Extracto
Antecedentes
La falta de biomarcadores predictivos fiables es un obstáculo para el tratamiento del cáncer de próstata (CaP). El antígeno prostático específico (PSA), ampliamente utilizado en clínicas tiene varias advertencias como un biomarcador de la PAC. pacientes con NAC afroamericanas tienen mal pronóstico que los caucásicos, y en particular el suero PSA no logra buenos resultados en este grupo. Además, algunos hombres con niveles séricos bajos de PSA pasan desapercibidos para el casquillo hasta que desarrollan la enfermedad. Por lo tanto, hay una necesidad de identificar un biomarcador de diagnóstico y predictivo fiable de la tapa. Aquí, mostramos que la proteína de las células madre es IMC1 secretor y podría explorarse para el uso de biomarcadores en pacientes con NAC.
Metodología /Principales conclusiones
análisis
semi-cuantitativa de IMC1 se llevó a cabo en los tejidos prostáticos del vagabundo (autóctona modelo de ratón transgénico), los pacientes con NAC humanos, y en modelos basados en células normales y que representan fenotipos diferentes de la PAC en los hombres afroamericanos y caucásicos, mediante el empleo de técnicas de inmunohistoquímica, inmunotransferencia y Slot-Blot. El análisis cuantitativo de IMC1 y PSA se realizaron en la sangre y la cultura-medio de células transfectadas con siRNA no transfectadas y mediante el empleo de ELISA. proteína BMI1 es (i) secretada por las células de CaP, (ii) aumento en la región apical de las células epiteliales y del estroma región en los tumores prostáticos, y (iii) detectado en la sangre humana. IMC1 es detectable en la sangre de pacientes con NAC en un orden creciente de la etapa del tumor, exhiben una correlación positiva con suero PSA y lo más importante es detectable en los pacientes que presentan bajas concentraciones séricas de PSA. La importancia clínica de IMC1 como biomarcador puede determinarse a partir de la observación de que la PAC células segregan esta proteína en niveles más altos que las células representante de la hiperplasia prostática benigna (HPB).
Conclusiones /Importancia
IMC1 podía ser desarrollado como una doble bio-marcador (suero y biopsia) para el diagnóstico y pronóstico de la NAC en hombres caucásicos y afroamericanos. Aunque obligando a estos datos justifican investigaciones adicionales en una cohorte de pacientes afroamericanos
Visto:. Siddique HR, pArray A, Zhong W, Karnes RJ, Bergstralh EJ, Koochekpour S, et al. (2013) IMC1, factor de células madre Actuando como Novel Serum-biomarcador de raza caucásica y el cáncer de próstata afroamericana. PLoS ONE 8 (1): e52993. doi: 10.1371 /journal.pone.0052993
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de octubre de 2012; Aceptado: 27 Noviembre 2012; Publicado: 7 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Siddique et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Departamento de Defensa CDMRP conceder W81XWH-08-1-0605 al autor correspondiente. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
de acuerdo con la Sociedad Americana del cáncer, 241.740 serán diagnosticados con cáncer de próstata (CaP) y se proyectaron 28.170 pacientes con NAC de morir en el año 2012 en EE.UU. por sí solas [1]. El resultado insatisfactorio de gestión general (estrategias de tratamiento y el seguimiento pronóstico) para la enfermedad tope podría estar asociada a la falta de un pronóstico suero biomarcador fiable. Aunque ampliamente utilizado, varias advertencias importantes han sido reportados en suero PSA como un biomarcador de pronóstico [2]. Por ejemplo, en algunos casos de CaP, suero de PSA es (a) detectaron poca o ninguna, (b) carece de sensibilidad adecuada, y (c) no consigue discriminar los cánceres potencialmente significativos y los insignificantes [2] - [4]. PSA no refleja la biología del cáncer y un alto riesgo de resultados erróneos [5] - [6]. Además, las discrepancias en el PSA como marcador diagnóstico entre los diferentes grupos raciales, como los caucásicos y afroamericanos han confundido la gestión de este tipo de cáncer [6] - [7]. Por lo tanto, persiste una gran necesidad para el desarrollo de mejores biomarcadores serológicos en Cap, que es confiable para el pronóstico y el diagnóstico en pacientes caucásicos y afroamericanos.
Cada vez hay más pruebas de que (PcG) proteínas del grupo Polycomb juegan un papel crucial papel en el desarrollo del cáncer y la enfermedad de recurrencia [8]. -B-célula específica Moloney virus de leucemia murina sitio de integración 1 (BMI1) es un marcador bien conocido usado en la biología de células madre [8] - [9]. BMI1 que tiene un patrón de ubicuo de expresión en casi todos los tejidos es frecuentemente upregulated en varios tipos de cánceres humanos [8] - [10]. Recientemente hemos revisado importancia de IMC1 en el surgimiento de la quimio-resistencia en diversos tipos de cáncer incluyendo el CaP [8]. El presente estudio es la primera evidencia clínica que demuestra que IMC1 es una proteína secretora que tiene un enorme potencial para ser desarrollado como un suero biomarcador de la PAC y su pronóstico de población, tanto de raza caucásica y afroamericana. Sugerimos que el suero-IMC1 como biomarcador sería un mejor desempeño que el PSA. Además, BMI1 podría ser utilizado como una doble biomarcador en suero, así como biopsia.
Materiales y Métodos
tejidos de la próstata y muestras de suero de pacientes humanos de CaP
tejidos prostáticos quirúrgicamente recolectadas de los pacientes con NAC humanos y la búsqueda de los bloques de parafina se adquirieron a partir de tejido humano Cooperativa Red División del Medio Oeste, la Universidad Estatal de Ohio (Columbus, OH). Las muestras de suero de pacientes con NAC humanos se obtienen de los bancos de suero (BioServe, Beltsville, MD). secciones incluidas en parafina adicionales de tejidos de próstata humanos de 70 pacientes con adenocarcinoma normal y se obtuvieron de la ISU Abxis Co. Ltd., (Seúl, Corea del Sur).
Líneas Celulares
Las líneas celulares originado a partir de se utilizaron ambos Mans estadounidenses caucásicos y africanos en nuestro estudio. de próstata línea celular epitelial normal y inmortalizado (RWPE1), líneas de células de CaP (LNCaP, C42b, PC3, Du145, VCAP y PCA-2b), miofibroblastos del estroma prostático (WPMY1), colon células epiteliales normales (FHC) y líneas celulares de cáncer de colon ( SW480, HCT116 y HT29) y líneas celulares de carcinoma pancreático humano y Panc1 AsPC1 se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA). células epiteliales ductales pancreáticas normales, premaligna Kras mutante E6E7-Ras y células malignas KRAS mutado E6E7-Kras-st se obtuvieron de D. Paul M. Campbell (H. Lee Moffitt Cancer Center, Tampa, FL) [11]. células de HPB-1 se adquirieron del Dr. Simon Hayward (Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN) que los desarrolló como se describe [12]. Establecimiento y caracterización de células RC77N /E, RC77T /E y E006 se describió anteriormente [13] - [14]. Las células fueron cultivadas en el medio adecuado suplementado con 10% FBS (ATCC, Manassas, VA) y 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) en condiciones estándar de cultivo celular de 5% de CO
2 en una incubadora a 37 ° C.
Selección de la célula
(a) Las células de raza blanca: RWPE1 (normal), HPB-1 (hiperplasia no maligna) y, LNCaP, C4-2B, PC-3, y Du145 VCAP que representa el cáncer de próstata Europeo. También se utilizaron WPMYI1 los fibroblastos del estroma. (B) Las células afroamericanos:. RC77N /E (normal), y RC77T /E, el CP-2B, que representa el cáncer de próstata E006 afroamericano
Anticuerpo, plásmidos y siRNA
monoclonal anti IMC1 anticuerpos se adquirieron de Millipore (Temecula, CA). pBabe-IMC1 plásmido (IMC1 con sobreexpresión) fue una especie de regalo del doctor Chi Dang V. (La Universidad John Hopkins, Baltimore, MD). . Bmi1-siRNAs fueron adquiridos comercialmente de Dharmacon (Lafayette, CO)
La inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica se realizó tal como se describe anteriormente [15] - [16]. Brevemente, las secciones de parafina (para ser evaluados para BMI1) se trataron previamente con tampón de citrato (pH 6) durante 10 min en un horno de microondas para la recuperación de antígeno. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario (anti-BMI1) a una dilución de 1:50 durante 12 horas a 4 ° C. Los portaobjetos se incubaron a continuación durante 2 h a temperatura ambiente con anticuerpo secundario conjugado a HRP apropiado. Los portaobjetos se desarrolla en 3, 3'-diaminobencideno (DAB kit, Invitrogen, Carlsbad, CA) y el contador se tiñeron con hematoxilina. Los portaobjetos teñidos se deshidrataron y se montaron en solución Permount bajo cubierta se desliza
Análisis de Western blot
Las inmunotransferencias se realizó el análisis como se describe anteriormente [16] -. [17]. Brevemente, los lisados de células se prepararon en tampón de lisis frío [(0,05 mmol /L de Tris-HCl, 0,15 mmol /L de NaCl, 1 mol /L EGTA, 1 mol /L EDTA, 20 mmol /L NaF, 100 mmol /L Na
3VO4, 0,5% NP-40, 1% de Triton X-100, 1 mol /L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (pH 7,4)] con cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Indianapolis, IN). se recogió y se almacenó a -80 El lisado ° C. el contenido de proteína en los lisados se midió mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL), según el protocolo del proveedor. Para el análisis Western blot, 40 g de proteína se resolvió en 10% de geles de SDS-PAGE, se transfirieron a PVDF membranas (Millipore, Bedford, MA) y posteriormente se incubaron en tampón de bloqueo (5% de leche en polvo sin grasa /1% de Tween 20; en 20 mmol /L TBS, pH 7,6). durante 2 horas Los blots se incubaron con BMI1 anticuerpo primario, se lavó y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP (Sigma, San Louise, MO). las transferencias se detectaron con quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). la igualdad de carga de la proteína se confirmó por extracción de los borrones y re-sondeo con β-actina (Sigma, St. Louis, MO). Se realizaron mediciones de densitometría de las bandas escaneadas como se describe anteriormente [16].
detección de la proteína en cultivo celular medios
se les permitió
Las células a crecer hasta el 80% de confluencia en medio completo. A nivel de confluencia 80%, los medios se desechó y las células se lavaron con PBS dos veces. Después del lavado, se añadieron las células con medio libre de suero. Las células fueron cultivadas en medio libre de suero durante 24 h. Después de 24 h, se recogió el medio y se analizó para proteína secretora BMI1 mediante el uso de ensayo de Immuno-Slot-blot. El ensayo Slot-blot se realizó según el protocolo del fabricante (Whatman, Florham Park, Nueva Jersey). Brevemente, el aparato Slot-blot fue montado utilizando papel de filtro Whatman y una membrana de nitrocelulosa prehumedecido. A continuación, el aparato se conectó a una bomba de vacío. Las ranuras se llenaron de muestras (media /suero) y luego dibujados por vacío (las ranuras no utilizadas se llenaron con PBS). Las membranas se bloquearon a continuación durante 2 h en tampón de bloqueo (5% leche en polvo desnatada). Las transferencias se incubaron con anticuerpo primario BMI1, se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP (Sigma, San Louise, MO). Las transferencias se detectaron con quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham Biosciences).
Eliminación de la albúmina a partir de muestras de suero
albúmina fue retirado de muestras de suero humano mediante el uso de albúmina kit de eliminación (Pierce, Rockford, IL ) según el protocolo del proveedor. Las muestras que contienen 1,000 g de proteína total se cargaron en un solo disco de eliminación, donde se informa cada disco para tener una capacidad de unión de & gt;. 2 mg de albúmina de
Estimación de los niveles de proteína PSA por ELISA
Esto se realizó mediante el uso humano-PSA ELISA específico (Anogen, Ontario, Canadá) según el protocolo del proveedor.
la cuantificación de la proteína secretora IMC1 en medios de cultivo
Esto se realizó mediante el uso de una IMC1-ELISA específico (Anticuerpos-Online Inc., Atlanta, GA). proteína BMI1 recombinante se utilizó para servir como estándar para este ensayo.
BMI1-siRNA y pBabe-BMI1 (BMI1-expresión de plásmido) de la transfección para validar que BMI1 es, en efecto secretada por las células de CaP
transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) según el protocolo del proveedor. Por esta razón, en primer lugar IMC1 intracelular de raza caucásica de cabeza (LNCaP y Du145) y africana americana CaP (E006) se determinó células epiteliales.
Bajo 1
enfoque st.
IMC1 fue eliminado por shRNA en las células americanos caucásicos y africanos. 12 h después de la transfección, las células fueron cultivadas en medio completo durante 12 h. Después de 24 h después de la transfección, los medios se desechó y las células se cultivaron en medio libre de suero durante 24 h. Después de 24 h, se recogió medio libre de suero de células desmontables-IMC1 y los niveles secretados-Bmi1 se midieron por ELISA.
Bajo 2
nd enfoque.
células de cáncer de próstata que representan Europeo y la enfermedad afroamericano se transfectaron con el plásmido IMC1 sobreexpresan. 12 h después de la transfección, las células fueron cultivadas en medio completo durante 12 h. Después de 24 h después de la transfección, los medios se desechó y las células se cultivaron en medio libre de suero durante 24 h. Después de 24 h, se recogió medio libre de suero de células que sobreexpresan IMC1 y los niveles secretados-Bmi1 se midieron por ELISA.
tratamiento de andrógenos de las células
Por esta razón, caucásico y africano Americana de próstata células epiteliales fueron tratadas con análogo de andrógenos (R1881) durante 12 h. Después de 12 h, los medios se desechó y las células fueron cultivadas en más 12 h. Después de 24 h, las células fueron recolectadas para ser evaluados para la expresión intracelular IMC1 por Western blot.
Los análisis estadísticos
Síntesis gráfica de la distribución de la intensidad de la tinción se realizaron utilizando gráficos de dispersión y gráficos de caja. egression métodos y correlación lineal simple fueron el uso para evaluar las asociaciones entre IMC1, PSA y el rango de cabeza (1 = normal, 2 = Fase II, 3 = Etapa III, 4 = Fase IV). Para corregir la asimetría, BMI1 y PSA se analizaron en una escala log (Base2). Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Bmi1 los niveles de proteína en los tejidos prostáticos aumenta con etapas progresivas de la enfermedad en modelos transgénicos de ratón TRAMP
Glinsky et al. [18] previamente mostró que la proteína Bmi1 está elevado en los tejidos prostáticos de ratones TRAMP, un modelo de ratón autóctona de desarrollo CaP, se investigó si un aumento progresivo en los niveles de Bmi1 en tejidos prostáticos se pudo detectar durante la edad progresiva de CaP. Para este fin se utilizó muestras de tejidos prostáticos recolectados a diferentes edades de los ratones transgénicos TRAMP. Como se muestra en la figura 1A; Se observó la proteína Bmi1 que se detecta en todas las edades de los ratones TRAMP. En general, la tinción fue fuerte en las células epiteliales prostáticas a partir de ratones más viejos que en las células epiteliales prostáticas de los ratones más jóvenes. Las células musculares lisas tienen tinción mucho más fuerte que las células de fibroblastos. El patrón de tinción de la proteína Bmi1 se comparó en edad 17 semanas a 45 semanas de edad especímenes de próstata (Fig. 1A). Estos datos mostraron un incremento en los niveles de expresión de la proteína Bmi1 en la próstata de los ratones más viejos de edad (fig. 1A). Hubo una intensa coloración en la región apical de las células epiteliales. Se han observado las regiones del estroma tener una tinción positiva (fig. 1A).
Las microfotografías (A) representan la inmunotinción de IMC1 en tejidos prostáticos de ratones transgénicos TRAMP. Las flechas indican la tinción para BMI1. Magnificación × 40. (Bi) Las fotomicrografías muestran regiones neoplásicas y no neoplásicas IMC1-positivos de las piezas de próstata de pacientes con NAC según la evaluación de la inmunotinción. Las flechas indican la tinción para BMI1. Magnificación × 40. (Bii) Los diagramas de caja para la proteína IMC1 en base a la puntuación pertenecen al patrón en muestras normales y Cap inmunotinción en la región del estroma *, P & lt;. 0,05; barra de negro en la caja, valores de la mediana.
IMC1 expresión de la proteína en muestras de tejido prostático de pacientes CaP
En particular, algunas células epiteliales de las células epiteliales de la próstata del ratón transgénico mostró tinción apical densa lo que sugiere que Bmi1 podría ser una proteína secretora. A continuación identificamos la expresión de IMC1 en muestras de CaP humanos mediante análisis inmunohistoquímico y se determinaron sus niveles de expresión en las regiones del estroma de 70 muestras de pares emparejados de la tapa normal y que representan todas las etapas del tumor. La intensidad de la tinción de inmunoperoxidasa para BMI1 se puntuó como 0 (negativo), 1 (débil), 2 (moderada) y 3 (fuerte). Inmunotinciones mostraron tinción tanto en estroma no neoplásicas y neoplásicas. En general, la tinción fue fuerte en el estroma neoplásica que en estroma no neoplásico. Las células epiteliales también mostraron tinción positiva para el anticuerpo (Fig. 1Bi). Las células musculares lisas tienen tinción mucho más fuerte (3) que las células de fibroblastos (0-1 +). El patrón de tinción de la proteína IMC1 se comparó en la fase II-IV especímenes de cabeza (Fig. 1BI). Estos datos mostraron un incremento en los niveles de expresión de proteínas en IMC1 tumor de alto grado en cáncer de próstata humano (Fig. 1Bi). Los diagramas de caja de los datos de expresión de la proteína BMI1 en el estroma exhibieron una variación inter-muestra amplia en muestras de cáncer, en comparación con los tejidos normales y reveló una diferencia significativa en el nivel de proteína entre los tejidos normales y la tapa (p & lt;. 0.05, Fig 1Bii ). La puntuación media de la intensidad de la tinción de IMC1 en el estroma de los tejidos normales fue de 0,81 ± 0,07 (n = 70), y fue significativamente más baja que la etapa de alto grado II (1,8 ± 0,08; n = 36), en estadio III (2,26 ± 0,10 n = 28) y de la etapa IV (2,8 ± 0,11; n = 6) muestras de cáncer (Fig 1Bii;. p & lt; 0,05). Se observó un patrón similar de tinción en muestras de CaP par de concordancia en el epitelio de las muestras de próstata. Tomados en conjunto, estos datos muestran que la expresión de Bmi1 aumenta al aumentar la etapa de la PAC.
IMC1 expresión en las células prostáticas normales y neoplásicas que representan las enfermedades CaP en hombres caucásicos
Como un intento hacia la identificación de la expresión de IMC1 en la progresión del CaP, primero mide los niveles de expresión de proteínas por análisis de inmunotransferencia en varias líneas humanas caucásicas de células de CaP, LNCaP, Du145 y PC3 y los comparó con NHPE (células epiteliales normales de la próstata primario) y RWPE1 (en representación de las células epiteliales prostáticas normales inmortalizadas) , respectivamente. Entre las líneas celulares utilizadas CaP, LNCaP es dependiente de andrógenos, mientras que Du145 y PC3 son independientes de los andrógenos. La elección de estas células se basa en el hecho de que 80% de los pacientes de CaP se presentan con enfermedad dependiente de andrógenos en el momento del diagnóstico que posteriormente se transforma en una enfermedad más agresiva, independiente de andrógenos [19]. Como se muestra en la Figura 2 (Ai-ii), todas las líneas celulares CaP mostraron una mayor expresión de la proteína BMI1 que en las células epiteliales de próstata normales. Cuando se comparó la expresión de la proteína de BMI1, basado en el análisis densitométrico de las inmunotransferencias, células PC3 altamente agresivos y Du145 exhibieron una mayor expresión que en las células LNCaP (Fig. 2AII). Curiosamente, también se detectó la expresión IMC1 en las células del estroma de la próstata (WPMY1) (Fig. 2AI-ii). Curiosamente, se encontró que la expresión IMC1 a ser muy baja en las células epiteliales de la próstata que representan la condición hiperplasia benigna de próstata (HBP) (datos no mostrados).
(Ai) La figura representa el nivel de proteína en las células normales IMC1 y gorro de origen caucásico como se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia. La igualdad de carga de proteínas fue confirmada por inmunotransferencia reprobing para β-actina. La mancha se muestra aquí son representativos de tres muestras. (AII) Histograma que muestra el análisis de densitometría de inmunotransferencias de IMC1. *, P & lt; 0,05; barra de negro en el cuadro gris, valores de la mediana. (Bi) La figura representa el nivel de proteína en las células normales IMC1 y Cap de origen afroamericano como se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia. La igualdad de carga de proteínas fue confirmada por inmunotransferencia reprobing para β-actina. Las transferencias que se muestran aquí son representativos de tres muestras. (Bii) Histograma que muestra el análisis de densitometría de inmunotransferencias de IMC1. *, P & lt; 0,05; barra de negro en el cuadro gris, valores de la mediana. (C) La figura representa la detección de BMI1 en medio de cultivo condicionado de las diferentes células tal como se evaluó por análisis de Slot-blot. Los datos blots se muestran aquí son representativos de tres muestras. (D) Detección de la proteína BMI1 secretada en medio de cultivo condicionado de células. Cada barra del histograma representa la media ± SE de 3 experimentos independientes, * representa p. & Lt; 0,05
IMC1 expresión en las células prostáticas normales y neoplásicas que representa la enfermedad de la PAC en los hombres África-América
los datos ajustados a la edad de estudio SEER mostró que los hombres afroamericanos tienen un 60% más alta incidencia y mortalidad del 125% más altos de la tapa que los hombres caucásicos [1], [13]. La raza y los antecedentes familiares son los dos factores de riesgo más ampliamente aceptados para esta enfermedad [1]. La comprensión de los mecanismos biológicos subyacentes responsables de la progresión del CaP el tiempo dará lugar al desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces. Se determinó los niveles de expresión IMC1 en un modelo in vitro que representan diferentes fenotipos de la enfermedad de la PAC en los hombres afroamericanos basado en células. Estos incluyen RC77N /E (en representación de las células epiteliales prostáticas normales en hombres afroamericanos), RC77T /E (en representación de las células epiteliales prostáticas tumorigénicas andrógeno-dependientes), E006 (que representa las células epiteliales prostáticas no tumorigénicas andrógeno-dependientes) y el CP-2b ( representa fenotipo CRPC, sin embargo retienen la capacidad de respuesta de andrógenos) [13] - [14]. Como se muestra en la Figura 2 (Bi-ii), todas las líneas celulares CaP RC77T /E, PCa2b y E006 exhibieron una mayor expresión de la proteína BMI1 que en las células normales RC77N /E. Estos datos (Fig. 2A-B) sugieren una posibilidad de que la expresión de la proteína BMI1 intracelular puede ser correlacionada con los niveles de secreción Bmi1 en los tejidos humanos y puede desempeñar un papel en la agresividad del CaP humano.
BMI1 es un secretora proteína: Detección en medio libre de suero de cultivos de células de CaP
la presencia de BMI1 en la región apical de las células epiteliales de la próstata y región estromal nos llevó a formular la hipótesis de que podría ser una proteína secretora en la naturaleza. Para probar nuestra hipótesis nos preguntamos si IMC1 es secretada por las células tumorales bajo condiciones de cultivo. Con el fin de detectar la proteína IMC1 en medios de cultivo de células de CaP, se empleó la técnica de Slot-blot. Las células en un nivel de confluencia de 80% se dejaron crecer en medio libre de suero fresco durante 24 h. Como es evidente de la Fig. 2C, medio libre de suero (cosechado de la tapa de cultivo de células) dio positivo para la proteína IMC1. En particular, los medios de comunicación recogidos a partir de cultivos de células epiteliales representante de condición normal y HBP exhiben muy baja en proteínas IMC1 (Fig. 2C).
La cuantificación de secretora IMC1 en medios de cultivo de células que representan PAC en hombres caucásicos y afroamericanos
mediante el empleo de una técnica IMC1-ELISA específico humano, hemos sido capaces de detectar y cuantificar la proteína IMC1 secretada por las células que representan PAC en hombres caucásicos y afroamericanos (Fig. 2D). Se determinó secretada niveles BMI1protein (a) en el medio de cultivo de BPH1 normal, y (b) en el medio de cultivo de las células tumorales que representan diversos tipos de cáncer. BMI1 se detectó en los medios de cultivo de las células normales de la próstata (RWPE1; 0,45 ng /ml de medio) y de manera interesante los niveles de BMI1 no estaban elevados en células BPH1 (Fig 2D.). En comparación con las células normales RWPE1, las células de CaP exhibieron aumento de los niveles de secreción de proteínas Bmi1 en los medios (Fig. 2D). LNCaP, se observaron C42b, PC3 y DU145 células para secretar la proteína BMI1 en un rango de 1.3-3.4 ng /ml de medios de comunicación (Fig. 2D). Es de destacar que BMI1 secretada se observó proteína en el medio de cultivo libre de suero de todos los tipos de líneas de células de CaP que representa de RWPE1 normal a LNCaP menor agresivo para el cáncer de próstata (CRPC) las células resistentes a la castración C42b través de las células Du145 y PC3 altamente agresivos. Este resultado corrobora con los datos obtenidos pacientes CaP que representan etapas progresivas de la enfermedad que se analizaron para los niveles de proteína de suero-Bmi1. En particular, los medios recogidos de los cultivos de células epiteliales E006 (derivada de paciente CaP afroamericano) exhibió significativamente alta en proteínas BMI1 (Fig. 2D). Por el contrario, los medios de cultivo de las células del estroma de la próstata (WPMY1), las células epiteliales normales de colon (FHC) y células epiteliales normales ductales pancreáticas (PDE) no exhibió ningún nivel Bmi1 secretadas (datos no mostrados). Curiosamente, los niveles Bmi1 secretadas fueron de no ser observados en todos los tipos de páncreas (Kras-mutante PDE, E6E7-Ras y E6E7-Ras-st) y líneas celulares de carcinoma de colon (SW480, HCT116), pero sólo en líneas de células pancreáticas altamente agresivos AsPC1 (en niveles muy bajos; datos no mostrados) y las células HT29 de colon (datos no mostrados). Los datos de ELISA de secretora IMC1 se ajusta a nuestras observaciones en el análisis de muestras de tejido immunhistochemical capitalización en las que se observó un aumento de la tinción del estroma de la proteína IMC1. Este sería el primer informe que muestra IMC1 como una proteína secretora de las células tumorales.
secretada IMC1 en el medio de cultivo está directamente relacionado con intracelular de las células tumorales IMC1
Desde que se observó IMC1 para secretar en los medios de cultivo, hemos tratado de determinar si esta secreción se relaciona con intracelular IMC1. Se empleó un enfoque de dos vías donde se IMC1 ya sea derribado o sobreexpresado en células de CaP. Después de 24 h después de la transfección, BMI1-suprimida y células sobreexpresados-BMI1 se cultivaron en el medio libre de suero durante otras 24 h. A continuación, se recogieron los medios libres de suero a partir de cultivos de células transfectadas y se analizaron para la proteína IMC empleando un ELISA. Se observaron niveles de proteína Bmi1 a ser muy reducida en las células abatidos-BMI1 y el aumento en las células sobreexpresados-BMI1 (Fig 3A-F;. p & lt; 0,05). Estos datos muestran que las células tumorales BMI1 silenciados secretan significativamente los niveles bajos de proteína BMI1 y las células de CaP sobreexpresados-BMI1 secretadas significativamente altos niveles de proteína BMI1 en los medios de cultivo, los datos sugieren que intracelular BMI1 se correlaciona directamente con los niveles de secreción de proteínas BMI1 ( Fig 3A-F;. p & lt; 0,05). Los autores especulan que el aumento en los niveles intracelulares Bmi1 en las células de CaP asciende a su posterior liberación por las células epiteliales en el espacio extracelular y provoca un aumento en los niveles de secreción de proteínas Bmi1.
(A-F) La figura representa el efecto de (a-C) BMI1-silenciamiento y (D-F) BM11-sobreexpresión en el nivel de proteína BMI1 secretada en los medios condicional de diferentes células tal como se evaluó mediante el ensayo ELISA. La igualdad de carga de proteínas fue confirmada por reprobing inmunotransferencias para β-actina. Cada barra del histograma representa la media ± SE de 3 experimentos independientes, * representa P & lt; 0,05. (Gi) Figura representa el nivel de proteína en BMI1 de andrógenos (R1881) tratados y las células de CaP no tratado tal como se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia. La igualdad de carga de proteínas fue confirmada por inmunotransferencia reprobing para β-actina. (GII) Histograma que muestra el análisis de densitometría de inmunotransferencias de IMC1. *, P & lt; 0,05; barra de negro en el cuadro gris, valores de la mediana.
IMC1 expresión en las células que representan PAC en hombres caucásicos y afroamericanos es independiente de la influencia de los andrógenos
Las diferencias entre razas en las concentraciones de andrógenos y la sensibilidad son considerados como factores importantes para las disparidades raciales en cáncer de próstata [20]. Sin embargo, las concentraciones de andrógenos no siempre se correlacionan con PSA en pacientes con cáncer y, a veces inducen a error al resultado [21]. A continuación pregunta si los niveles Bmi1 en los seres humanos Cap enfermedad tiene una correlación con la presencia o ausencia de andrógenos. Para este fin se seleccionaron VCAP (en representación independiente de los andrógenos fenotipo CRPC en población caucásica), E006 (con una población que representa las células epiteliales prostáticas no tumorigénicas andrógeno-dependientes de afroamericana) y CP-2b (la capacidad de respuesta de andrógenos células CRPC de población afroamericana ). tratamiento con andrógenos (R1881; 1 nM) de VCAP, E006, y PCa-2b células no causaron cambios significativos en los niveles de proteína BMI1 (Fig 3GI-ii;. p & lt; 0,05) lo que sugiere que la expresión BMI1 es independiente del estado de andrógenos . Estos datos son significativos porque CaP agresivo en ambos caucásica y afroamericana es a menudo independiente de andrógenos [6], [19].
Detección de proteínas en la sangre IMC1 de Cap humanos pacientes
Dado que, se observó proteína BMI1 para ser secretada por las células epiteliales prostáticas humanas in vitro. A continuación pregunta si IMC1 se pudo detectar en el suero de pacientes con NAC. Mediante el empleo de análisis Slot-blot, a fin de determinar los niveles de proteína en el suero IMC1 aclarado sin albúmina, preparados a partir de sangre humana (seleccionados al azar de lo normal y los pacientes CaP). Como se desprende de la Fig. 4A, se detectó proteína BMI1 en el suero de pacientes con NAC.
(A) figura representa la detección de BMI1 en suero humano tal como se evaluó por análisis de Slot-blot. Los datos de transferencia que se muestran aquí son representativos de tres muestras. (B) Parcela de IMC1 (ng /ml, log-2) frente al rango de grupo de cabeza (n = 58). La línea horizontal es la media del grupo. (C) Parcela de PSA (ng /ml, log-2) frente al rango de grupo de cabeza (n = 58). La línea horizontal es la media del grupo. Cada grupo (Fig F & amp;. G) representa como 1 = normal, 2 = Fase II, 3 = Etapa III, y 4 = Etapa IV tapa. (D) La figura representa la correlación entre el suero PSA (ng /ml, log-2) y suero-IMC1 (ng /ml, log-2) (Spearman r = 0,58, p & lt; 0,001) en 58 hombres. Línea es de regresión lineal simple.
niveles de proteína de suero Bmi1 aumentan progresivamente con el desarrollo del CaP en pacientes humanos
A continuación pregunta si los niveles de proteína de suero-Bmi1 no son de importancia de la traducción como un potencial biomarcador para la estadificación de la enfermedad y el desarrollo de CaP en los seres humanos. Para este propósito se investigó si los niveles de proteína de suero-Bmi1 muestran una diferencia significativa con respecto a las diferentes etapas de la PAC. Se determinó los niveles de suero Bmi1 en una cohorte de 58 sujetos humanos que representan las enfermedades normales condición libre, y las etapas de CaP diferentes, a saber., Normal (n = 10), la Etapa II de cabeza (n = 16), Etapa III de cabeza (n = 15 ), y la etapa IV de cabeza (n = 17). Los niveles medios de proteína de suero-Bmi1 en sujetos humanos normales (n = 10) se estimaron en aproximadamente 1,72 ± 0,30 ng /ml de suero (Tabla 1). El nivel IMC1 suero para cada paciente se proporciona en la Tabla 2. Los niveles séricos-Bmi1 fueron menores en sujetos humanos normales que en los pacientes con NAC. los niveles de proteína en pacientes con NAC Bmi1 humanos fue 3,91 ± 0,60 ng /ml en fase II de CaP, 8.55 ± 1.95 ng /ml en fase III de CaP y 10,84 ± 2,44 ng /ml en la etapa IV de cabeza (Tabla 1). Estos datos mostraron que los niveles medios de proteína de suero-Bmi1 se aumentaron progresivamente con el aumento de etapa de la enfermedad en los seres humanos CaP (r = 0,72, p & lt; 0,001, Fig 4B.). Estos datos sugieren que los niveles de proteína de suero-Bmi1 poseen un potencial de traslación a desarrollarse como una novela suero biomarcador de la enfermedad CaP sin embargo otros estudios en una gran cohorte de pacientes están garantizados.
Suero -BMI1protein niveles se correlacionaron con los niveles de PSA sérico
a continuación se investigó si un aumento en IMC1 durante la evolución de CaP tiene una correlación con los niveles de PSA en estos pacientes (n = 58). En esta cohorte de pacientes con NAC, también se observó asociación de PSA con la progresión del CaP (r = 0,57, p & lt; 0,001, figura 4C.). El nivel de PSA en suero para cada paciente se proporciona en la Tabla 2. IMC1 se correlacionó moderadamente con PSA (r = 0,58, p & lt; 0,001, figura 4D.). IMC1 se mantuvo significativamente (p & lt; 0,001). Al ajustar por PSA en un modelo de regresión para predecir la fase de grupos del cáncer
Discusión
Un biomarcador pronóstico proporciona evidencia sobre los resultados eventuales de un paciente de una enfermedad independiente de una dada la terapia, mientras que un biomarcador predictivo-estima la probabilidad de respuesta /beneficio para una terapia específica en un contexto específico [22].