizó como control con los siguientes cebadores: adelante, AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC; revertir, GGGGTCATTGATGGCAACAATA; longitud amplificada, de 102 pb. La reacción de PCR en tiempo real se realizó de acuerdo a las instrucciones incluidas en el kit SYBR Premezcla Ex Taq ™ (Takara, Japón). Los datos se normalizaron a los niveles de GAPDH en las muestras.
ELISA
IL-26 concentración en el suero de pacientes GC y controles sanos se midió usando kits de ELISA sándwich comercialmente disponible (Biotang Inc., MA).
Análisis de Western Blot
Las proteínas se extrajeron de MKN45, SGC7901 y su STAT1 y STAT3 ARNsi modificado líneas celulares, y se cuantificó usando un ensayo de proteínas (Bio-Rad Laboratories, CA). Las muestras de proteína (30 mg) se fraccionaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La inmunotransferencia se realizó usando anticuerpos contra IL-26, IL-20R1, IL-10R2, p-STAT3 (S727), STAT3, p-STAT1 (Y701), STAT1, Bcl-2, Bcl-XL, c-Myc y α- tubulina (todo adquirido de Abcam, MN). Los resultados se visualizaron con un sistema de detección de quimioluminiscencia (Pierce ECL sustrato Western blot sistema de detección, Thermo Scientific, IL) y la exposición a la autorradiografía película (película Kodak XAR).
La inmunohistoquímica (IHC)
Los tejidos se recogieron y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C, se procesan y se cortan en 5 micras de grosor. La tinción inmunohistoquímica de las secciones se realizó con los anticuerpos contra IL-26, IL-20R1, las técnicas de p-STAT3 (S727), y p-STAT1 (Y701) utilizando describió anteriormente [16].
BrdU Ensayo de proliferación celular
Las células cultivadas se sembraron a una densidad de 1 x 10 placas
4 células /pocillo en 96 pocillos. La proliferación de las células a los 0, 12, 24, 48, 60 y 72 h se evaluó usando el kit de ensayo de proliferación de células BrdU. Se añadió solución de BrdU (Tecnología de Señalización Celular, MA) a cada pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para 12 h. La tasa de proliferación de las células se determinó midiendo la absorbancia a 450 nm usando un ordenador controlado microplaca-lector.
Aislamiento y cultivo de GC humana infiltrada Leucocitos
tejidos tumorales frescos se lavaron dos veces en RPMI 1640 . Fatty, se eliminó, y el tejido necrótico conectivo. Los tejidos se desmenuzaron en trozos de 1-2 mm en RPMI 1640, se transfirió a 15 o tubos cónicos de 50 ml, y se incubaron con medio de digestión de triple enzima que contiene la ADNasa (30 U /ml), hialuronidasa (0,1 mg /ml), y la colagenasa (1 mg /ml) durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave. Los tejidos se resuspendieron en 10 ml de RPMI 1640 y se filtró a través de un filtro de células de 70 mm (BD Pharmigen). Las células atrapadas por el filtro se colocaron en pocillos individuales que contienen 1 ml de medio de crecimiento de células T en una placa de 24 pocillos para su posterior detección mediante citometría de flujo.
Th17 y NK de aislamiento de células, la estimulación, y Análisis de citometría de flujo células
Th17 se obtuvieron por
in vitro
estimulación de las células CD4 positivas mononucleares de sangre periférica (PBMCs), que se aislaron por citometría de flujo en las condiciones (20 ng /ml de IL-1β, 20 ng /ml de IL-6, 20 ng /ml IL-23, 5 ng /ml de TGF-β, 5 mg /ml anti-IL-12, y 5 mg /ml anti-IL-4) se ha descrito previamente [17]. Se obtuvieron células NK utilizando un kit de aislamiento de células NK comprado a Miltenyi Biotec (Cat. 130-092-657). Th17 y células NK se mantuvieron
in vitro
y estimulado por 100 ng /ml de LPS y
H. pylori
lisados, respectivamente, y se analizaron mediante tinción intracelular de citoquinas
.
Para la tinción intracelular de citoquinas, las células se estimularon a 37 ° C durante 5 h con un cóctel de leucocitos de activación (BD Pharmingen). Las células fueron teñidas con los marcadores de superficie, se fijaron y se permeabilizaron con IntraPre Reactivo (Beckman Coulter), y finalmente se tiñeron con marcadores intracelulares. Los datos fueron adquiridos en un FACSVantage SE y se analizaron con el software CellQuest. mAbs conjugados con fluorocromo contra IL-26, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56 y RORγT se compraron de BD Pharmingen.
cisplatino Induced Apoptosis y análisis citométrico de flujo
Las células analizadas fueron cultivadas en medio completo con 1 mg /ml de cisplatino durante 24 h. Las células se analizaron por citometría de flujo (FACSCalibur ™, BD Biosciences, NJ). Utilizando un kit de tinción PI /Anexina (BD Biosciences)
siRNA Diseño y Producción Lentivirus y la transducción de
Los siRNAs dirigidos STAT1 y STAT3 fueron diseñados y sintetizados por Genscript Co. (Nanjing, china) como sigue: siRNA dirigidos STAT1, GGACAAGGTTATGTGTATA; y siRNA dirigidos STAT3, GGACATCAGCGGTAAGACC. Los siRNAs sintetizados se subclonaron en el vector lentiviral pLL3.7 por
Hapi
y
XhoI gratis (New England Biolabs, Reino Unido) junto con el control de siRNA y con nombre pLL3.7-CS, pLL3. 7-STAT1-siRNA y pLL3.7-STAT3-siRNA. lentivirus recombinante se genera a partir de células 293T [16]. Las líneas celulares de GC humano MKN45 y SGC7901 se adquirieron de Kaiji Biotech Co (Nanjing, China) y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal de ternero, 100 U /ml de penicilina y estreptomicina 100 U /ml (Gibco , CA), y transducidas con lentivirus utilizando polibreno (8 mg /ml).
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Las comparaciones entre grupos se realizaron con la prueba de Mann-Whitney. La correlación de la expresión de IL-26 y diversas características clínicas se analizó mediante la prueba de Chi-cuadrado. Los valores de p & lt; 0,05 se consideraron como estadísticamente significativa
1.. La activación de la IL-26 y STAT3 señalización relacionada aumentado en el cáncer gástrico humano
expresión
IL-26 en el cáncer gástrico humano se examinó en 60 tejidos tumorales frescos y tejidos normales del estómago adyacentes apareados de 60 pacientes con cáncer gástrico. En tiempo real el análisis de PCR mostró significativa sobre-expresión de IL-26 ARNm en GC humana en comparación con los tejidos normales gástricas (p = 0,004, Mann-Whitney U test) (Figura 1A). Séricos de IL-26 niveles fueron significativamente mayores en los pacientes GC que en los controles sanos (P = 0,0064, por Mann-Whitney U test) (Figura 1B). Además, el análisis de expresión de la proteína IL-26 en 60 muestras de tejido embebidas en parafina mostró expresión positiva en 47 muestras de GC, y débilmente positivo (n = 14) o negativo (n = 46) de expresión en los tejidos normales adyacentes. Las células positivas IL-26 se encuentran principalmente en los tejidos no parenquimatosas, que pueden consistir de las células inmunes que infiltran los alrededores y en cáncer o en los tejidos gástricos normales. Además, la cuantificación de los resultados de la tinción IHC con Image-Pro Plus (ver 5.0) en cinco campos aleatorios por portaobjetos mostró que la IL-26 expresión fue significativamente mayor en los tejidos de GC que en los tejidos normales adyacentes (P = 0,0087, por Mann-Whitney U prueba). Detección y cuantificación de la expresión de IL-20R1, un receptor de IL-26, demostraron que se expresó en niveles significativamente más altos en GC humana que en los tejidos normales (p = 0,0041, por la prueba de Mann-Whitney U). El estado de activación de STAT1 y STAT3, que son importantes factores de señalización corriente abajo de la IL-26, fue investigado por inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos contra los residuos fosforilados. Se detectó un aumento significativo de p-STAT3 (S727) en los tejidos de GC, mientras que (Y701) los niveles no hay diferencias estadísticamente significativas en p-STAT1 se detectaron entre los tejidos humanos GC y tejidos normales (p = 0,0094 para STAT3 y P = 0,392 para STAT1 , por Mann-Whitney U) (Figura 1C, D)
a:. IL-26 de expresión de mRNA en el cáncer gástrico humano (GC) (n = 60) y los tejidos normales adyacentes (n = 60) detecta por PCR en tiempo real. Los datos de A representan mRNA expresión relativa a la de GAPDH, expresados como la media ± SD. B: Detección de IL-26 en suero humano de los controles sanos (n = 30) y pacientes GC (n = 60) por ELISA. C: imagen representativa de la expresión y distribución de IL-26, IL-20R1 p-STAT3 (S727) y p-STAT1 (Y701) en los tejidos humanos GC, los tejidos normales del estómago y los controles negativos teñidas con IgG de isotipo. Las micrografías a mayor aumento muestran la localización específica de los diferentes marcadores. D. media densidad óptica integrada (IOD) se obtuvo mediante el análisis de cinco campos de cada diapositiva evaluadas por la imagen-Pro Plus software (ver5.0) para IHC tinción de IL-26, p-STAT3 (S727) IL-20R1 y p- STAT1 (Y701) en GC humana y tejidos gástricos normales. Los análisis estadísticos en las figuras A, B y D se realizaron con la prueba de Mann-Whitney.
El análisis de la correlación entre la IL-26 expresión y características clínico mostraron una asociación estadísticamente significativa entre la IL-26 expresión y el tamaño del tumor y
H. pylori
infección (Tabla 1).
2. Th17 y NK Las células son las principales fuentes celulares de IL-26 en el cáncer gástrico humano
Las fuentes celulares de IL-26 son células T primarias, células asesinas naturales (NK) y clones de células T después de la estimulación con antígenos específicos o lectinas mitogénicas [14]. Por lo tanto, para definir la fuente de IL-26 en GC humana, los leucocitos infiltrantes de tumor (TIL) se aislaron a partir de 20 muestras de tejido GC humanos frescos y co-teñidas con diferentes marcadores. IL-26 expresión fue significativamente mayor en las células positivas CD3 (células T) de TIL GC humanos que en las células T derivadas de células de sangre periférica de mono-nuclear (PBMCs) (16,52 ± 9,32% para T-TIL vs. 3,78 ± 2,91% para T-PBMCs, P & lt; 0,0001), que fue consistente con los resultados de PCR en tiempo real y IHC (Figura 2a1, a2). Entre el número total de células T, 13,5 ± 3,71% de las células T CD4 positivas expresa IL-26, mientras que sólo 3,21 ± 2,61% de las células T CD8 fueron positivas para IL-26 (Figura 2A3, a4). Además, co-tinción de IL-26 con CD4 y RORγt, un marcador de las células Th17, se observó, con 53,21 ± 16,82% de las células Th17 que expresa IL-26 en muestras de cáncer gástrico humano (Figura 2A5, a6). La expresión de IL-26 en las células NK, otra informado con frecuencia fuente celular de IL-26, se analizó midiendo el número de CD3, CD16 +, CD56 + células co-tinción con IL-26, que mostró que 43,81 ± 19,44% de el total de células NK secretan IL-26 (Figura 2A7, a8). Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que las principales fuentes celulares de IL-26 en GC humana eran células Th17 y NK y el porcentaje de cada componente se han resumido en un gráfico circular (Figura 2A9 y a10).
A1 -A8: Un caso representativo de IL-26 expresión en los leucocitos humanos de cáncer gástrico (GC) infiltrantes de tumor (n = 20) detectado por citometría de flujo después de co-tinción con anticuerpos contra CD4, CD8, RORγT, y CD3 + CD16 + CD56. a9. Comparación del porcentaje de IL-26 células positivas en las células T CD3 positivas entre PBMCs como controles, CD3, CD4, CD8 positiva, Th17 y células NK derivadas de tejidos de GC. El experimento se realizó por triplicado. A10: Un gráfico de sectores para el porcentaje de varios componentes contribuyen a la producción de IL-26. b1-b4: Representante células CD4 + T,
in vitro
estimula las células Th17 y células NK aisladas analizadas por citometría de flujo. C1-C8: análisis de citometría de flujo de la IL-26 expresión en células Th17 y NK estimuladas con LPS y
H.pylori
lisados. c9: Comparación de la expresión de IL-26 en cada grupo. Los experimentos se realizaron por triplicado. Los análisis estadísticos de la figura A9 y C9 se realizaron con la prueba de Mann-Whitney y se compararon con el grupo control. ** P & lt;.
0,01
Para investigar más a fondo la secreción de IL-26 en las células Th17 y NK, las PBMC se recogieron de 20 voluntarios sanos y estimulados bajo condiciones de polarización Th17. La otra fuente principal de IL-26, las células NK, se obtuvo a partir de PBMCs utilizando un kit de aislamiento de NK humana comercial. Las características de las células Th17 y NK inducidos o aislados fueron verificados por tinción intracelular de citoquinas y analizados por citometría de flujo (Figura 2b1, b2). La estimulación de las células Th17 y NK con LPS y
H. pylori
lisados resultó en un aumento significativo en la secreción de IL-26, lo que indica que IL-26 es una respuesta de citoquinas de vital importancia en el cáncer gástrico (Figura 2C).
3.
in vitro
proliferativa y anti-apoptóticos efectos de la IL-26
El efecto de la IL-26 se procedió a investigar una serie de
in vitro
estudios realizados en dos humana líneas celulares de GC, MKN45 y SGC-7901. El efecto de la IL-26 sobre la proliferación celular se evaluó con el ensayo incooperation BrdU en las células tratadas con diferentes concentraciones de IL-26 (1, 10 y 50 ng /ml). No se detectaron diferencias significativas en la proliferación celular entre las células no tratadas y las tratadas con 1 ng /ml de IL-26. Sin embargo, la tasa de proliferación celular aumentó significativamente en respuesta a 10 y 50 ng /ml de IL-26 en comparación con la de las células no tratadas (Figura 3A). Además, la evaluación del efecto anti-apoptótico de IL-26 por PI-AnnexinV co-tinción en las células tratadas con el medicamento de quimioterapia cisplatino para varios puntos de tiempo mostró que la IL-26 tiene un efecto anti-apoptótico significativo incluso a una dosis de 1 ng /mL. El efecto anti-apoptótico aumentó con concentraciones crecientes de IL-26 a 10 y 50 ng /ml (Figura 3B1, B2). Estos resultados indican que la IL-26 tiene efectos proliferativos y anti-apoptóticos sobre líneas celulares GC humanos, lo que explica en parte la asociación entre la expresión de IL-26 y diferentes características clínicas observadas en los estudios clínicos. Sin embargo, el mecanismo molecular subyacente necesita ser analizado más
A:. Curva de crecimiento del cáncer gástrico (CG) y líneas celulares MKN45 SGC7901 en la presencia o ausencia de IL-26 en las concentraciones indicadas según lo determinado por el ensayo de cooperación BrdU. El experimento se realizó por triplicado. B1: Análisis de cisplatino (1 mg /ml) inducida por la apoptosis en MKN45 y SGC7901 células y en células tratadas con las concentraciones indicadas de IL-26 para 24 h. Las células se analizaron por PI-Anexina V co-tinción. Se utilizaron células MKN45 y SGC7901 sin tratar como controles. B2: Comparación del porcentaje de células apoptóticas en varios punto de tiempo en cada grupo (los experimentos se realizaron por triplicado). Los análisis estadísticos en las figuras A y B2 se realizaron con ANOVA de dos vías y en comparación con el grupo control. ** P & lt;. 0,01
4. Los efectos proliferativos y anti-apoptóticos de la IL-26 se asocian con la activación de STAT3
Los estudios previos han demostrado que la unión de la IL-26 a su complejo receptor puede inducir una rápida activación de STAT3 y, en menor grado, STAT1 [ ,,,0],12]. Por lo tanto, se determinó primero la expresión del complejo receptor de IL-26 (IL-20R1 e IL-10R2) en MKN45 y SGC7901 células y verificó que ambos receptores estaban presentes en líneas de células de GC para confirmar que la transducción de la IL-26 señales fue posible (Figura 4A). A continuación, examinó la activación de la señalización de STAT1 y STAT3 y mostró que la fosforilación del residuo S727 de STAT3 y Y701 de STAT1 aumentó en respuesta a 10 ng /ml de IL-26. IFN-γ (10 ng /ml) e IL-6 (30 ng /ml) se utilizaron como controles de activación de STAT1 y STAT3, respectivamente (Figura 4B). Con base en estudios anteriores que muestran que STAT1 y STAT3 vías de señalización tienen efectos opuestos en la tumorigénesis [18], se determinó abajo objetivos de STAT1 y STAT3 A fin de dilucidar los mecanismos que subyacen a las proliferativos y pro-supervivencia efectos de la IL-26 mediada por STAT1 y STAT3 señalización en líneas celulares de GC. Nuestros resultados mostraron que la IL-26 estimulación upregulated la expresión de Bcl-2, Bcl-XL y c-myc, lo que sugiere que la IL-26 tiene un efecto más fuerte sobre la activación de STAT3 que en STAT1 señalización directa o indirectamente (Figura 4B). Este resultado también contribuye a nuestra comprensión de la pro-supervivencia y el efecto proliferativo de la IL-26 en líneas celulares humanas GC
A:. La expresión de IL-20R1 e IL-10R2 en MKN45, SGC7901, cáncer gástrico y tejido gástrica normal detectada por transferencia de Western. B: MKN45 y SGC7901 células se estimularon o no con IL-26 (10 ng /ml), IL-6 (30 ng /ml) y IFN-γ (10 ng /ml), se extrajeron las proteínas, y se analizaron por Western Blot de STAT3 y STAT1 activación (S727 fosforilada de STAT3 y Y701 de STAT1) y expresión de proteínas aguas abajo de Bcl-2, Bcl-XL y c-myc.
5. El Tumor efecto promotor de IL-26 es dependiente de la STAT1 /STAT3 Equilibrio
El efecto de la IL-26 en el equilibrio entre STAT1 y la activación de STAT3 se investigó utilizando lentiviral mediada silenciamiento siRNA de STAT1 y STAT3 en MKN45 y células SGC-7901. El siRNAs que corresponde efectivamente el regulado la expresión de STAT1 y STAT3 en ambas líneas celulares (Figura 5A). La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de cooperación de BrdU en las células transfectadas de control de siRNA y las líneas celulares de GC tratada STAT1 y STAT3 siRNA crecido en medio que contiene 10 ng /ml de IL-26. Desmontables de expresión STAT3 inhibió significativamente el crecimiento de las células MKN45 y SGC-7901, mientras que STAT1 caída no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular (Figura 5B1, B2). apoptosis inducida por cisplatino se evaluó por PI-Anexina V co-tinción en las mismas células que se mantienen en medios con 10 ng /ml IL-26, y los resultados mostraron una disminución significativa en el efecto pro-supervivencia de IL-26 en células de STAT3 desmontables , mientras que no se detectaron cambios estadísticamente significativos en la tasa de apoptosis en respuesta a silenciamiento STAT1 (Figura 5C1, C2). Estos resultados indican que la IL-26 tiene pro-supervivencia y efectos proliferativos sobre líneas celulares GC humanos mediadas al menos parcialmente por la señalización /STAT3 STAT1
A:. La expresión de STAT1 y STAT3 en MKN45 y SGC7901 células transfectadas con el control siRNA (indicado como MKN45cs y SGC7901cs) o siRNAs específicos dirigidos a STAT1 y STAT3 según lo determinado por el Western Blot. B: El crecimiento celular de MKN45cs y SGC7901cs y células tratadas STAT1 y STAT3 siRNA según lo determinado por el ensayo de cooperación BrdU. Los experimentos se realizaron por triplicado. C1: El cisplatino (1 mg /ml) inducida por la apoptosis de MKN45cs, SGC7901cs y células tratadas STAT1 y STAT3 siRNA determinada por PI-Anexina V co-tinción. B2: Comparación del porcentaje de apoptosis en cada grupo (experimentos realizados por triplicado). Los análisis estadísticos de las figuras B y C2 se realizaron con la prueba de Mann-Whitney y se compararon con el grupo control. ** P & lt;. 0.01
Discusión
Estudios anteriores demostraron que la IL-26 es co-expresada con otra citoquina relacionada con la IL-10 importante, IL-22, que es también secretada por las células Th17 [19], [20]. Sin embargo, la expresión y el papel de la IL-26 en el cáncer humano no se han investigado en detalle. A continuación, se analizó por primera vez la expresión de IL-26 en los tejidos humanos y GC mostró que la IL-26 y moléculas relacionadas, como la IL-20R1 se sobreexpresa en los tejidos humanos GC.
IL-26 es co -expresada con IFN-γ e IL-22 en los clones Th1 humanos, pero no en los clones Th2. Además, la IL-26 es co-expresada con IL-17 e IL-22 por las células Th17, un subconjunto importante de las células T cooperadoras CD4 + que es distinta de las células Th1 y Th2 [12], [21]. En el presente estudio, la IL-26 fue encontrado para ser producida principalmente por células T auxiliares CD4 positivas en GC humana, entre los que casi la mitad de las células Th17 segrega IL-26. Examinamos otra posible fuente celular, las células NK, que son reportados estar relacionado con el volumen tumoral y la diseminación de GC humana [22], [23] y demostraron que las células NK son también fuentes importantes de la producción de IL-26. Nuestros resultados son compatibles con un estudio reciente en el que se encontró un nuevo subconjunto de células CD56 + NKp44 + NK para co-expresa IL-22 e IL-26, sobre todo en respuesta al tratamiento con IL-23 [24]. Hughes
et al
. se describe un subconjunto diferente de las células NK inmaduros que no expresan CD56 o NKp44 sino que expresan CD117 y CD161 y expresan constitutivamente IL-22 e IL-26 [25]. Además, nuestros resultados muestran por primera vez que la IL-26 promueve la proliferación de células GC humanos al afectar el equilibrio de STAT1 y STAT3 activación, proporcionando así nuevas pruebas de la relación entre las células NK y el volumen del tumor en GC humana.
IL-26 se ha reportado que la señal a través de un complejo receptor heterodímero compuesto por las cadenas de IL-20R1 e IL-10R2. funciones de IL-20R1 como la cadena de unión a ligando específico para IL-26, y las funciones de IL-10R2 como una segunda cadena esencial para completar el montaje del complejo receptor activo. Anticuerpos neutralizantes contra cualquiera de las cadenas IL-20R1 o IL-10R2 son capaces de bloquear la IL-26 de señalización. Una vez ensamblado, el complejo receptor experimenta un cambio conformacional (s) que induce la activación de las tirosina quinasas Janus asociadas al receptor, Jak1 y Tyk2, y el acoplamiento transitorio posterior y la fosforilación de las proteínas STAT, STAT1 y STAT3 [26], [27]. Como uno de los factores de señalización corriente abajo de IL-26, STAT3 se asocia más con la tumorigénesis y también se considera como un oncogén. STAT3, que se considera un punto de convergencia de numerosas vías de señalización oncogénicas, es constitutivamente activado tanto en células tumorales y en las células inmunes en el microambiente del tumor [28], [29], [30]. En particular, la activación de STAT3 se ha informado en casi 70% de los tumores sólidos y hematológicos, incluyendo mieloma múltiple, varios linfomas y leucemia, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, carcinoma de ovario, melanoma, carcinoma renal, carcinoma colorrectal y del timo tumores epiteliales [31]. STAT3 es conocido por promover la proliferación celular y la angiogénesis y desempeñar un papel en tumor inmune-escape, sino que también perjudica la invasividad y el potencial metastásico de los tumores. Nuestros resultados mostraron que STAT3 se activa en los tejidos humanos GC y su activación puede estar asociado con la excesiva secreción de IL-26. Por otra parte, no se detectaron diferencias significativas en el otro objetivo aguas abajo de IL-26, STAT1, entre el tumor y los tejidos normales adyacentes. STAT1 y STAT3 se cree que desempeñan papeles opuestos en la tumorigénesis [18]. STAT1 tiene una compleja serie de funciones tanto en las células tumorales y el sistema inmune y por lo general se considera como un supresor de tumores debido a su papel en la inhibición del crecimiento y la promoción de la apoptosis [32].
En resumen, hemos demostrado que la IL -26 promueve el crecimiento celular y previene la apoptosis de las células de cáncer gástrico humanos mediante la modulación de la balanza de la señalización de STAT1 /STAT3, lo que indica que IL-26 puede ser un valioso indicador de pronóstico y diana terapéutica en pacientes con cáncer gástrico.