Extracto
La identificación de posibles marcadores tumorales ayudará a estratificar e identificar el potencial maligno de un tumor y su respuesta a los tratamientos específicos. IL-6 se ha informado de que un predictor en varios tipos de cáncer. Por lo tanto, el presente estudio se realizó para poner de relieve el papel de la IL-6 en la mejora del tratamiento y determinar el pronóstico de cáncer de vejiga. Las líneas celulares de cáncer de vejiga humano HT1376 y HT1197 fueron seleccionados para los experimentos celulares y animales, en el que se exploraron cambios biológicos después de la manipulación experimental de la IL-6, incluyendo el comportamiento del tumor y la señalización relacionada en el cáncer de vejiga. Además, se seleccionaron muestras clínicas de 85 pacientes con músculo invasivo y 50 con no musculares cánceres de vejiga invasivo para la tinción inmunohistoquímica para evaluar la capacidad predictiva de la IL-6 en relación con el resultado clínico. Los datos revelaron que la IL-6 se sobreexpresa en las muestras de cáncer de vejiga en comparación con los tejidos no malignos, tanto en los niveles de proteína y mRNA. La tinción positiva de IL-6 se correlacionó significativamente con un mayor estadio clínico, una mayor tasa de recurrencia después del tratamiento curativo, y la tasa de supervivencia reducida. El crecimiento del tumor y la capacidad invasiva se atenuaron cuando IL-6 fue bloqueada. Los cambios de fondo que consistieron en disminución de la proliferación celular, menos epitelio-mesenquimal transición (EMT), disminución de la ADN metiltransferasa 1 de expresión y atenúa la angiogénesis. En conclusión, nuestros resultados mostraron que la IL-6 podría ser un predictor significativo para el estadio clínico y el pronóstico de cáncer de vejiga. Por otra parte, la orientación IL-6 puede ser una estrategia prometedora para el tratamiento del cáncer de vejiga
Visto:. Chen MF, Lin PY, Wu CF, Chen WC, Wu CT (2013) de IL-6 Expresión Regula tumorigenicidad y se correlaciona con El pronóstico en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (4): e61901. doi: 10.1371 /journal.pone.0061901
Editor: Peter Canoll, Universidad de Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 6 de diciembre de 2012; Aceptado: 14 de marzo de 2013; Publicado: 30 de abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por el hospital Memorial Chang Gung, Taiwán, conceder CMRPG690332-3. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de vejiga urinaria representa un espectro de neoplasias, incluyendo no músculo invasivo (CVNMI), músculo invasivo, y las lesiones metastásicas. Carcinoma de células transicionales (TCC) de la vejiga es la forma más común de cáncer de vejiga y se manifiesta en dos formas distintas con diferentes comportamientos clínicos y biológicos. Aproximadamente el 70% de los pacientes presentan tumores invasivos no musculares, mientras que el restante 30% se presentan con tumores del músculo invasivo. A pesar del buen pronóstico para los pacientes con enfermedad superficial, la recurrencia es común y se asocia con el desarrollo de la enfermedad músculo-invasivo [1]. Casi la mitad de todos los pacientes que presentan enfermedad músculo-invasivo o aquellos que ya han progresado a este puerto estado oculta en metástasis a distancia y tienen una pobre tasa de supervivencia a 5 años [2]. A diferencia de otros cánceres urológicos, cáncer de vejiga carece de biomarcadores útiles clínicos para predecir la fase de la enfermedad y el resultado clínico. Por lo tanto, se requieren marcadores moleculares que se pueden usar para estratificar e identificar verdadero potencial maligno de un tumor y su respuesta a terapias específicas
La inflamación crónica a menudo precede o acompaña un número sustancial de cánceres [3] - [5]. . Un aumento de mediadores de la inflamación se ha demostrado que conducen a la promoción tumoral, la invasión y la angiogénesis [6] - [7]. Aunque el papel de la inflamación crónica en la etiología de TCC de la vejiga no ha sido bien establecida, no hay evidencia de que las citoquinas proinflamatorias juegan un papel crítico en la patogénesis de cáncer de vejiga, tales como IL-6, TNF-α IL-8 y [8]. Además, la activación de STAT3 persistente se demostró para mantener la actividad de NF-kappa B constitutiva, proporcionando así evidencia de la relación entre las vías de señalización dentro de la oncología microambiente inflamatorio [9]. IL-6 es un activador importante de STAT3 vías de señalización, y la principal citocina que influye en la respuesta inflamatoria en los seres humanos [10], [11]. IL-6 de señalización ha sido implicado en la regulación del crecimiento tumoral y la diseminación metastásica, y su nivel puede ser correlacionado con mal pronóstico en diferentes tipos de cáncer [11], [12]. Además, el aumento se informó de IL-6 de los niveles séricos de estar asociado con la metástasis y mal pronóstico del cáncer de próstata, de ovario, y cánceres de la vejiga [13] - [15]. Aunque no existe evidencia que sugiere que la IL-6 puede ser un factor crítico en diversos tumores malignos, su papel en el cáncer de vejiga aún no está claro. Por lo tanto, en el presente estudio, nos centramos en los mecanismos subyacentes de la IL-6 y su posible utilidad para hacer frente a la necesidad de un tratamiento agresivo para el cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
Características de los pacientes
la Junta Institucional de Chang Gung Memorial hospital Revisión aprobó el presente estudio (Número de Permiso: 99-0207B). Los consentimientos escritos fueron firmados por los pacientes para su muestra y la información que se almacenan en el hospital y se utilizan para la investigación. Un total de 85 pacientes con TCC vesical infiltrante (39 en estadio T2 y T3 46 con etapas-T4) que completaron un curso de tratamiento quimiorradioterapia definitiva (CCRT) se inscribieron en el estudio. Al término de CCRT, los pacientes fueron sometidos a una repetición de tomografía computarizada (CT scans) y el examen cistoscopia para determinar la respuesta al tratamiento. Los pacientes se observaron a intervalos de 3 meses durante los 2 primeros años y posteriormente cada 6 meses. El seguimiento de los pacientes se continuó hasta su muerte, y los criterios de valoración fueron la supervivencia global (SG), la supervivencia libre de progresión, patrón de fracaso y la respuesta a la CCRT definido. progresión de la enfermedad se definió como la recidiva local o metástasis a distancia documentado. Los análisis se realizaron con el programa SPSS versión 17.0.
inmunohistoquímica (IHC) tinción
Además de las muestras de tejido recogidas de los 85 pacientes con cáncer vesical infiltrante, se recogieron muestras de tejido de la vejiga para inmunohistoquímica ( IHC) tinción de 17 pacientes que sufren de carcinoma de vejiga con metástasis a distancia, 50 CVNMI pacientes, y 40 pacientes no malignidad. tejidos fijados con formalina, incluidos en parafina obtenidos mediante resección transuretral en el diagnóstico se cortaron en secciones 5 micras, y se montaron en portaobjetos para la tinción IHC. Para la evaluación histológica de la IL-6 de la tinción, la tinción se obtuvo independientemente por dos observadores que eran ciegos a la evolución clínica de los pacientes; Se revisaron las puntuaciones discordantes, y se llegó a un consenso. En el presente estudio, un criterio de tinción positiva de más de 10% de las células tumorales se consideró positiva en la puntuación de IHC, que se definió mediante la operación (ROC) análisis de la curva característica receptor.
Cultivo de células y reactivos
HT137 y HT1197, líneas celulares de cáncer de vejiga humana, se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). La IL-6-anticuerpo neutralizante se obtuvo de amp I +; D Systems (Minneapolis, MN) y la IL-6-GFP vector de silenciamiento (humano IL6 shRNA construye en el vector GFP retroviral) y control GFP vector (no efectiva revueltos shRNA casete GFP en el vector retroviral) se obtuvieron de Origene Technologies, Inc. (Rockville, MD).
modelo de tumor de xenoinjerto (ectópico y ortotópico)
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones en la Guía para el Cuidado y uso de Animales de Laboratorio promulgada por los Institutos de Laboratorio de Recursos Animales, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, EE.UU. el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del experimentos con Animales de Chang Gung Memorial hospital (Número de Permiso: 2010070201) . Ocho semanas de edad ratones desnudos atímicos hembra fueron utilizados como el modelo de la implantación del tumor de xenoinjerto. En el modelo de la implantación del tumor ectópico, (se inyectaron 5 x 10 células
6 tumorales por vía subcutánea por la implantación, cinco animales por grupo) las células se implantan en la región dorsal bilateral glúteo. El tamaño del tumor se midió cada tres días después de la implantación (día 0). El volumen del tumor se calculó asumiendo una forma elipsoide. En el modelo de la implantación del tumor ortotópico, se realizó la instilación intravesicular de células canccer como se describió previamente (cinco animales por grupo). La extensión de la invasión del tumor ortotópico se midió después de la implantación en los tiempos indicados. El efecto de la IL-6 estimulación también se investigó
in vivo
. Para el grupo tratado, una inyección intraperitoneal de IL-6 (60 o 100 ng por ratón, 3 veces por semana) se inició un día antes de la implantación del tumor.
migración celular y la invasión de células de ensayo.
Capacidad para la invasión de células se determinó por Cell Invasion Ensayo (Trevigen, Gaithersburg, MD). Las cámaras superiores se pre-recubrieron con extracto de membrana basal (derivado de tumor EHS y proporcionado en el kit). Después de la incubación durante 24 h, se determinó el número de células en la cámara inferior mediante la medición de la calceína anión fluorescente liberado de acetoximetiléster calceína intracelular. Para validar los experimentos sobre la migración de células, también se llevaron a cabo los ensayos de cero. Una amplia cero 2 mm se dibuja a través de cada capa de células usando una punta de pipeta. Las placas fueron fotografiados en los tiempos indicados.
inmunofluorescencia (IF) tinción
Las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio a 5 × 10
4 células /ml en placas de 6- así para inmunofluorescencia (SI) de la tinción con o sin tratamiento. En los tiempos especificados después del tratamiento, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 2% durante 5 minutos, y se lavaron en PBS con Tween-20 (PBST). Los portaobjetos se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos contra E-cadherina y IL-6, seguido de incubación con anticuerpo secundario de Texas Red-conjugado y contratinción con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
tiempo real inversa reacción en cadena de la polimerasa con transcripción (RT-PCR)
real-time RT-PCR se realizó en ARN extraído de células y muestras de tejido (muestras de tejido de cáncer de seis y seis tejidos no malignos ; dos especímenes en cada carril). Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: (adelante y atrás, respectivamente) 5'-GTTCTTCCTCCTGGAGAATGTCA-3 'y 5'-GGGCCACGCCGTACTG-3' para DNMT-1; 5'-TACATCCTCGACGGCATCTC-3 'y 5'-GCTACATTTGCCGAAGA- -gcc-3' para la IL-6. Un conjunto de cebadores β-actina se utilizó como control de carga. La PCR optimizado se realizó en un tiempo real, sistema de detección por PCR multicolor iCycler iQ. Significativas señales fluorescentes de PCR a partir de tejido de carcinoma se normalizaron con respecto al valor medio de las señales obtenidas a partir de tejidos no malignos.
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para los niveles de IL-6
in vitro
y
in vivo
Las muestras de orina se obtuvieron de 60 pacientes con cáncer de vejiga (25 de pacientes con CVNMI, 35 de aquellos con enfermedad músculo-invasivo), y 20 muestras de pacientes sin evidencia de malignidad. Muestra de 10 ml de orina fresca se recogió de cada sujeto, y posteriormente se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos. En el momento de alícuotas de orina de análisis se descongelaron y urinario IL-6 se midió en los sobrenadantes. Comercialmente disponible ELISA ensayo (IL-6 kit SA humana inmunoensayo; R & amp; D Systems) se utilizó para medir los niveles de IL-6 urinaria. Los ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las curvas de calibración se prepararon utilizando estándares purificadas para cada proteína evaluado. Para probar nivel de IL-6 en el sobrenadante celular, las células se cultivaron con medio libre de suero 1 ml durante 24 h en placa de 6 pocillos. El medio se recogió y se clarificó por centrifugación a 3000 g. IL-6 niveles en el sobrenadante se detectó mediante ensayo ELISA. Se analizaron
El análisis estadístico
probabilidades p
de supervivencia mediante el método de Kaplan-Meier. La supervivencia se calculó a partir de la fecha de inicio del tratamiento hasta la fecha de la muerte o la más reciente de seguimiento. La significación de las diferencias entre grupos se evaluó mediante la prueba de log-rank. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, con
p Hotel & lt; 0,05 tomado para indicar la significación. Significación de la diferencia entre las muestras se determinó mediante la prueba t de Student. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Tres repeticiones fueron realizadas para la evaluación de cada experimento, y repetir todo el conjunto de experimentos por lo menos dos veces. Un nivel de probabilidad de p & lt; 0,05 fue adoptado en todo para determinar la significación estadística salvo indicación en contrario
Resultados
IL-6 expresiones en pacientes con cánceres de vejiga
El nivel de IL. -6 en muestras de tejido de cáncer (seis pares de muestras de tejido y no malignas adyacentes) fue examinada usando ARNm y análisis de proteínas. Como se muestra en la Figura 1A, los especímenes de cáncer de vejiga expresaron sustancialmente más alto nivel de IL-6 que los tejidos no malignos. análisis de IHC para TCC vejiga (Fig. 1B y Tabla 1) indica la tinción positiva para IL-6 en 51% de T2-T4 tejidos de cáncer de vejiga [28% (11/39) en vs. T2 70% (32/46) en T3-T4;
P
= 0,0001]. Además, 65% (11/17) de los tumores más avanzados (pacientes con metástasis a distancia) mostró tinción positiva para IL-6, pero sólo el 17,5% (7/40) de los tejidos de la vejiga no malignas y 26% (13 /50) de los tumores en fase inicial (CEI o T1) expresaron IL-6. Como se muestra en la Figura 1C, la tinción positiva para la IL-6 fue significativamente correlacionado con el estadio clínico (T2-T4 vs T1 y la CEI;
P
= 0,005). Por otra parte, los niveles urinarios de IL-6 se examinaron mediante análisis de ELISA. La media de IL-6 niveles en muestras de orina de pacientes con CVNMI (81 ± 30,8 pg /ml) y el cáncer vesical infiltrante T2 (98 ± 24 pg /ml) fueron ligeramente más altos que los que no tienen la enfermedad maligna (25,14 ± 9,71 pg /ml), pero las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Fig. 1D). IL-6 urinaria niveles fueron significativamente elevados en pacientes con T3-T4-cánceres de vejiga locales avanzados (250 ± 27 pg /ml) en comparación con las de los pacientes con cáncer de vejiga ≤T2 o enfermedad no maligna (
P
= 0,01).
A. Los niveles de IL-6 se examinaron en seis muestras (cáncer de emparejado (C) y el tejido no maligno adyacente (N), dos especímenes en un carril) por RT-PCR y análisis de transferencia de Western. Para análisis en tiempo real RT-PCR, el eje y muestra la relación de IL-6 en el tejido de cáncer dividido por que en la muestra no malignas. Columnas, con una media de tres experimentos separados; Bares, desviación estándar (SD); *,
P & lt; 0,05
. B. Tinción inmunohistoquímica de cáncer de vejiga humano Las muestras con anticuerpo anti-IL-6. se muestran diapositivas representativos. C. Los datos de la IHC mostraron que los niveles de IL-6 se correlacionaron significativamente con el estadio clínico. D. urinaria IL-6 niveles de los pacientes fueron examinados por análisis ELISA. Columnas, con una media de tres experimentos separados; Bares, SD; *,
P & lt; 0,05
. (NT, los pacientes con enfermedades no malignas).
El papel de la IL-6 en el crecimiento del tumor y la invasión
Para investigar si la IL-6 juega un papel en el comportamiento agresivo de las células de cáncer de vejiga, HT1197 y HT1376 se transfectaron con el vector de silenciamiento IL-6-GFP. Como se muestra en la figura 2A, el vector de silenciamiento IL-6 redujo significativamente IL-6 expresión en ambas líneas celulares. Como se determinó por recuento de células viables de más de seis días (figura 2b), el vector de silenciamiento IL-6 atenuó significativamente la tasa de proliferación de las células HT1197 y HT1376. Además, el uso de xenoinjertos de tumores modelo, la inhibición de IL-6 dio lugar a más lento el crecimiento del tumor
in vivo
(Fig. 2C). Los datos demuestran que el vector de silenciamiento IL-6 inhibió significativamente la tasa de crecimiento de células de cáncer de vejiga. Además, IL-6 vector de silenciamiento atenuó significativamente la capacidad invasiva de las células de cáncer de vejiga como se demuestra usando ensayos de migración de rascar [16] y ensayo de invasión
in vitro
(Fig. 3A, la Fig. S1). Una técnica de la implantación del tumor ortotópico se utilizó para examinar los efectos de la IL-6 vector de silenciamiento en invasivo capacidad
in vivo
(Fig. 3B). Dieciséis ratones recibieron la instilación intravesical de cada línea celular de cáncer de vejiga. Después de 28 días, 13 ratones (81%) infundidos con células HT1197, cuatro (25%) inculcados con células HT1197 más vectores de IL-6 silenciamiento, 11 (69%) con células HT1376, y dos (13%) con células HT1376 más IL-6 vector de silenciamiento desarrolló tumores intravesiculares. Los datos indicaron que el vector de silenciamiento de IL-6 disminuyó la capacidad invasiva
in vivo
.
A. Efectos de la IL-6-GFP vector de silenciamiento en el nivel de IL-6 en las células HT1197 y HT1376 como se demuestra por el análisis de inmunofluorescencia. Micrografías representativas se muestran, con los respectivos colores de inmunofluorescencia (DAPI, azul; GFP, verde, IL-6, rojo). IL-6 niveles se redujeron significativamente por la IL-6-GFP vector de silenciamiento en comparación con el vector control-GFP. B. Efectos de la IL-6 vector de silenciamiento en él las velocidades de proliferación de células de cáncer de HT1197 y HT1376. El mismo número de células (10
4) se sembró en cada placa en el día 0 y se dejan crecer en sus respectivas culturas. Se contó el número de células viables después de la incubación durante 2, 4 y 6 días. El eje y representa el número de células viables. Point, media de tres experimentos separados. Bares, Dakota del Sur. *,
P & lt; 0,05
. C. Efectos de la inhibición de IL-6 en el crecimiento de tumor de xenoinjerto. Cada punto representa la media de tres experimentos separados; bares, SD; *,
P & lt; 0,05
. La expresión de IL-6 también se evaluó mediante tinción inmunoquímica de xenoinjertos. diapositivas representativos se muestran en la magnificación × 400.
A. La capacidad invasiva de las células de cáncer de vejiga con o sin IL-6 vector de silenciamiento se evaluó mediante ensayos de migración cero. Los resultados de diapositivas representativos se muestran. Columna, media de tres experimentos separados. Bares, Dakota del Sur. *,
P & lt; 0,05
. B. La capacidad invasiva de las células de cáncer de vejiga con o sin la IL-6 vector de silenciamiento fue evaluada por la implantación del tumor ortotópico murino. Se muestran las diapositivas representativos y los datos cuantitativos. El eje y representa la proporción de ratones que presentan tumores intravesiculares, normalizada a la que recibe la implantación del tumor ortotópico. El vector de silenciamiento IL-6 disminuyó la tasa de implantación del tumor en la vejiga y se asoció con un menor tamaño del tumor. Columna, media de tres experimentos separados. Bares, Dakota del Sur. *,
P & lt; 0,05
. (CV, las células transfectadas con el vector de control; IL-6 SV, las células transfectadas con el IL-6 silenciamiento vector). C. Cambio en la E-cadherina en las células se evaluó y se muestran las micrografías representativas, con los respectivos colores de inmunofluorescencia (DAPI, azul; GFP, verde; E-cadherina, rojo). D. Cambio en EMT-asociado proteínas en transfectantes se evaluó por análisis de transferencia Western (CV, las células transfectadas con el vector de control; IL-6 SV, las células transfectadas con el IL-6 vector de silenciamiento). E. Cambio en proteínas EMT-asociado en las células tratadas con JAK Inhibidor AG490.
El papel de la IL-6 en la EMT cambia
EMT es un acontecimiento clave en la invasión [17] , y se examinó si este es el mecanismo subyacente a la conducta agresiva de cáncer de vejiga IL-6-positivo. Como se muestra en la Figura 3C-D, el vector de silenciamiento IL-6 aumentó la expresión de E-cadherina asociado con disminución en el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y metalopeptidasa matriz 9 (MMP-9) expresiones en células tumorales [18]. Se ha informado de que la IL-6 es un importante activador de la señalización de STAT3, y la activación de la señalización de STAT3 desempeña un papel en la inducción de comportamiento del tumor y de EMT cambios agresivos en el cáncer [19]. Cuando bloqueamos la activación de STAT3 con JAK-AG490 inhibidor, las proteínas relacionadas con la EMT-disminuyeron (Fig. 3E). Estas observaciones sugirieron que el incremento de comportamiento y de EMT cambios tumor agresivo inducidas por IL-6 pueden estar mediados por la activación de STAT3, una parte por lo menos.
Efectos de la IL-6 sobre la angiogénesis
datos
ELISA reveló que la IL-6 silenciamiento vector atenuado claramente IL-6 secreción en los sobrenadantes de cultivo de células y el suero de los ratones después de 28 días de la implantación del tumor (Fig. 4A). interacciones célula-célula endoteliales CD31 mediada están involucrados en la angiogénesis [20]. Figura 4B mostró que la IL-6 silenciamiento vector atenuado angiogénesis demuestra la tinción de CD31 y VEGF. Para examinado si circulantes de IL-6 facilitar la inducción de la angiogénesis, una inyección intraperitoneal de IL-6 (60 o 100 ng por ratón, 3 veces por semana) se inició un día antes de la implantación del tumor. Como se muestra en la Figura 4C, IL-6 provocó la formación de tubo endotelial y la angiogénesis en el tumor por la tinción de VEGF, MMP-9 y CD31 en ratones portadores de tumores durante 2 semanas. Por lo tanto, la inducción de la angiogénesis puede ser uno de los mecanismos responsables de la promoción de tumores por la IL-6.
A. El nivel de IL-6 en los sobrenadantes de cultivo de células y el suero de ratones portadores de tumores con o sin la IL-6 vector de silenciamiento fue examinado por ELISA
in vitro
y
in vivo
. Columna, media de tres experimentos separados. Bares, Dakota del Sur. *,
P & lt; 0,05
. B. Cambio en el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y metalopeptidasa matriz 9 (MMP-9), y CD31 en xenoinjertos de tumor fue evaluada por tinción inmunohistoquímica. Los resultados de diapositivas representativos se muestran. C. Efecto de la IL-6 en el crecimiento del tumor de xenoinjerto y la inducción de la angiogénesis se evaluó en ratones portadores de tumores durante 2 semanas. Se inyectaron células tumorales por vía subcutánea en los ratones con o sin inyección de IL-6 como se indica en Materiales y Métodos, y el crecimiento del tumor examinadas 2 semanas más tarde. Inmunohistoquímica utilizando MMP-9, se demostró CD31 y VEGF stained- diapositivas representativos.
Relación entre la expresión de IL-6 y DNMT1 en el cáncer de vejiga
Como se informó anteriormente [21 ], los niveles más altos DNMT1 se asociaron con cambios de comportamiento agresivo del tumor y la EMT en los cánceres de vejiga. Nos encontramos que había una correlación significativa entre la tinción positiva para la IL-6 y DNMT1 en IHC tinción de muestras de cáncer de vejiga (Fig. 5A). Por ARNm y análisis de proteínas, disminución de la IL-6 dio lugar a DNMT1 inhibido asociado con STAT3 atenuada y la activación de Akt (Fig. 5B-C). Además, examinó si la inhibición de IL-6 disminución de la expresión DNMT1 través de la inhibición de AKT utilizando un inhibidor de PI3K LY294002-[22], o la regulación a la baja de STAT3 con STAT3 ARN corto de interferencia (siRNA). Como se muestra en la Figura 5D, la inhibición de la fosforilación de Akt, pero no la disminución de p-STAT3, atenuada significativamente la expresión DNMT1. Por lo tanto, se sugiere que la activación de AKT podría ser responsable para el aumento de la DNMT1 en los cánceres de vejiga IL-6-positivos.
A. nivel de IL-6 se correlacionó positivamente con la expresión DNMT1 en muestras de cáncer de vejiga humano (
P & lt; 0,0001
). diapositivas representativos de una muestra de tumor seleccionados tinción positiva tanto para otra muestra tumorales negativos tanto para la IL-6 e IL-6 DNMT1 y DNMT1, y se muestran en la magnificación × 400. B. Efecto de la IL-6 en el nivel de DNMT1, p-AKT y p-STAT3 se examinó mediante (CV, Western Blot Las células transfectadas con el vector de control; IL-6 SV, las células transfectadas con el IL-6 vector de silenciamiento ). C. Efecto de la IL-6 en el nivel de DNMT1 y p-AKT fue evaluada por tinción inmunohistoquímica, y los resultados a partir de diapositivas representativos se muestran. D. Efecto de la inhibición de IL-6 por el anticuerpo, la inhibición p-AKT por el inhibidor de PI3K, y la inhibición de P-STAT3 IL-6-neutralizar por STAT3 siRNA en el nivel de DNMT1 fue examinado por (W, de tipo salvaje transferencia Western; IL -6
-, las células tratadas con IL-6-neutralizar Ab; STAT3
-, las células tratadas con Stat3 siRNA;. PI3K-I, las células tratadas con el inhibidor de PI3K
IL- 6 está relacionado con la evolución clínica del CCT de vejiga
El tiempo de supervivencia media libre de progresión en los 85 pacientes completaron el tratamiento definitivo CCRT era 36.97 meses. Mediante análisis univariante, la tinción positiva para la IL-6 fue significativamente relacionados con mayor clínica etapa, más alta tasa de fracaso de la enfermedad después del tratamiento definitivo y más corto el tiempo de supervivencia (Tabla 1 y Figura 6). los resultados ponen de relieve fuertemente la contribución de la IL-6 con el pronóstico en el cáncer de vejiga.
a diferencia de supervivencia fue demostrada en de acuerdo con tinción positiva de IL-6. Las curvas de supervivencia global de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con niveles más elevados de IL-6 expresión tuvieron períodos de supervivencia más cortos.
Discusión
Hemos demostrado que la IL-6 se expresó en niveles más altos en TCC vejiga que en los tejidos no malignos. Por otra parte, la tinción positiva para la IL-6 se asocia preferentemente con vesical infiltrante TCC en relación con la enfermedad de etapa inferior Ta Tu1. Los niveles urinarios de IL-6 también fueron significativamente elevados en pacientes con vejiga localmente avanzado TCC en comparación con los pacientes con CVNMI. Por lo tanto, IL-6 expresión podría estar relacionado con un fenotipo más maligno.
Para investigar si la IL-6 fue el responsable de la conducta agresiva de CCT de vejiga, IL-6 fue suprimida en las células de cáncer de vejiga mediante la transfección estable con un vector de silenciamiento. Los datos revelaron que la inhibición de IL-6 dio lugar a una disminución del crecimiento del tumor de vejiga
in vitro
y
in vivo
. Además, el vector de silenciamiento IL-6 atenuó significativamente la capacidad invasora detectado en ensayos de invasión celulares y modelos ortotópico de ratón. IL-6 es un activador importante de JAK /STAT3 señalización [10], [11], y la señalización STAT3 activado Se ha informado de contribuir a la oncogénesis mediante la promoción de la proliferación y la EMT [18], [23]. Además, la activación de STAT3 se ha demostrado un papel en la predisposición de las células basales uroteliales hacia la vía de progresión de CIS en cáncer de vejiga invasivo [24]. Nuestros datos revelaron que la inhibición de IL-6 de activación STAT3 atenuada asociada con el aumento de E-cadherina y la disminución de VEGF y MMP-9 expresiones. se reportan aumento de expresiones de VEGF y MMP-9 que se correlaciona con el cambio de EMT y el mal pronóstico del cáncer de vejiga [25], [26]. Por lo tanto, es probable que la activación de STAT3 desempeña un papel en IL-6 de transmisión a objetivos de abajo que regulan EMT y la invasividad.
Hemos demostrado que la IL-6 niveles en suero y orina fueron elevados en un subgrupo de pacientes con cáncer invasivo del músculo de la vejiga, en consonancia con otros centros de investigación [13], [27]. La angiogénesis es uno de los mecanismos que promueven la progresión del tumor, y se sugiere la expresión de factores angiogénicos a tener valor predictivo para la respuesta al tratamiento y el resultado en los pacientes con cáncer [28]. Además, la IL-6 se ha informado a desempeñar varias funciones en la angiogénesis y el modelado vascular [29], y aumentar la angiogénesis por la transcripción de VEGF y MMP-9 en forma STAT3-dependiente. la activación de STAT3 se demostró para modular la expresión de genes que median la angiogénesis;
e
.
g
., VEGF [30]. De acuerdo con ello, los enlaces entre IL-6, la angiogénesis, y la promoción de cáncer de vejiga en ratones portadores de tumores se investigaron adicionalmente en el presente estudio. Utilizando un modelo de tumor de xenoinjerto, nuestros datos demuestran que el nivel de IL-6 ligada positivamente con la angiogénesis y la activación de STAT3. Estos resultados sugirieron que la inducción de la angiogénesis mediada por la activación STAT3 puede ser uno de los mecanismos subyacentes a la agresividad de IL-6 positivos de cáncer de vejiga.
Nos informó anteriormente [21] que DNMT1 podría ser un predictor clínico significativo de cáncer de vejiga. Los estudios han identificado que la expresión DNMT1 puede ser alterada directamente por las citoquinas pro-inflamatorias tales como IL-6 en algunos tipos de tumores malignos [5], [31], [32]. Una correlación positiva entre las muestras de IL-6-positivas y tinción nuclear para DNMT1 se encontró por análisis de IHC en el presente estudio. La relación entre la IL-6 /señalización STAT3 y DNMT1 en el cáncer de vejiga se examinó para ver si la regulación de la IL-6 /STAT3 señalización resultados en los cambios de expresión DNMT1. El análisis de ARNm y proteínas reveló que inhibe la señalización de IL-6 suprimió la expresión DNMT1 nuclear asociado con una disminución de p-AKT y p-STAT3. Sin embargo, la inhibición directa de STAT3 por STAT3 siRNA no tuvo ningún efecto sobre la expresión obvia DNMT1. La fosforilación de Akt quinasa ha sido informado de que el mecanismo responsable de una mayor expresión de DNMT1 estimulada por IL-6 [33], [34]. Cuando bloqueamos fosfoinosítido 3 quinasa /Akt señalización mediante el inhibidor LY294002 específica, la atenuación de la activación de AKT se asoció con una disminución de DNMT1. Por lo tanto sugerimos que activa la señalización de IL-6 mejorada activación de DNMT1 está mediada por la activación de Akt en la CTP de la vejiga.
Identificación de los factores potenciales tiene implicaciones importantes para el desarrollo y selección de dianas moleculares en el tratamiento del cáncer. Nuestros datos experimentales indican que el nivel de IL-6 es importante para el comportamiento agresivo tumor visto en el cáncer de vejiga. Por lo tanto, hemos examinado aún más la capacidad de predicción de la IL-6 en relación con el resultado clínico de CCT de vejiga después de CCRT definido. Nuestros datos muestran que el aumento de la expresión de IL-6 se asoció significativamente con una menor tasa de respuesta completa después del tratamiento, una tasa de fracaso más alta de enfermedad y un período más corto de supervivencia, lo que demuestra un papel de la IL-6 para predecir el pronóstico. Los datos obtenidos de este estudio revelaron que el aumento de la producción de IL-6 es crítica en la agresividad del tumor y el pronóstico de cáncer de vejiga. Hemos desarrollado el las principales vías de señalización que se cree que vincular IL-6 al cáncer de vejiga (Fig. 7).
Además de IL-6, se informó de varias citocinas que son importantes en los estudios de la vejiga cáncer. TNF-α se demostró para estimular las células de cáncer de vejiga para producir MMP-9, que ha sido implicado en invaαsion tumor y la metástasis [35]. Mian et. Alabama. informó de que la IL-8 bloqueo inhibió significativamente la expresión de MMP-2 y MMP-9, lo que resulta en la disminución de la invasión [36]. Por otra parte, el aumento de expresión de IL-8 se correlaciona con mal pronóstico del cáncer de vejiga [37]. La inflamación puede ser considerada como favorable para su contribución a la adquisición de las capacidades básicas del sello. Los mecanismos biológicos enlazan a la agresividad del tumor en IL-6, IL-8 y TNF-α no se entienden claramente. El tema requiere más investigación en el futuro.
Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. En primer lugar, se analizó de forma retrospectiva el valor predictivo de IL-6 en pacientes con cáncer de vejiga sólo por la fracción de tinción positiva. Además, se trata de un análisis retrospectivo de una población con diferentes estadios clínicos de una sola institución. Por lo tanto, se necesitan más investigaciones de los niveles de IL-6 en pacientes con distintas etapas de un ensayo prospectivo.
En conjunto, nuestros resultados sugieren que la IL-6 es crucial para el crecimiento agresivo del tumor, y el resultado clínico del cáncer de vejiga después de la radioterapia definitiva. Los datos apoyan la hipótesis emergente que la IL-6 es un predictor pronóstico clínicamente significativa y puede representar un objetivo adecuado para el tratamiento del cáncer de vejiga.
Apoyo a la Información
Figura S1. hotels, IL-6 inhibición atenuó la capacidad de invasión. Se evaluó la capacidad invasiva de las células de cáncer de vejiga con o sin IL-6 vector de silenciamiento. Los resultados se muestran por portaobjetos representativos y los datos cuantitativos. La cuantificación de la capacidad de invasión estaba contando el número de células invasoras para cada condición. El eje y representa la relación normalizado por el valor de la línea celular respectiva en la condición control. Columna, media de tres experimentos separados; Bar, Dakota del Sur.