Extracto
El cáncer de próstata es el cáncer más común entre los hombres en los Estados Unidos. La citoquina IL-6 activa varias vías de cáncer de próstata, pero su vía de señalización de trans aguas arriba sigue siendo poco conocida. En este estudio, se evaluó el papel de la IL-6 en la expresión génica PDCD4 y cómo el microARN miR-21 regula este proceso en líneas celulares de cáncer de próstata PC-3 y LNCaP. El patrón de expresión de PDCD4 a partir de muestras de cáncer humano de próstata, lesiones precancerosas, y la hiperplasia benigna de próstata fue investigado por inmunohistoquímica. PDCD4 transcripción y la traducción se detectaron por cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) y análisis de transferencia Western, respectivamente. La modulación selectiva de PDCD4 por miR-21 se analizó en las células LNCaP PC-3 y, y el efecto de la IL-6 sobre la expresión de PDCD4 se estudió in vitro. PDCD4 expresión en las muestras de los tipos de tejidos 3 aumenta progresivamente, y los niveles de expresión de PDCD4 y el antígeno específico de la próstata se correlacionaron negativamente. Los niveles de PDCD4 ARNm y proteínas en las células LNCaP PC-3 y transfectadas con anti-miR-21 constructos fueron inferiores a los de las células de control. La expresión de PDCD4 fue inhibida por IL-6, pero este efecto se debilitó en líneas celulares con baja expresión de miR-21. Nuestro estudio demuestra que la regulación de PDCD4 por miR-21 se dirige e IL-6 inhibe la expresión del gen en las células LNCaP PDCD4 PC-3 y por medio de la función específica de miR-21 en PDCD4. Estos resultados apoyan la viabilidad de los futuros esfuerzos para la terapia génica para el diagnóstico y el cáncer de próstata que se basan en la IL-6, miR-21, y PDCD4
Visto:. Dong B, Z Shi, Wang J, Wu J , Yang Z, fang K (2015) de IL-6 inhibe la modulación selectiva de PDCD4 por miR-21 en el cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (8): e0134366. doi: 10.1371 /journal.pone.0134366
Editor: Craig N. Robson, Instituto de Investigación del Cáncer del Norte, Reino Unido
Recibido: 19 Febrero, 2015; Aceptado: July 8, 2015; Publicado: 7 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Dong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
financiación:. los autores recibieron financiación específica para este trabajo desde el Departamento de Heath de la provincia de Yunnan (Grant No.2010NS053). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres en los Estados Unidos. En China, la incidencia de cáncer de próstata está aumentando cada año. La interleucina-6 (IL-6) es una citoquina pleiotrópica que estimula la proliferación y modula eventos celulares clave en el cáncer de próstata [1]. La expresión de IL-6 está elevado en cáncer de próstata avanzado [2] y se correlaciona con el grado Gleason del cáncer de próstata [3] y la progresión del cáncer de próstata [4]. IL-6 es un activador importante del transductor Janus quinasa /señal y activador de la vía de la transcripción 3 en el cáncer de próstata [5]. IL-6 también puede activar la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos [6]. Sin embargo, la corriente arriba vía de señalización de trans IL-6 en el cáncer de próstata sigue siendo poco conocida.
La muerte celular programada 4 (PDCD4) es un supresor de la tumorigénesis, la progresión del tumor y la invasión que actúa con o sin desafío iniciador. PDCD4 fue la primera supresor encontrado para dirigir la traducción [7]. PDCD4 interactúa con factores de iniciación de la traducción y eIF4A eIF4G para inhibir la traducción de una manera-mRNA específico, que conduce a la inhibición de factores pro-oncogénicos [8]. La sobreexpresión de PDCD4 inhibe la tumorigénesis y la progresión tumoral en un modelo de ratón transgénico e inhibe la invasión de células tumorales in vitro
.
Los microARN (MIR) son pequeños ARN no codificantes que son reguladores post-transcripcional de la expresión génica y reguladores importantes de varios procesos fisiológicos y patológicos. MIR también afectan a la producción de proteínas [9] y juega un papel clave en diferentes tipos de tumores humanos [10]. miR-21 expresión es mayor en algunos tumores sólidos [11-13], incluyendo los tumores de próstata, que en los tejidos normales [14]. Además, miR-21 es un oncogén con la función antiapoptótica [15]. miR-21 inhibe la apoptosis en las líneas celulares de cáncer de próstata metastásico andrógeno-independiente de andrógeno-negativas y PC-3 y DU-145 y podrá regular la motilidad y la invasión en estas líneas celulares [16].
En este estudio, determinamos si la IL-6 regula la expresión del gen PDCD4 y definió el papel de miR-21 en este proceso en el cáncer de próstata líneas celulares LNCaP y PC-3.
Materiales y Métodos
Reactivos
las líneas de células PC-3 y LNCaP se obtuvieron del Instituto de Zoología de Kunming, la Academia china de Ciencias. IL-6 humana recombinante se adquirió de amp I +; D Systems (Minneapolis, MN). Gibco medio RPMI 1640 y suero de ternero fetal se adquirieron de Life Technologies (Grand Island, NY); HyClone 0,25% trypsinase de GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ); y DMSO de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anti-miR-21 y el inhibidor de control negativo anti-miR-21 se adquirieron de ABI Biotech (EE.UU.). Lipofectamine 2000 fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). El kit RNAiso Plus para el aislamiento de ARN, PrimeScript RT kit de reactivos para cDNA de transcripción inversa, y Perfect Tiempo real kit para cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) se adquirieron de Takara Bio (Mountain View, CA) junto con el marcador de ADN DL1000 . Los cebadores para la
PDCD4
y
GAPDH
se obtuvieron de Sangon (República Popular China). anticuerpo monoclonal y anticuerpo policlonal de conejo anti-β-actina anti-PDCD4 humano se adquirieron de Abcam (Cambridge, MA). IgG anti-conejo, anticuerpo unido a HRP fue adquirido de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). El kit de ensayo de proteínas BCA y el tampón de lisado RIPA se adquirieron de Beyotime Instituto de Biotecnología (China). En situ kits de hibridación para HSP y DAB se adquirieron de LBP Biotech Company (China).
Las muestras de pacientes
veinte muestras de cada uno de cáncer de próstata, lesiones precancerosas, y muestras de tejido de próstata hiperplasia benigna de pacientes con la próstata adenomatosa hiperplasia atípica, neoplasia intraepitelial prostática o hiperplasia prostática benigna, respectivamente, fueron proporcionados por el Departamento de Patología, el Segundo hospital Afiliado de la Universidad médica de Kunming, Yunnan, china, desde enero de 2010 hasta octubre de 2011. Todas las muestras fueron fijadas en formalina, embebido en parafina, y en rodajas.
cultivo de células
LNCaP y células PC-3 se cultivaron en placas de 25 ml en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10%, penicilina ( 100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) en un 37 ° C, 5% de CO
2 incubadora. El medio de cultivo se cambió cada dos días.
Cuantitativo PCR en tiempo real
PDCD4 expresión se determinó mediante análisis de QRT-PCR. Las células (5 × 10
5) se sembraron en cada pocillo de placas de 6 pocillos, se cultivaron durante 24 h, y se incubaron con IL-6 (0, 5, o 10 ng /ml) durante 24 h. El ARN se extrajo usando el kit de extracción de ARN RNAiso Plus según las instrucciones del fabricante. la calidad del ARN se midió usando el kit de reactivos PrimeScript RT según las instrucciones del fabricante antes de ARN fue inverso-transcrito a cDNA. Se utilizaron los siguientes cebadores PDCD4: aguas arriba del cebador 5'-CCTGAATTAGCACTGGATACTCCT-3 'y aguas abajo del cebador 5' CTAGCCTGCACACAATCTACAGTT-3 '. Se utilizaron los siguientes cebadores GAPDH: cebador directo 5'-TCACTTTGTCACAGCCCAAG-3 'y el cebador inverso 5'-AGCAAGCAAGCAGAATTTGG-3'. La transcripción inversa se realizó a 37 ° C durante 15 minutos (la transcripción inversa-reacción), seguido de 85 ° C durante 5 s (transcriptasa inversa de la reacción de inactivación), según las instrucciones del fabricante. La amplificación se realizó en las siguientes condiciones: durante 2 ciclos a 95 ° C durante 30 s cada uno, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s
análisis de transferencia de Western
Las células (5 × 10
5) se sembraron en cada pocillo de placas de 6 pocillos, se cultivaron durante 24 h, y se incubaron con IL-6 (0, 5, o 10 ng /ml) durante 24 h . La proteína total se extrajo usando el tampón de lisis RIPA, y la concentración de proteínas se midió por el ensayo de BCA. Las proteínas se separaron según el tamaño por electroforesis, se transfirió a la película, y se incubaron con los siguientes anticuerpos: anticuerpo PDCD4, 1: 5000; ß-actina de anticuerpos, 1: 8000; y el anticuerpo secundario, 1: 5000. ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare Life Sciences) se utilizó para la imagen de los geles.
transfección celular y la IL-6 tratamiento
Las células (5 × 10
5) Se sembró en cada pocillo de placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 h para asegurar que la integración de las células transfectadas fue de al menos 60%. El medio se cambió una vez antes de una 4-h de la transfección en un medio libre de antibióticos con Lipofectamine 2000, según las instrucciones del fabricante. La concentración final del inhibidor de anti-miR-21 y el control negativo fue 30 nM. La mezcla de transfección se incubó a temperatura ambiente durante 20 min y luego se coloca en un 37 ° C, 5% de CO incubadora
2 durante 30 min. El medio fue reemplazado con fresco, RPMI libre de antibióticos 1640 después de 6 h. Las células se incubaron con o sin IL-6 (10 ng /ml) durante 24 h antes de ser cosechadas y utilizadas para QRT-PCR y análisis de Western blot para detectar la expresión PDCD4.
El análisis inmunohistoquímico
el cáncer de próstata, lesiones precancerosas, y muestras de tejido hiperplasia benigna de próstata se seccionaron en rodajas de 2 mm de espesor y se fijaron en formalina al 10% durante un máximo de 24 h. Los cortes fueron desparafinados a continuación, el antígeno se recupera de ellos, y se incubaron en peróxido de hidrógeno durante 15 minutos. se añadió a cada rebanada y se incubó a 4 ° C durante la noche:; anticuerpo primario (500 concentración de 1 a 50 l). Se añadió HRP Polymer (HRP anticuerpo secundario) a portaobjetos se lavaron, y se incubaron los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, 1 ml DAB Plus sustrato se añadió gota a gota a lo largo de cada diapositiva con 2 gotas de DAB Plus cromógeno y se incubó durante 10 min. Las láminas fueron lavadas, contratinción, y deshidratado antes de añadir el medio de montaje transparente y cubreobjetos. Todos los cortes fueron evaluados por separado por 2 patólogos y clasificados como -, +, ++ o +++, dependiendo de la profundidad de la tinción PDCD4 en el citoplasma y el núcleo. También se identificaron las células basales con la tinción de p63.
Los análisis estadísticos
Los datos se analizaron mediante el programa estadístico SPSS17.0. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para estimar las diferencias entre las expresiones de PDCD4 y PSA. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para examinar la normalidad de los datos de análisis inmunohistoquímico, y unidireccional ANOVA se utilizó para comparar la diferencia entre los grupos de intervención. la mínima diferencia significativa de Fisher se utilizó la prueba (LSD) para poner a prueba las diferencias entre los 2 grupos.
Declaración de Ética
El estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Kunming y realizada de conformidad con la Declaración de Helsinki. La necesidad de obtener el consentimiento informado por escrito fue cortado por la junta de revisión institucional ya que este fue un estudio retrospectivo. los registros de los pacientes fueron anónimos antes del análisis.
Resultados
PDCD4 expresión en tipos de tejidos de próstata
PDCD4 proteína se expresó principalmente en el citoplasma, pero también se expresó en menor medida en el núcleo de muestras de próstata y la hiperplasia prostática precancerosa. Había una marcada diferencia en el patrón de expresión PDCD4 entre especímenes de cáncer de próstata, neoplasia intraepitelial prostática, y la hiperplasia prostática (Fig 1). En el carcinoma pobremente diferenciado, la expresión PDCD4 fue baja o ausente. la expresión de PSA fue mayor en las muestras de cáncer de próstata que los de la hiperplasia benigna de próstata (Fig 1). Los resultados de PSA y la tinción PDCD4 en diferentes tipos de tejidos de próstata revelaron que la menos diferenciada el cáncer de próstata, menor será el nivel de expresión PDCD4 y más alto el nivel de expresión de PSA. Los resultados de la tinción p63 mostraron que las células basales era abundante en BPH, escasos en PIN y ausente en CaP tejido (Fig 1).
En el cáncer de próstata, considerable cantidad de glándula normal es deficiente. nidos cáncer se forman con glándulas cribiformes irregulares, y el cáncer se infiltra en el tejido muscular y el citoplasma celular. Este patrón de tinción fue clasificado PDCD4 (+), PSA (+++). En neoplasia intraepitelial prostática, el patrón de tinción fue clasificado PDCD4 (++), PSA (++). En la hiperplasia prostática /hiperplasia glandular, el patrón de tinción nuclear fue clasificado PDCD4 (+++), PSA (+/-). La expresión de PDCD4 y PSA fueron diferentes (
x
2 = 8,632,
P Hotel & lt; 0,05) entre los 3 tipos de tejidos. En la prueba de rangos de Spearman, los niveles de expresión de PDCD4 y PSA entre los 3 tipos de tejido de la próstata se correlacionaron negativamente (-1 & lt;
r Hotel & lt; 0).
Efecto de miR-21 inhibición de la expresión PDCD4
locus regulado por el miR-21 Un en el 3'UTR de PDCD4 se ha informado en HeLa células de carcinoma cervical [17]. Para determinar si miR-21 también regula la expresión PDCD4 en el cáncer de próstata, líneas celulares LNCaP PC-3 y se transfectaron con miR-21 inhibidor para reducir la cantidad de endógeno miR-21 antes de medir PDCD4 ARNm y la expresión de proteínas por PCR en tiempo real y inmunotransferencia, respectivamente. El nivel de expresión PDCD4 mRNA fue mayor en el grupo transfectado que en cualquiera de los grupos de control, con la expresión en las células LNCaP siendo mayor que en las células PC-3 (Fig 2a) (
F
= 20.562,
P Hotel & lt; 0,001). expresión de la proteína PDCD4 aumentó después de LNCaP y PC-3 células fueron transfectadas con el inhibidor de miR-21 (Figura 2b) (células PC-3:
Z = -3,920
,
P Hotel & lt; 0,001 ; células LNCaP:.
Z
= 3,883,
P Hotel & lt; 0,001), lo que sugiere que PDCD4 está regulada por el miR-21 en estas líneas celulares de cáncer de próstata
QRT resultados de la PCR que muestran un aumento en la expresión PDCD4 mRNA de las células LNCaP PC-3 y se transfectaron con miR-21 inhibidor, lo que indica que PDCD4 ARNm se expresa de forma diferente entre los dos grupos. Entre las células miR-21-inhibido, expresión PDCD4 mRNA en las células LNCaP fue significativamente mayor que la de las células PC-3. expresión PDCD4 ARNm de LNCaP y células PC-3 se downregulated después de un tratamiento de 24 h con diferentes concentraciones de IL-6. (B) análisis de transferencia de Western que muestra un aumento en los niveles de expresión de la proteína PDCD4 en PC-3 y las células LNCaP transfectadas con el inhibidor de miR-21. Nontransfected y las células de control negativo se clasifican del 1 al 6 en la prueba de los rangos de muestras pareadas. Los niveles de expresión de la proteína PDCD4 de células LNCaP y PC-3 fueron regulados a la baja después de un tratamiento de 24 horas con diferentes concentraciones de IL-6.
expresión PDCD4 después de IL-6 tratamiento
los resultados de los análisis de QRT-PCR revelaron una disminución significativa en la transcripción de PDCD4 en las células LNCaP PC-3 y después del tratamiento previo con IL-6 (5 o 10 ng /ml; figura 3a). Los resultados del análisis de transferencia de Western reveló una disminución significativa en la traducción de PDCD4 después del tratamiento previo con IL-6 (5 o 10 ng /ml; figura 3b). Además, hubo una correlación negativa entre la concentración de IL-6 y el nivel de regulación a la baja de la expresión PDCD4. expresión PDCD4 disminuyó más en las células PC-3 que en las células LNCaP. las células PC-3 y LNCaP fueron transfectadas de forma estable con el inhibidor de miR-21 y luego tratados con IL-6 (10 ng /ml) para determinar el papel de miR-21 en la regulación de la expresión PDCD4 por IL-6. En tanto en células PC-3 y LNCaP, el nivel de PDCD4 mRNA y expresión de la proteína en los grupos transfectadas fue mayor que en cualquiera de los grupos de control o de los grupos de control negativo (Fig 4). Como se mencionó anteriormente, PDCD4 era el objetivo de la regulación de miR-21 e IL-6 inhibe la expresión PDCD4 través de miR-21
.
Los niveles de expresión de ARNm PDCD4 en LNCaP y células PC-3 fueron regulados a la baja después de un 24- h de tratamiento con IL-6 a 0, 5, o 10 ng /mL. La diferencia no hubo significación estadística (a) entre sí. La misma diferencia también se observó en los niveles de expresión de la proteína PDCD4 (b). (A) la expresión de mRNA PDCD4 de LNCaP y células PC-3 se downregulated después de un tratamiento de 24 h con IL-6 a 10 ng /mL. (B) expresión de la proteína PDCD4 de LNCaP y células PC-3 se downregulated después de un tratamiento de 24 h con IL-6 a 10 ng /ml,
expresión de la proteína PDCD4 fue significativamente mayor en las células de cáncer de próstata transfectadas con el miR-21-inhibidor antes de tratamiento con IL-6 que en las células no transfectadas con el inhibidor (prueba de ANOVA de una sola vía:
F
valor = 241.781,
P Hotel & lt; 0,05) . Los niveles de expresión de la proteína PDCD4 en células transfectadas y no transfectadas de ambas líneas celulares fueron significativamente diferentes (prueba LSD:
P Hotel & lt; 0,05).
Discusión
este estudio, se encontró que la expresión de la proteína PDCD4 disminuye con una disminución en el grado de diferenciación del tejido de la próstata. Esta observación sugiere que la extensión de la malignidad en los tejidos de cáncer de próstata está relacionado con PDCD4 expresión. Un patrón similar se observa en cánceres del sistema digestivo [18], cáncer de hígado [19], carcinoma ductal de la mama [20], y el cáncer nasofaríngeo [21]. Dado que los niveles de expresión de PDCD4 difieren con la extensión de la enfermedad en los tejidos de la próstata, PDCD4 puede ser un marcador tumoral prometedor tanto para el diagnóstico y tratamiento del cáncer de próstata (Fig 1). También se encontró que PDCD4 se expresa tanto en las células luminales y células basales en la HPB, pero en los tejidos PIN y PCA expresados principalmente en las células luminales (Figura 1), y las expresiones de PDCD4 y PSA se correlacionaron negativamente en los tejidos de la próstata, lo que sugiere que la diagnóstico de cáncer de próstata se puede facilitar mediante la combinación de la detección de los 2 factores.
Nuestro estudio también encontró que PDCD4 es un objetivo de la regulación de miR-21 en células de cáncer de próstata. miR-21 se sabe que se sobreexpresa en muchos tipos de tumores sólidos. miR-21 madura puede reducir la expresión PDCD4 mediante la inducción de la vía de TGF-β, que es un regulador de PDCD4 [22]. Por otra parte, un locus proteína conservada ha sido identificado en la secuencia de PDCD4, a través del cual miR-21 regula la expresión PDCD4 para inducir la invasión tumoral y la metástasis [23]. De acuerdo con resultados anteriores [24,25], nuestro estudio apoya que el miR-21 y PDCD4 tienen una correlación negativa con el miR-21 PDCD4 reducción de la expresión y la inducción de la invasión de células tumorales y metástasis a distancia.
Para determinar si el miR expresiones -21 y PDCD4 eran diferentes en el cáncer de próstata dependiente de andrógenos y independiente de andrógenos, hemos realizado nuestros estudios en el independiente de andrógenos línea celular de cáncer de próstata PC-3 y la línea celular de cáncer de próstata dependiente de andrógenos LNCaP. En ambas líneas celulares, PDCD4 era un objetivo de miR-21 en los niveles de transcripción y traducción. Sin embargo, el mecanismo de acción de miR-21 en la regulación de PDCD4 fue diferente en las células dependientes de andrógenos y independientes de andrógenos, con miR-21 inhibición de afectar la expresión PDCD4 en mayor medida en las células PC-3 que en las células LNCaP. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que el gen PDCD4 es el objetivo de la regulación de miR-21 en el cáncer de próstata.
Los niveles circulantes de IL-6 en tumores sólidos pueden ser de importancia pronóstica en pacientes con carcinoma metastásico y refractario a las hormonas de la próstata cáncer [26]. IL-6 promueve la proliferación de células de cáncer de próstata mediante la activación del receptor de andrógenos (AR), y este efecto se inhibe por los antiandrógenos tales como la bicalutamida [27]. Además, el miR-21 se puede regular la expresión de AR durante el desarrollo del cáncer de próstata [28]. Nuestros estudios muestran que miR-21 promueve el crecimiento de células de cáncer de próstata mediante la regulación negativa de la expresión de PDCD4. Por lo tanto, AR puede ser el objetivo común de IL-6 y miR-21 en el cáncer de próstata, con miR-21 juega un papel de intermediario en la activación de IL-6 para regular la expresión PDCD4. Además, la IL-6 afecta a la expresión PDCD4 durante todo el desarrollo del cáncer de próstata en tanto andrógeno-dependientes de cáncer de próstata y el cáncer de próstata independiente de andrógenos.
Conclusiones
Este estudio proporciona datos experimentales para impulsar los esfuerzos futuros en la terapia génica del cáncer de próstata y el diagnóstico que se basa en la IL-6, miR-21, y PDCD4.
Reconocimientos
agradecemos al Dr. Yuan Zhiwei para ayudar con el análisis inmunohistoquímico.