Extracto
Antecedentes
El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CECC) es el séptimo cáncer más común en todo el mundo. Por desgracia, la supervivencia de los pacientes con CECC no ha mejorado en los últimos 40 años, y por lo tanto se necesitan nuevos objetivos para la terapia. Recientemente, se han encontrado elevaciones en nivel en suero de interleuquina 6 (IL-6) y la expresión de Twist en muestras de tumores de estar asociado con pobres resultados clínicos en múltiples tipos de cáncer, incluyendo SCCHN. A pesar de la torcedura se ha propuesto como un regulador maestro de la transición y la metástasis epitelio-mesénquima en el cáncer, los mecanismos por los cuales los niveles de la torcedura son regulado después de la traducción no se entienden completamente. La progresión tumoral se caracteriza por la participación de citoquinas y factores de crecimiento y la inducción de la torcedura se ha conectado con una serie de estas vías de señalización, incluyendo IL-6. Dado que muchos de los efectos de la IL-6 están mediados por la activación de cascadas de fosforilación de proteínas, esto implica que la expresión de la torcedura debe estar bajo un estricto control en el nivel post-traslacional con el fin de responder de manera oportuna a los estímulos externos.
Hallazgos Metodología /Principales
Nuestros datos muestran que la expresión de IL-6 aumenta la torcedura través de un mecanismo independiente de la transcripción en muchas líneas celulares de SCCHN. La investigación adicional reveló que la IL-6 se estabiliza la torcedura en líneas celulares de SCCHN través de la caseína quinasa 2 (CK2) fosforilación de los residuos de la torcedura S18 y S20, y que esta fosforilación inhibe la degradación de Twist. fosforilación de la torcedura no sólo aumenta su estabilidad sino que también aumenta la motilidad celular. Por lo tanto, la modulación posterior a la traducción de Twist contribuye a sus propiedades promotoras de tumores.
Conclusiones /Importancia
Nuestro estudio muestra la expresión de la torcedura puede ser regulada a nivel post-traducción a través de la fosforilación por CK2, lo que aumenta la estabilidad de la torcedura en respuesta a IL-6 de la estimulación. Nuestros resultados no sólo proporcionan nuevos conocimientos sobre mecánica en la regulación postraduccional de la torcedura, pero también sugieren que CK2 puede ser una diana terapéutica viable en SCCHN
Visto:. Su YW, Xie TX, Sano D, Myers JN (2011 ) IL-6 Estabiliza Twist and tumor potencia la motilidad celular en células de cáncer de cabeza y cuello a través de la activación de la caseína quinasa 2. PLoS ONE 6 (4): e19412. doi: 10.1371 /journal.pone.0019412
Editor: Torbjorn Ramqvist, Karolinska Institutet, Suecia |
Recibido: Diciembre 22, 2010; Aceptado: March 31, 2011; Publicado: 29 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Su et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la espora Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center en cáncer de cabeza y cuello CA097007 P50 subvención, los Institutos nacionales de la Salud del Centro del cáncer de subvención CA016672 textuales, y el Panteón y la Broudy "comprometerse con la curación" fundaciones. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CECC) es el séptimo cáncer más común en todo el mundo [1]. A pesar de las mejoras en las técnicas de cirugía y radioterapia, la tasa de supervivencia a 5 años no ha mejorado significativamente en las últimas décadas y se mantiene en 50-55%. Aunque las metástasis recurrencia y linfáticos del cuello de nodos locales representan la mayor parte de las muertes por esta enfermedad, sólo el 10-20% de los pacientes se benefician de la integración de la terapia de quimioterapia sistémica, con marginalmente mejor supervivencia y efectos tóxicos considerables [2], [3]. Por lo tanto, se necesitan nuevos objetivos para la terapia
Recientemente, se encontró que la sobreexpresión de Twist en muestras tumorales clínicos que se correlaciona con metástasis y mal pronóstico en pacientes con CECC, así como otros tipos de cáncer [4] - [7]. . Twist es un factor de transcripción-hélice-bucle-hélice básico altamente conservada que juega un papel importante para facilitar el movimiento de células en el desarrollo de embriones. En las células cancerosas, torsión es considerado como un oncogén, ya que su expresión elevada promueve la progresión de la enfermedad y la metástasis mediante la inducción de la transición epitelial-mesenquimal (EMT) [8].
A pesar de su importancia en la progresión tumoral, post-transcripcional la regulación de Twist no se entiende bien
Un análisis comparativo de ARNm y expresión de proteínas de la torcedura de la torcedura en embriones de ratón mostró una expresión abundante ARN torcedura en el mesodermo presomitic, somitas epiteliales, y el mesodermo anterior, pero ninguna proteína de la torcedura se pudo encontrar en esos tejidos [9]. La discrepancia se observó también durante el desarrollo embrionario del ratón, como ARN torsión alcanza su nivel más alto en 7,0 días, mientras que postcoital ninguna proteína de la torcedura se puede conocer con anterioridad a 8,25 días postcoital. La falta de concordancia entre la expresión del ARNm de la torcedura de la torcedura y expresión de proteínas indica que la expresión de la torcedura se controla a nivel post-transcripcional [9]. modificación post-transcripcional de factores de transcripción, incluyendo la fosforilación y ubiquitinación, se ha demostrado ser importante para su función, ya que esto proporciona un mecanismo por el cual la célula puede iniciar rápidamente programas transcripcional en respuesta a estímulos externos. Por ejemplo, se ha informado de que la torcedura puede degradarse a través de la vía de degradación de ubiquitina /proteasoma, como el tratamiento con un inhibidor del proteasoma inhibe la degradación de Twist [10]. También hay pruebas de que la función de Twist puede ser modulada por la fosforilación [11], [12]. Debido a que la fosforilación con frecuencia está involucrado en la regulación de la ubiquitina /proteasoma dependiente de la degradación de una proteína [13], la hipótesis de que la fosforilación de torsión aumenta su estabilidad mediante el aumento de su nivel de expresión relativo.
tumorigénesis y progresión CECC son conocidos por ser influenciada por múltiples factores de crecimiento y factores de señalización de citoquinas, incluyendo la interleuquina 6 (IL-6) [14] - [17]. En pacientes SCCHN, sérico elevado nivel de IL-6 se correlaciona con una mala supervivencia y evolución clínica desfavorable [14], [15], [18]. IL-6, produce ya sea por la infiltración de células inmunes o células tumorales, no sólo proporciona las señales de supervivencia a las células cancerosas, pero también facilita la motilidad de las células cancerosas a través de la EMT [19], [20]. La vía de señalización tradicional IL-6 es a través de la unión con sIL-6 receptor (gp80), que induce la dimerización de gp130 y la posterior activación de cualquiera de Janus quinasas (JAK) /STAT3 de una manera dependiente de la transcripción, o de la Ras-MAPK y PI3K /Akt vía [21]. Además de las vías canónicas, la caseína quinasa 2 (CK2) también ha sido recientemente reportado aguas abajo de IL-6 de señalización en el cáncer [22].
CK2 es una serina /treonina quinasa altamente conservado y se expresa de forma ubicua, que consiste de dos catalítica (α o α ') y dos subunidades reguladoras beta [23]. La importancia de subunidades CK2 puede ser demostrado por estudios genéticos que muestran que los ratones que carecen CK2α o CK2β son embriones letal mientras que los ratones knockout CK2 a 'tenían defectos sólo en la espermatogénesis [24] - [26]. CK2 Recientemente ha llegado a ser considerado como un "maestro quinasa", ya que controla la actividad de muchas otras quinasas y está involucrado en muchos procesos celulares importantes [27]. Por ejemplo, CK2 controla la estabilidad de I? B? Y PML supresor de tumores a través de la fosforilación y la modificación de su degradación de ubiquitina /proteasoma [28], [29]. CK2 se ha informado que se sobreexpresa y que se correlaciona con la supervivencia pobre en muchos tipos de tumores, incluyendo SCCHN [30] - [32]. Tradicionalmente, CK2 es considerado como una proteína quinasa constitutivamente activa, pero varios estudios han demostrado que CK2 puede responder a muchos estímulos del factor de crecimiento, incluyendo [22], [33], aunque los mecanismos de su activación permanecen en gran medida poco clara [34 IL-6 ].
se ha informado de que STAT3, la señal aguas abajo importante de la vía de IL-6, transcriptionally puede activar la expresión de Twist [35], [36]. Nuestros datos preliminares mostraron, sin embargo, que la expresión de proteínas de la torcedura se incrementó por la IL-6 antes de que la regulación al alza de Twist ARNm en múltiples líneas celulares de SCCHN agresivos, lo que sugiere una regulación de la transcripción independiente de Twist de IL-6. Dado que muchos de los efectos de la IL-6 están mediadas a través de la activación de cascadas de fosforilación de proteínas [21], y la fosforilación del sustrato con frecuencia está involucrado en la regulación de ubiquitina /proteasoma dependiente de la degradación de una proteína [37], que postula que la expresión de la torcedura se regula por fosforilación de IL-6-activa.
En este estudio, hemos demostrado que el tratamiento de las líneas celulares de SCCHN con IL-6 conduce a la estabilización de la proteína Twist. Investigaciones posteriores mostraron que la IL-6 estimula la fosforilación de la torcedura través de la activación de la proteína quinasa CK2 serina /treonina. Nuestros resultados no sólo proporcionan una nueva visión mecanicista que la torcedura se activa a través de la fosforilación por la quinasa CK2, pero también tienen implicaciones significativas para el pronóstico y el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello.
Resultados
expresión de la torcedura es upregulated poco después de IL-6 tratamiento
La mayoría de las líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) CECC y secretan IL-6 y expresan receptores para la IL-6 (Tabla S1 y Figura S1) [38]. Para estudiar el impacto de la IL-6 en estas líneas celulares, la expresión de la torcedura se examinó a lo largo del curso del tiempo de tratamiento. transferencias de Western de líneas celulares representativas se muestran en la Figura 1A. expresión de la torcedura se indujo en estas células dentro de 15 min después del tratamiento con IL-6. En contraste, los niveles de mRNA de la torcedura se mantuvo sin cambios durante un período de tratamiento similar (Figura 1B). Estos datos indican que la expresión de la torcedura está regulada por IL-6 en el nivel post-transcripcional
.
expresión (A) la proteína de la torcedura se indujo poco después de tratamiento con IL-6 en las células SCCHN (OSC-19, HN31) y células de cáncer de pulmón (A549). Después de la privación de suero durante la noche, las células se sometieron a IL-6 tratamiento (20 ng /ml para 0-4 h), y la expresión de la torcedura en los lisados celulares se analizó mediante transferencia de western. β-actina se utilizó como control de carga. la expresión del ARNm (B) de la torcedura cuantificada por tiempo real RT-PCR se mantuvo casi sin cambios a lo largo de la IL-6 tratamiento (0-6 horas). Los valores se normalizaron a los niveles de expresión del gen de mantenimiento
GAPDH
, y se expresan como el cambio medio desde el nivel basal ± s.e.m. veces Para cada punto de tiempo, se realizaron de dos a cuatro repeticiones. Todos los experimentos se realizaron por duplicado para cada línea celular. Se muestran datos de un experimento representativo con OSC-19 células de SCCHN. (C) la degradación de la torcedura se inhibió por cualquiera MG132 o IL-6. Después de células OSC-19 SCCHN fueron tratados con CHX (100 mM), CHX más el inhibidor del proteasoma MG132 (10 mM), o CHX más IL-6 (20 ng /ml) durante 0-4 h, la expresión de la torcedura se determinó por Western mancha. (D) Los píxeles en cada banda en (C) se midieron por Image J y normalizado de modo que el número de píxeles en el tiempo 0 era 100%. Los datos se representan como el log
10 de la densidad de píxeles relativa (eje y) frente al tiempo (min). La vida media se determina a partir del registro de densidad de píxeles relativa 50%. La vida media de la torcedura fue de 1,2 h en presencia de CHX solo y & gt;. 4 h en presencia de CHX + IL-6
Esta observación de que la IL-6 regula al alza la expresión de la torcedura post transcripcionalmente nos llevó a investigar si la degradación de Twist fue a su vez modulada por el tratamiento con IL-6. Las tasas de degradación de la torsión en las células de SCCHN se examinaron por tratamiento con cicloheximida inhibidor de la síntesis de proteínas (CHX) solo, CHX más el inhibidor del proteasoma MG132, o CHX más IL-6. La cantidad de proteína en cada punto de tiempo se determinó por transferencia de western y se cuantificó por densitometría. Como se muestra en las figuras 1C y 1D, la torcedura endógena tenía un 1,2-h de media vida, pero cuando cualquiera se añadió IL-6 o MG132, menos de la torcedura fue degradado y no llegó a su vida media en el periodo de tratamiento de 4 h . Los datos son consistentes con un estudio anterior que muestra que la proteína de la torcedura se degrada a través del sistema de degradación del proteasoma [10] e indican que la proteína de la torcedura se estabiliza después de la traducción mediante la inhibición de su degradación por IL-6.
torcedura se fosforila en respuesta a tratamiento con IL-6, y CK2 se encuentra en la vía entre la IL-6 y la torsión
Debido a que IL-6 se ha demostrado que activa vías de señalización a través de la activación de cascadas de proteína quinasa múltiple celular, a continuación examinó si Twist es fosforilada en respuesta al tratamiento con IL-6. Las células transfectadas con un plásmido que codifica una hemaglutinina (HA) proteína de fusión -Twist fueron tratados con IL-6; inmunoprecipitación posterior con un anticuerpo HA y transferencia Western usando un anticuerpo fosfoserina no específica reveló aumento de la fosforilación de serina /treonina residuos en Twist (Figura 2A), lo que confirma que Twist es fosforilada en respuesta a IL-6 de la estimulación.
(A ) de la torcedura se fosforiló en respuesta a tratamiento con IL-6. células OSC-19 SCCHN fueron transfectadas ya sea con el plásmido HA-torcedura o vector de control durante 48 h, después se trató con IL-6 (20 ng /ml) durante 30 min; tratados y los lisados de células no tratadas se inmunoprecipitaron con el anticuerpo HA y se analizaron por Western blot utilizando un anticuerpo fosfoserina no específica. (B) Los inhibidores a las vías descendentes conocidas de IL-6 fueron incapaces de inhibir la regulación positiva Twist de IL-6. OSC-19 células SCCHN fueron pretratadas con los inhibidores de la quinasa indicados o dimetilsulfóxido (DMSO; control) durante 1 h, a continuación, fueron tratados con IL-6 (20 ng /ml) durante 30 min. expresión de la torcedura se determinó por transferencia de western. (C) El sitio de fosforilación de CK2 (SNSE) Twist, predicho por el uso de http://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml, se conserva en todas las especies. (D) la actividad CK2 se incrementó por la IL-6 e inhibida por DMAT inhibidor CK2 en las células de SCCHN. Después de la privación de suero durante la noche, se recogieron los lisados de células HN31 tratados con PBS (control), IL-6 (20 ng /ml, 30 min), o IL-6 más DMAT (10 m). actividad CK2 endógena en los lisados celulares (5 g) se midió utilizando un sustrato sintético péptido CK2 (RRRADDSDDDDD; 0,1 mM) y γ-
32P-ATP como donante de fosfato tal como se describe anteriormente [49]. El eje y representa el número por minuto (CPM) de la radiactividad después de la normalización con el control sin sustrato. *
P Hotel & lt; 0,05 por el Estudiante
t-test
. expresión torsión inducida por IL-6 (E) fue inhibida por los inhibidores de la CK2. expresión de la torcedura se midió después del tratamiento con IL-6 (30 min) en los lisados de OSC-19 SCCHN o células de cáncer de pulmón A549 previamente incubadas en CK2 inhibidores DMAT o TBB (1 h). expresión de giro se inhibió a dosis tan bajas como 0,8 M y no se restringió a una línea celular específica. (F) Derribo de la subunidad catalítica de CK2 (CK2α) por shRNA inhibe la expresión de proteínas Twist. Desmontables de CK2α en OSC-19 células SCCHN durante 24 h redujo significativamente la expresión de la torcedura y bloqueó su inducción por IL-6 tratamiento (20 ng /ml, 30 min).
Para identificar la quinasa responsable de la fosforilación inducida por IL-6 de Twist, se utilizó una estrategia de cribado de inhibidores químicos para determinar si la regulación al alza de la torcedura mediada por IL-6 puede ser bloqueada por inhibidores de la quinasa que se sabe que aguas abajo de la vía de señalización. Giro se reguló por la IL-6 pesar de la aplicación de inhibidores que bloquean JAK (AG490), PI-3K (Wortmannina), Erk (U0126), p38 MAPK (SB202130), o de junio
N-terminal quinasa
(SP600125) , indicando que la regulación positiva de la torcedura es independiente de estas vías (Figura 2B). Dado que ninguna de las vías conocidas que hemos probado parecía estar implicada en la mediación de la expresión de la torcedura inducida por IL-6, el próximo examinaron la secuencia de aminoácidos en la proteína computacional servidor web predicción de la familia http://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml e identificado un motivo de sustrato CK2 consenso (SNSE) dentro de torsión en los residuos 18 a través de 21 que se conserva en todas las especies (Figura 2C)
CK2 es una serina /treonina quinasa.; crecientes estudios recientes indican que puede desempeñar un papel importante en la progresión de SCCHN [32], [39]. Se consideraba anteriormente como una quinasa intracelular constitutivamente activa, pero varios hallazgos recientes han demostrado que CK2 puede ser activada en respuesta a estímulos externos, tales como IL-6, aunque los mecanismos subyacentes de esta activación siguen sin estar claros [22], [34]. De acuerdo con estudios anteriores, la actividad CK2 en lisados celulares de SCCHN se upregulated por IL-6 e inhibida por CK2-inhibidor específico de 2-dimetilamino-4, 5, 6, 7-tetrabromo-1H-bencimidazol (DMAT), como se determina por un CK2 ensayo de actividad de quinasa que utiliza un péptido sustrato sintético y CK2 γ-
32P-ATP como donante de fosfato (Figura 2D).
Para demostrar aún más que CK2 es en la vía entre la IL-6 y Twist, el próximo examinado la expresión de la torcedura en presencia de IL-6 y CK2 inhibidores DMAT o 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole (TBB). Como se muestra en la Figura 2E, la expresión de la torcedura inducida por IL-6 fue inhibida por cualquiera de inhibidor CK2 y no se observó esta inhibición a través de diferentes líneas celulares. Los efectos de la CK2 sobre la expresión de torsión inducida por IL-6 fueron confirmados además por desmontables de la CK2α catalítica subunidad en líneas celulares de SCCHN, en el que se redujeron tanto los niveles basales de expresión de la torcedura y los que después de tratamiento con IL-6 (Figura 2F). Tomados en conjunto, estos datos confirman además la importancia de CK2 a la estabilización inducida por IL-6 de Twist.
asociados con CK2, fosforila y estabiliza la torcedura
A continuación examinó si CK2 y torsión son asociado con el uno al otro mediante el uso de experimentos de co-inmunoprecipitación. En primer lugar se utilizó lisados preparados a partir de células HEK 293T transfectadas con ambos de tipo salvaje Myc-Twist and CK2α. Como se muestra en la Figura 3A, CK2α se detectó en transferencias de Western de inmunoprecipitados llevados a cabo con se detectó anticuerpo Myc y Myc-giro en la transferencias Western de inmunoprecipitados llevados a cabo con anticuerpo CK2α. Control de inmunoprecipita utilizando no específica IgG no precipitar cualquiera de las proteínas. Los datos sugieren que las proteínas pueden interactuar entre sí. Para examinar más a fondo la interacción entre la proteína endógena y CK2α torcedura en las células SCCHN, la línea celular FaDu fue elegido porque expresa un nivel basal elevada de la proteína CK2; Se establecieron células HN31 SCCHN que expresan de forma estable la torcedura Myc-etiquetados (células HN31 Myc-Torsión SCCHN) para los propósitos de inmunoprecipitación a causa de los malos resultados de los anticuerpos de la torcedura disponibles en el mercado. Como se muestra en la Figura 3B, la torcedura endógena en las células FaDu SCCHN fue co-inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-CK2α. En las células SCCHN HN31 Myc-twist, que expresan de forma estable Twist-Myc etiquetados, CK2α endógena fue también co-precipitado con los inmunoprecipitados anti-Myc. Estos datos apoyan la hipótesis de que CK2 puede regular Twist de mostrar que estas dos proteínas se asocian físicamente entre sí
(A) & amp;. (B) bidireccional co-inmunoprecipitación mostraron que CK2α se asocia con Twist. (A) Co-inmunoprecipitación se realizó en lisados de células HEK 293T transfectadas con ambos WT-Myc Twist and CK2α. CK2α fue co-inmunoprecipitó con Myc-twist y viceversa. (B) Los lisados celulares de FaDu (izquierda) o células HN31, que de manera estable expresan WT Myc-Twist (derecha), se inmunoprecipitaron con CK2α (en las células FaDu) o anticuerpo Myc (en las células HN31 WT Myc-TWIST) y se sometieron a western El análisis de transferencia. Torsión endógena fue co-inmunoprecipitó con CK2α en lisados celulares Fadu y CK2α endógena se encuentra en los inmunoprecipitados de Myc-HN31 Myc-WT lisados celulares Twist. (C) CK2α Co-inmunoprecipitado en los inmunoprecipitados HN31 Myc-TWIST se aumentó por la IL-6 (20 ng /ml, 20 min) e inhibida por el pretratamiento con un anticuerpo contra el receptor de IL-6, tocilizumab (50 ng /ml, 45 min). Torsión fosforilada (D) CK2. Un ensayo de quinasa del inmunocomplejo se realizó en Myc-inmunoprecipitados de células HEK 293T lisados de células que sobreexpresan transitoriamente WT Myc y giro o torsión Myc -S18,20A. Recombinante CK2 quinasa y γ-
32P-ATP se añadieron a los inmunoprecipitados a 30 ° C durante 15 min, y la reacción se detuvo por adición de tampón de muestra SDS y calentamiento a 95 ° C durante 5 a 10 min. Las muestras se sometieron entonces a electroforesis y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno para autorradiografía o análisis de transferencia Western. (E) La estabilidad de Twist se vio afectada por el sitio de fosforilación de CK2. [HN31 células SCCHN expresan de forma estable WT-Myc Twist, el mutante hypophosphomimetic Myc-S18,20A torcedura CK2, o el mutante de la torcedura-Myc fosforilación S18,20D-mimética eran tratados con CHX (100 mM) durante los tiempos indicados. expresión Myc-Torsión en los lisados celulares se determinó mediante Western blot. Los datos representan uno de los tres experimentos independientes. Las vidas medias calculadas (t1 /2) a partir de los experimentos por triplicado se expresan como media ± s.e.m. *
P
. & Lt; 0,05 por el Estudiante
t-test
Para examinar si la interacción entre Twist and CK2α es dependiente de IL-6, co inmunoprecipitación se repitió en Myc-Twist-formación estable de células HN31 tras un breve tratamiento con IL-6 (20 min). Debido HN31 expresa altos niveles de producción de IL-6 (Tabla S1), un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6, tocilizumab, se utilizó para examinar su interacción bajo bloqueo de IL-6 de señalización. Como se muestra en la Figura 3C, el aumento de CK2α fue co-inmunoprecipitó con Myc-torsión después del tratamiento de IL-6, pero no se encontró en los inmunoprecipitados a partir de células pretratadas con tocilizumab durante 45 minutos
.
Para determinar si CK2 fosforila giro al residuos S18 /S20, el sitio de fosforilación putativo de nuestra predicción computacional, se realizó un ensayo de quinasa complejo inmunológico en células HEK 293T que sobreexpresan ya sea de tipo salvaje (WT) Myc-torsión o mutante Myc-torcedura en el que S18 y S20 están sustituidos con alanina ( S18,20A torcedura). Purificada quinasa CK2 fosforilada WT Twist, pero se suprimió la fosforilación en presencia del inhibidor de DMAT CK2 y fuertemente reducida en mutado torcedura S18,20A (Figura 3D).
Para probar si la estabilidad de torsión se ve afectada por la el sitio de fosforilación, se establecieron las células HN31 estables que sobreexpresan WT Twist, torcedura S18,20A, o un imitador de fosforilación en el que S18 y S20 están mutados a ácido aspártico (S18,20D torcedura). Después del tratamiento de las células con CHX, las vidas medias calculadas para S18,20D Twist, torcedura S18,20A, y la torcedura WT a partir de los tres experimentos fueron 9,62 ± 0,99 h para S18,20D torcedura, 2.45 ± 0.59 h de la torcedura S18,20A y 4,69 ± 0,73 h para el WT Twist (Figura 3E). Todos los
valores de P
para comparar las medias de los dos grupos con el estudiante
t-test
fueron menos de 0,05. Esto apoya la hipótesis de que la fosforilación de CK2 Twist de mejora la estabilidad de la torcedura. Tomados en conjunto, estos datos indican que se asocia con CK2 y fosforila Twist, y que la fosforilación en S18 y S20 se estabiliza Twist.
CK2 y torsión están involucrados en la IL-6 promueve la motilidad celular-
a continuación examinó los efectos de la IL-6, la inhibición CK2, y desmontables torsión en la motilidad celular SCCHN, medida por la cicatrización de heridas y los ensayos de migración cámara de Boyden. Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, la migración de OSC-19 células SCCHN en un ensayo de cero de curación de heridas 12-h fue promovida por IL-6 y suprimida por el DMAT inhibidor CK2, mientras que la tasa de proliferación relativa en cada grupo no sufrió cambio significativo (Figura 4C). Derribo de Twist en OSC-19 células suprimió profundamente la motilidad celular, lo que indica su importante papel en la migración celular (Figura 5A, panel superior). Después del tratamiento con IL-6 por 24 h, la migración se incrementó, pero este aumento se revirtió en los grupos de la torcedura desmontables (Figura 5A, panel central). migración celular promovida-IL-6 fue inhibida por el inhibidor de CK2, así como desmontables de Twist, lo que sugiere que tanto CK2 y torsión están implicados en la migración inducida por señal. A continuación comparó la motilidad de las líneas celulares que expresan de forma estable WT o mutante de la torcedura
in vitro
. A pesar de los antecedentes de alta producción de IL-6 secreción y la existencia de Twist endógeno en células HN31 SCCHN, la sobreexpresión de WT, pero no S18,20A, torsión promovió la migración de células con respecto al control la Figura 5B, panel superior (;
P
& lt; 0,05). Además, la sobreexpresión de S18,20D giro aumenta aún más la motilidad celular en relación con la de las células que expresan bien la torcedura WT o S18,20A, lo que sugiere que esta mutación conduce a la motilidad celular mejorada.
Imágenes (A) para la migración de células SCCHN mediante el ensayo de cicatrización de heridas se muestran. OSC-19 células SCCHN fueron tratados con PBS (control), IL-6 (20 ng /ml), DMAT (20 mM), o ambas IL-6 y DMAT en un medio de 2% como se indica. Las monocapas de células confluentes fueron heridos por raspado con una punta de pipeta de 200 l. Fotos de los arañazos fueron adquiridos a las 0 y 12 h. Las mediciones cuantitativas de la distancia migrada relativa se analizaron con Image J. de datos (B) se expresan como media ± s.e.m. de la distancia migrada relativa. *
P Hotel & lt; 0,05 por el Estudiante
t-test
. tasa de proliferación (C) de la célula en cada condición en (A) se midió mediante el ensayo de MTT para 12 h. Las diferencias entre los grupos no tienen significación estadística.
(A) Derribo de Twist inhibe la migración de células SCCHN en el ensayo de migración de cámara de Boyden. células OSC-19 SCCHN se transfectaron primero con vector de control o torcer shRNAs durante 24 h en medio con o sin IL-6 (20 ng /ml). Las células se sometieron a continuación a tratamiento con tripsina, se contaron, y se ensayaron para la motilidad celular usando un ensayo de migración cámara Boyd después de 20 h. Alto & amp; paneles intermedios: Los datos se expresan como media ± s.e.m. de los recuentos de células a partir de cuatro diferentes vistas microscópicas de campo menor potencia. *
P Hotel & lt; 0,05 por el Estudiante
t-test
. Panel inferior: expresión Twist, para los experimentos correspondientes en los paneles superior y medio se detectó por Western blot. ß-actina se utilizó como control de carga. (B) La mutación de la migración alterada de la torcedura de las células SCCHN. La motilidad de las células HN31 SCCHN expresan de forma estable WT Myc-Torsión o indique la proteína Myc mutante Twist se examinó con el ensayo de migración de cámara de Boyden después de 20 h. Panel superior: los datos se expresan como media ± s.e.m. de los recuentos de células a partir de cuatro diferentes vistas microscópicas de campo menor potencia. *
P Hotel & lt; 0,05 por el Estudiante
t-test
. El panel medio: imágenes representativas de las células migraron desde las membranas transwell correspondientes a bajo aumento campo de la energía. Panel inferior: transferencias Western para los experimentos correspondientes en el panel superior de (B). ß-actina se utilizó como control de carga. proliferación (C) de la célula de cada condición en (B) tal como se mide mediante el ensayo de MTT para 20 h. Las diferencias entre los grupos no tienen significación estadística.
Discusión
Este informe demuestra una novela phosphoregulation posterior a la traducción de Twist de IL-6 a través de la activación de CK2 en las células SCCHN. Esta modificación post-translacional puede estabilizar Twist, lo que le permite regular la motilidad celular, proporcionando evidencia de un nuevo mecanismo para la regulación de la torcedura en las células cancerosas.
Los informes publicados han implicado tanto Twist and IL-6 en el desarrollo /progresión de cáncer, ya que sus expresiones son detectables en muchos tumores epiteliales o el suero de los pacientes y se asocia con resultados clínicos desfavorables [4], [16], [18]. Aunque se ha informado de que la IL-6 y su mediador de señal aguas abajo, STAT3, pueden aumentar la expresión de la torcedura a través de la transcripción en líneas celulares de cáncer de mama [20], [35], [36], esto no excluye el mecanismo de post-traduccional modificación de la expresión de la torcedura. Como se muestra en la Figura 2B, la expresión de la torcedura se induce poco después de tratamiento con IL-6 a pesar de la inhibición de la fosfo-STAT3 por inhibidor químico AG490 o SB202130 a dosis más altas, lo que indica que la regulación al alza Twist es STAT3 independiente. Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, la expresión de proteínas de la torcedura marcadamente aumentado antes de cambios en la expresión de ARNm giro en líneas celulares de SCCHN. Estos hallazgos no contradicen los de un estudio anterior de Mín
et al
[36], en el que la proteína de la torcedura se indujo a 1 h después de la activación de la vía del EGFR-fosfo-STAT3 mientras que los niveles de mRNA de la torcedura aumentaron sólo después de 2 h de tratamiento. A pesar de que no fue discutido en el trabajo anterior, la discrepancia entre la torcedura ARNm y la expresión de proteínas en nuestro estudio indica la existencia de un mecanismo de regulación post-transcripcional a través de diferentes líneas celulares.
Nuestros datos demuestran que la proteína puede ser torcedura fosforilados y estabilizado por la IL-6 en líneas celulares de SCCHN, apoyando el concepto de que phosphoregulation de factores de transcripción se utiliza a menudo por múltiples vías de señalización celular de respuesta oportuna a los estímulos externos [37]. Aunque phosphoregulation torsión se ha descrito en los estudios de mutaciones de la torcedura en pacientes con el síndrome de Saethre-Chotzen, un trastorno autosómico dominante de craneosinostosis [11], el papel de phosphoregulation de Twist en las células cancerosas, que nosotros sepamos, se ha discutido en sólo unos pocos estudios [12], [40]. El sitio de fosforilación de CK2 (S18 y S20) identificado en este estudio se encuentra en el motivo NSEEE, uno de los cinco dominios conservados evolutivamente en la secuencia de aminoácidos de la torcedura, cuya función no está clara [41]. Nuestro hallazgo puede ayudar a mejorar la comprensión de este dominio, ya CK2 está conectado a muchas vías de factores de crecimiento o citoquinas, tales como IL-6 y el factor de crecimiento epidérmico (EGF), en la que la torcedura también está involucrado [20], [22], [ ,,,0],33], [36].
Curiosamente, estos factores son bien conocidos para influir en la tumorigénesis y progresión de SCCHN [16]. Hemos analizado la regulación post-transcripcional de Twist en respuesta a otras citoquinas /factores de crecimiento CECC-relevante y encontramos que la función de estabilizar la torcedura no se limita a la IL-6. Otros factores de crecimiento importantes en el CECC, como el EGF y el factor de crecimiento endotelial vascular C, también estabilizan los niveles de Torsión [figura S2]. Esto sugiere que un mecanismo común puede participar en la regulación de la torcedura en el CECC, y que puede ser interesante conocer el papel de la CK2 en estas vías de señalización.
El mecanismo a través del cual se activa CK2 sigue siendo poco clara [34] . Aunque se ha demostrado que la activación CK2 es Erk-dependiente en células de neuroblastoma [33], la inhibición farmacológica de Erk con U0126 en nuestro estudio no bloquear la mediada por aumento de IL-6 en la expresión de Twist (Figura 2B). Esto sugiere que puede haber mediadores celulares distintos de Erk que puede activar CK2. Si se trata de las necesidades específicas de tipo celular a investigarse más a fondo.
La metástasis es la principal amenaza para la salud y la supervivencia de pacientes con cáncer y su gestión es un reto para los profesionales de la salud. Desde la torcedura se considera como un regulador maestro de la EMT y la metástasis de los cánceres de [8], la regulación por disminución de Twist en células de cáncer ha sido propuesta como un enfoque terapéutico prometedor, ya que no sólo sensibiliza a las células a la quimioterapia y promueve la apoptosis de las células sino que también inhibe las células 'capacidades migratorias e invasivas [33], [42].