Extracto
El carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los principales tumores malignos en todo el mundo y se asocia con un mal pronóstico debido a la alta incidencia de metástasis y la recurrencia del tumor. Nuestro estudio anterior mostró que la sobreexpresión de p21-proteína quinasa activada 1 (PAK1) se observa con frecuencia en HCC y se asocia con un comportamiento del tumor más agresivo, lo que sugiere que PAK1 es una diana terapéutica potencial en HCC. En el estudio actual, una pequeña molécula inhibidor alostérico PAK1, IPA-3, se evaluó el potencial en la supresión de hepatocarcinogénesis. De acuerdo con otros informes, se observó inhibición de la actividad PAK1 en varias líneas celulares de HCC humanos tratados con varias dosis de IPA-3. El uso de la proliferación celular, la formación de colonias y ensayos de incorporación de BrdU, hemos demostrado que el tratamiento con IPA-3 inhibió significativamente el crecimiento de células de HCC. Los mecanismos mediante los cuales el tratamiento IPA-3 suprime el crecimiento celular HCC son la mejora de la apoptosis y el bloqueo de la activación de NF-kB. Además, nuestros datos sugieren que IPA-3 no sólo inhibe el crecimiento de células HCC, pero también suprime el potencial metastásico de células de HCC. ensayo de xenoinjerto de ratón desnudo demostró que el tratamiento IPA-3 redujo significativamente la tasa de crecimiento del tumor y la disminución de volumen del tumor, lo que indica que IPA-3 puede suprimir el
in vivo
el crecimiento del tumor de células de HCC. En conjunto, nuestros demostración del potencial de eficacia preclínica de IPA-3 en el CHC proporciona la base para la terapia del cáncer
Visto:. Wong LL-Y, Lam IP-Y, Wong TY-N, Lai WL, Liu HF, Yeung LL, et al. (2013) IPA-3 inhibe el crecimiento de células de cáncer de hígado mediante la supresión de PAK1 y NF-kB activación. PLoS ONE 8 (7): e68843. doi: 10.1371 /journal.pone.0068843
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Febrero, 2013; Aceptado: June 3, 2013; Publicado: July 19, 2013
Derechos de Autor © 2013 Wong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación de Hong Kong para el control de Enfermedades Infecciosas (Nº 09.080.782) y el Consejo de Investigación de subvención Hong Kong (HKU 7 /CRF /09), la Universidad de Hong Kong (Pequeño Financiación del proyecto 201109176021 a LLY Wong y YP Ching). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Dra. Yick-Pang Ching es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Como el sexto tumor maligno más frecuente y la tercera causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo, El carcinoma hepatocelular (HCC) es responsable de más de un millón de muertes al año [1]. HCC se asocia con un mal pronóstico debido a la alta incidencia de recurrencia tumoral y la metástasis [2]. La resección hepática es una de las principales terapias en la actualidad, pero sigue siendo insatisfactoria debido a las altas tasas de recurrencia [3]. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento para el HCC.
La sobreexpresión de p21-quinasa activada 1 (PAK1) es frecuente en HCC [4]. Es un efector aguas abajo de la pequeña GTPasa Rho, incluyendo Rac1 y Cdc42, que regula diversos procesos celulares, incluyendo la progresión del ciclo celular, la motilidad celular, la polaridad celular y la apoptosis [5]. Activado Rho GTPasa se une a PAK en el dominio Cdc42 /Rac interactiva de unión (CRIB), haciendo que el alivio del dominio autoinhibitory (AID), la autofosforilación posterior del dominio quinasa y la activación catalítica [6]. Entre los múltiples sitios de autofosforilación, treonina-423 (T423) es particularmente importante para contrarrestar autoinhibition y mantener el estado activado completa [7].
IPA-3 (2,2 'dihidroxi-1,1'- dinaphthyldisuifide) es altamente selectiva no ATP-inhibidor competitivo, alostérica de PAK1 cuya hiperactividad se ha demostrado estar estrechamente relacionado con la tumorigénesis [8]. Estudios anteriores demostraron que IPA-3 prevenirse autofosforilación PAK1 inducida por Cdc42 en T423 y PAK1 inhibió significativamente la actividad catalítica [8], [9]. La acción inhibidora de IPA-3 se logra en parte mediante la unión covalente al dominio regulador de PAK1 que a su vez impide que la interacción física con Cdc42 o otros activadores GTPasa [9]. IPA-3-focalización dominio regulador está menos conservada dentro de quinasas, por lo que confiere una notablemente alta selectividad para este inhibidor [8].
in vitro
estudios mostraron que el tratamiento con IPA-3 dio lugar a resultados similares a los de siRNA silenciamiento de PAK1, en el que IPA-3 bloqueados específicamente el transporte de membrana de WAVE2 y la formación lamelipodia en células de cáncer de mama humano [10], y inhibe la captación endocítica de serotipo de adenovirus humano 35 en diversas líneas de células [11]. Sin embargo, el efecto de IPA-3 en el tratamiento terapéutico de HCC humano aún es poco conocido. En este estudio, que tuvo como objetivo investigar el potencial de IPA-3 en la supresión de la proliferación y metástasis de las células de HCC humanos a través de una serie de
in vitro Opiniones y
in vivo
experimentos. Hemos demostrado que el tratamiento de IPA-3 tuvo un impacto significativo en la apoptosis, la proliferación y motilidad de las células de HCC. Además, IPA-3 fue capaz de suprimir la
el crecimiento del tumor in vivo en xenoinjertos de ratones desnudos. Por lo tanto, nuestros datos proporciona evidencias de apoyo para la posible aplicación de IPA-3 en la gestión de la tumorigénesis y metástasis de carcinoma hepatocelular.
Materiales y Métodos
Químicos
2,2 ' dihidroxi-1,1-dinaphthyldisuifide (IPA-3) fue sintetizado y suministrado por el Dr. LL Yeung en la Universidad de Hong Kong de Ciencia y Tecnología. La estructura de IPA-3 se confirmó por análisis de espectrometría de masas. Una solución madre de IPA-3 (100 mM) estaba recién preparado en DMSO. Otros productos químicos menos que se indique específicamente fueron de Sigma-Aldrich con la mayor calidad.
Cell Cultura y
células de HCC humano H2M, H2P y la línea inmortalizada hígado no tumorigénicos humanos MIHA eran del Dr. XY Guan, Departamento de Oncología Clínica, Universidad de Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong [12]. MHCC97L células y MHCC97H eran de Instituto del cáncer de hígado, de la Universidad de Fudan, Shanghai, China [13]. células HepG2 y Hep3B se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). SMMC-7721 y Bel-7402 fueron regalos de Shanghai Instituto de Bioquímica y Biología Celular de la Academia China de Ciencias. Todas las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco mínimo esencial (DMEM) con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS), piruvato sódico 1 mM y 100 U de penicilina /estreptomicina, a 37 ° C en 5% humidificado CO
2 incubadora.
MTT Ensayo
cuatro mil células H2M por pocillo fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se incubaron en condiciones normales durante 24 horas. Las células se trataron con diferentes concentraciones de IPA-3 para 1, y 2 días. Las células se trataron con 100 l de 5 mg /ml de (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) () solución Invitrogen durante 4 horas a 37 ° C hasta que los cristales eran formó. solución de MTT se eliminó de cada pocillo y se añadieron 100 l de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales. la intensidad del color se midió mediante lector de microplacas (Bio-Rad) a 570 nm. cada experimento consistió en cuatro repeticiones y al menos tres experimentos independientes se realizaron.
ensayo de proliferación celular
El método para ensayo de proliferación se describió anteriormente [4]. La mejor curva de crecimiento en forma y tiempo de duplicación se calcularon usando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , Inc., San Diego, CA). En pocas palabras, H2M (1 × 10
4), H2P (1 × 10
4), HepG2 (2 × 10
4), MHCC97L (1 × 10
4) o MIHA (2 × 10
4) las células se sembraron en placas de 6 pocillos que contienen medio completo en el Día 0. Cualquiera de control del vehículo (DMSO) o IPA-3 (5 ó 10 mM) se añadió a el medio en el Día 1. los medios de comunicación con o sin IPA-3 se actualiza en el Día 3 y 5. en los triplicados, se trypsinzed células y se contaron usando un contador de células en el día 3, 4, 6 y 7 para la construcción de la curva de crecimiento.
Formación de colonias ensayo
El ensayo se realizó como se describió anteriormente [14]. Brevemente, las células se sembraron a 200 células por pocillo en placas de 6 pocillos que contienen DMEM completo en el día 0. DMSO o IPA-3 (5 o 10 mM) se administró a los medios de comunicación, que fueron actualizados dos veces a la semana. En el Día 14, las colonias se fijaron con 3,7% de formaldehído durante 15 minutos y se tiñeron con 1% de cristal violeta antes de la cuantificación.
Ensayo de incorporación de BrdU
El ensayo se realizó como se describió anteriormente [15]. La proliferación celular se cuantificó por la medición de la incorporación de BrdU durante la síntesis de ADN con la proliferación celular ELISA, kit BrdU colorimétrico (Roche Diagnostics). El ensayo se realizó de acuerdo con el manual del fabricante. En resumen, en igual número de células H2M, H2P Miha, HepG2 o MHCC97L se sembró en placas de 96 pocillos y se privaron de suero durante la noche. Privación de suero de sincronización del ciclo celular inducida por lo que la mayoría de las células permanecen en la transición G1 /S justo antes de la entrada en la fase S. Las células se trataron después con DMSO o diversas concentraciones de IPA-3 (10 y 20 mM) durante 15 minutos, seguido de la reposición y BrdU etiquetado de FBS durante 2, 4 u 8 horas. La señal de etiquetado BrdU se cuantificó midiendo la absorbancia relativa (Abs
370 nm-Abs
492 nm). Cada ensayo se realizó por triplicado. Los experimentos se realizaron al menos tres veces de forma independiente.
Anexina V-7ADD tinción Ensayo
Detección de muerte celular por apoptosis se realizó usando el kit de detección de PE Anexina V Apoptosis I (BD Pharmingen). En triplicado, las células se sembraron H2M en el plato de 60 mm, privaron de suero durante la noche y después se trató con DMSO o IPA-3 (10 o 20 mM) en un medio que contiene suero durante 24 horas. Las células se lavaron flotantes, mientras que se trataron con tripsina, se aclararon y se volvieron a suspender en tampón de unión de las células unidas. Después de la tinción con anexina V-PE y 7-AAD, las muestras se analizaron inmediatamente por citometría de flujo. Excitación: 488 nm (anexina V-PE y 7-AAD). Emisión: 578 nm (anexina V-PE), 675 nm (7-AAD). Las células fueron contados por muestra y los datos se analizaron con WinMDI (Versión 2.8, Joe Trotter).
Microscopía Confocal
Después de tratamiento con fármacos, células o H2M H2P fueron fijadas en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos, se lava, y se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 en PBS durante 15 minutos [4], [15]. Los portaobjetos se tiñeron con TRITC-faloidina (Invitrogen) durante 10 minutos y las imágenes de inmunofluorescencia fue capturado en un microscopio de barrido láser confocal Zeiss LSM700 Carl.
Transwell migración Ensayo
ensayo de migración Transwell se realizó como se describe anteriormente [4]. Brevemente, H2M (1 × 10
5) células se sembraron en DMEM libre de suero en el compartimento superior y se añadió medio de suero complementado al compartimiento inferior de la cámara Transwell (Corning). En presencia o ausencia de IPA-3 (10 mM), se dejó que las células privadas de suero a migrar durante 24 horas. Las células fueron fijadas con formaldehído al 3,7%, se tiñeron con 1% de cristal violeta y se contaron bajo un campo microscópico en la magnificación de 40X. Tres campos diferentes fueron elegidos al azar para cada inserto.
cuantitativa transcripción inversa-PCR (qRT-PCR)
células H2M suero de hambre
fueron tratadas con o sin IPA-3 pretratamiento (10 o 20 M, 15 minutos), seguido por el TNF-α (10 o 20 ng /ml, 24 horas), la reposición de SFB y el cultivo de una noche. QRT-PCR se realizó como se describe anteriormente [4]. Brevemente, el ARN total se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc de primera cadena utilizando PrimeScript RT kit de reactivos (Takara, Japón). QPCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema SYBR verde en tiempo real (Takara, Japón) en un sistema de detección de PCR en tiempo real Mi IQTM2 (Bio-Rad). β-actina se utilizó como control interno y se dejó la normalización de las muestras. secuencias de ADN de los cebadores de PCR se listan en la Tabla S1. QRT-PCR se realizó por triplicado y se repitió tres veces.
Análisis Western Blot
La extracción de proteínas y Western Blot se realizaron como se describe anteriormente [4], [15]. La inmunotransferencia se realiza para PAK1, P-PAK1 (T423), PARP1, Paxilina, P-Paxilina (S178), SAPK /JNK, P-SAPK /JNK (T183 /Y185), se escindió de la caspasa 3 (Cell Signaling Technology), NF kappa B (Santa Cruz Biotechnology) y β-actina (Sigma-Aldrich), seguido de correspondiente con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (GE Healthcare). Las señales de las proteínas específicas se detectaron por Chemiluminsence mejorado (GE Healthcare). Las intensidades de las bandas de proteínas se analizaron usando Adobe Photoshop CS4.
Desnudo de ratón con xenoinjerto
MHCC97L células (1 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de 4 semanas de edad ratón desnudo masculino. El tamaño del tumor se calculó como se describe anteriormente [4]. Los ratones con tumores de un tamaño medio de 100 mm
3 fueron agrupados en cohortes de tratamiento. Un total de 15 ratones se usaron y se dividió en tres grupos (5 ratones por grupo): control (DMSO), IPA-3 (2 mg /kg) e IPA-3 (4 mg /kg). IPA-3 se formuló en DMSO y se administró tres veces por semana (TIW) (2 mg /kg o 4 mg /kg) por inyección intraperitoneal (i.p.) durante el estudio y el tamaño del tumor se registró dos veces a la semana. Los estudios en animales han sido aprobadas específicamente por animal (Control de los experimentos) Ordenanza Capítulo 340, el Departamento de Salud, Hong Kong Región Administrativa Especial (Ref .: (11-786) en DH /HA & amp; P /8/2/3 Pt. 33).
Análisis estadístico
Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se presentan como media ± desviación estándar. Estudiante de
t-test
se utilizó para el análisis estadístico, y los datos de más de dos grupos fueron analizados por análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) en GraphPad Prism 6 seguido de la prueba de Dunnett. Los resultados se consideraron significativos cuando
P
. & Lt; 0,05
Resultados
IPA-3 inhibe la actividad de PAK1
Se ha demostrado que las células de HCC que tienen un alto nivel endógeno PAK1, en particular en las líneas celulares altamente metastásicas HCC [4], como H2M, pero no en el no tumorigénicos, inmortalizan las células del hígado, MIHA (Fig. 1A). Para investigar el efecto de IPA-3 sobre el crecimiento de células H2M, se realizó el ensayo de MTT. ensayo MTT demostraron que IPA-3 suprime la proliferación de células H2M de maneras tiempo- y dependientes de la dosis (Fig. 1B). La media máxima concentración inhibitoria (IC
50) de IPA-3 en células H2M fue de alrededor de 28 mM y 21 mM en días 1 y 2, respectivamente. Para confirmar el efecto inhibidor de IPA-3 sobre la actividad de PAK1, las células fueron H2M privaron de suero y luego tratados con IPA-3 en medio completo durante la noche. El análisis de transferencia Western mostró que IPA-3 dependiente de la dosis redujo el nivel de fosforilación de PAK1 (Fig. 1C). Consistentemente, los resultados mostraron IPA-3 causa una disminución en la fosforilación PAK1 en asociación con una disminución en la viabilidad celular H2M. Además, la fosforilación del sustrato aguas abajo de PAK1, c-Jun N-terminal quinasa (JNK), también se redujo, más el apoyo a la reducción de actividad quinasa PAK1 por IPA-3 (Fig. 1C). luz examen microscópico de las células tratadas con IPA-3 reveló cambios morfológicos pronunciadas. Higo. 1D mostró los cambios morfológicos en las células H2M después de ser tratado con IPA-3. En altas dosis de IPA-3 (20 y 40 mM), una importante población de células H2M se convirtió en redadas y separado del plato.
(A) los niveles de proteína relativos de PAK1 en diversas líneas celulares. Las intensidades de señal de las bandas se cuantificaron y se normalizó mediante la adopción de ese nivel de MIHA como 1. (B) ensayo de MTT en el día 1 y 2. Las células H2M (4 x 10
3) se sembraron placas en 96 pocillos y se trataron con diferentes dosis de IPA-3. Las células se recogieron después de la incubación y el ensayo de MTT se realizó como se ha mencionado en Materiales y Método. El gráfico muestra el porcentaje de células viables representa frente a la dosis de IPA-3 (C) el análisis Western Blot de la P-PAK1, PAK1 total, el P-JNK y JNK total. H2M células privadas de suero se trataron con DMSO o IPA-3 a la concentración indicada durante 15 minutos y seguido por FBS reposición y el cultivo de una noche. (D) las células fueron H2M privaron de suero y se trataron con IPA-3 (10, 20 o 40 mM) en medio completo y se dejaron crecer durante la noche. Las imágenes de la morfología celular se capturaron con una ampliación de 40X. Barra de escala, de 0,4 mm.
IPA-3 suprime la proliferación de células de HCC
A fin de evaluar el efecto de la IPA-3 sobre la proliferación celular HCC, dos líneas celulares de HCC primarios, HepG2 y H2P, dos líneas celulares de la metástasis HCC ,. H2M y MHCC97L, y el, la línea de células hepáticas inmortalizadas no tumorigénicos, MIHA, fueron tratados por separado con diferentes dosis de IPA-3. En el ensayo de proliferación celular, el tratamiento de IPA-3 redujo significativamente el número de células de HCC metastásico (H2M y MHCC97L) y en menor medida por las células de HCC primaria (HepG2 y H2P), obtuvo de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2A ). Por el contrario, MIHA tenía la más alta quimiorresistencia a IPA-3, lo que sugiere que IPA-3 podría inhibir la proliferación de células de hepatoma con un poco efecto en los hepatocitos normales. Para confirmar el efecto de IPA-3, se recogieron los lisados celulares totales de células H2M en el Día 7 y se ensayaron para la inhibición PAK1 por análisis de transferencia Western. El resultado mostró que el tratamiento IPA-3 inhibió notablemente la fosforilación de activación de PAK1, lo que sugiere que IPA-3 inhibe la proliferación celular mediante la reducción de la actividad PAK1 (Complementario. Fig S1). Por ello, la reducción concomitante de la fosforilación de JNK, los objetivos de abajo PAK1, también se observó (Fig. S1). Para dilucidar si el mecanismo anti-proliferativa de IPA-3 en las células HepG2, H2P, H2M y MHCC97L era debido a una disminución en la entrada del ciclo celular, se realizó ensayo de marcaje con BrdU. Con el fin de lograr un efecto prominente de IPA-3, 10 M y una dosis más alta (20 mM) fueron utilizados para la investigación. Nuestros datos muestran que el tratamiento con IPA-3 en las células H2M y MHCC97L sincronizados resultó en una reducción significativa en la tasa de incorporación de BrdU, en comparación con el control de DMSO en modales tiempo- y dependientes de la dosis (Fig. 2B). Sin embargo, IPA-3 sólo tenía un efecto marginal sobre la proporción de incorporación de BrdU de células H2P y HepG2, lo que implica que IPA-3 es altamente específico para las líneas celulares de HCC metastásicos. Para confirmar aún más el efecto de IPA-3 en la supresión del crecimiento celular HCC, ensayo de formación de colonias se realizó mediante (MIHA), primaria (HepG2) y metastásico células (H2M) HCC no tumorigénicas. El resultado mostró que IPA-3 inhibió significativamente el crecimiento de células HepG2 y H2M, pero sólo tenía un efecto muy marginal en las células MIHA (Fig. 2C). , células notables MIHA, que tienen un muy bajo nivel endógeno de PAK1, no mostraron diferencias en la proliferación celular tras el tratamiento IPA-3. En conjunto, estos resultados indicaron que el tratamiento con IPA-3 suprime la proliferación de células HCC en un orden descendente de preferencia, metastásico HCC & gt; HCC primaria & gt;. No transformada hepatocitos, y de una manera PAK1 dependiente
(A ) El efecto de la IPA-3 en las tasas de proliferación celular de MIHA (, panel superior izquierdo), HepG2 (panel superior, media) H2P (panel superior, derecha), H2M (inferior, panel izquierdo) y MHCC97L (panel inferior, a la derecha ) Células. El análisis estadístico se realizó mediante la comparación con el valor del control de DMSO. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 (ANOVA). Los ensayos de etiquetado BrdU Miha (, panel superior izquierdo), HepG2 (panel superior, medio), H2P (panel superior, derecha), H2M (inferior, panel izquierdo) y células (MHCC97L inferior, panel derecho) (B). *
P Hotel & lt; 0,05 (ANOVA) en comparación con el control de DMSO. Las barras de error, media ± SD de muestras por triplicado. (C) las placas representativas de ensayo de formación de colonias de MIHA (panel izquierdo), HepG2 (panel central) y las células H2M (panel derecho). Gráfico de barras de ensayo de formación de colonias (panel inferior). *
P Hotel & lt; 0,001, **
P Hotel & lt; 0,01 (ANOVA) en comparación con el control de DMSO. Las barras de error, media ± SD de muestras por triplicado.
IPA-3 induce la apoptosis de las células de HCC
Para investigar si el IPA-3 afecta a la apoptosis en células de HCC, una anexina V-7ADD se realizó ensayo de tinción. Desde 10 mM IPA-3 inhibe la tasa de proliferación y una concentración más alta, es decir 20 mM provoca un resultado significativo en el ensayo de incorporación de BrdU en las células H2M, 10 mM y 20 mM fueron utilizados para investigar el efecto prominente de IPA-3. El resultado mostró que la incubación de células H2M con 20 mM IPA-3 dio lugar a un mayor porcentaje de células que muestran una señal positiva de la tinción de anexina V, en comparación con el control de DMSO, lo que sugiere que las células se sometieron a apoptosis bajo el tratamiento con IPA-3 ( Fig. 3A). Además, la actividad pro-apoptótica potencial de IPA-3 se examinó por la escisión de PARP1 y caspasa 3. Tratamiento de IPA-3 en células H2M resultó en un nivel atenuado de PARP en 20 M y la forma de escisión de PARP1 podría ser detectado en 40 mM (Fig. 3B). Esto fue acompañado con una reducción dependiente de la dosis de los niveles de fosforilación de PAK1 PAK1 (Fig. 3B). Además, el nivel de la caspasa 3 escindida aumentó de una manera dependiente de la dosis. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que IPA-3 induce apoptosis a través de la inhibición PAK1 en una alta concentración.
(A) ensayo de tinción con Anexina V-7ADD. Las señales de fluorescencia de la anexina V-PE y 7-AAD se detectaron con PE-A y Canales de pago Cy5-5-A, respectivamente (panel superior). El porcentaje de células teñidas con H2M anexina V-PE sólo bajo diferentes tratamientos se muestra en un gráfico de barras (panel inferior). *
P Hotel & lt; 0,001 (ANOVA) en comparación con el control de DMSO. (B) células H2M privadas de suero se trataron con dosis crecientes de IPA-3 junto con la reposición de suero durante 24 horas. Western Blot análisis de PARP1, fue realizado P-PAK1 (T423), PAK1 total y caspasa 3 escindida.
IPA-3 suprime la migración de células HCC
PAK1 tiene un papel destacado en la migración celular, sobre todo en la regulación de la formación de fibras de estrés y la rotación de las adhesiones focales. Por lo tanto, la tinción de inmunofluorescencia se realizó para investigar si IPA-3 puede influir en estos procesos. IPA-3 se encontró para mejorar la formación de fibras de estrés y adhesiones focales tanto en células H2M y H2P, que se visualizaron por las señales de inmuno-positivos faloidina y paxillin de fibras de estrés y adhesiones focales, mientras que el control DMSO mostró una débil y dispersa tinción. Además, los resultados mostraron que el tratamiento de IPA-3 mejora de forma significativa el número de complejos de adhesión focales en células H2M y H2P como se reveló mediante tinción paxillin (Fig. 4A). La fosforilación de paxilina en la serina-178 (S178) es importante para la migración PAK1-mediada por células, que se ha demostrado ser fosforilados por JNK [4], [16]. En las células H2M, la fosforilación de paxilina en S178 se redujo significativamente junto con un tratamiento durante la noche de IPA-3 (Fig. 4B). Por lo tanto, IPA-3 inhibe la señalización de la vía de PAK1 /JNK /paxillin. Además, un ensayo de migración Transwell se realizó para estudiar el efecto de IPA-3 en el
vitro
capacidad de migración de las células en H2M. Se encontró que el IPA-3 suprimió significativamente la migración de células H2M como el número de células migradas se redujo notablemente por 79%, en comparación con el control de DMSO (Fig. 4C). Tomados en conjunto, estos datos ilustran que IPA-3 reduce significativamente la movilidad celular PAK1 dependiente de células de HCC.
(A) expresión de la proteína paxilina se detectó por análisis de inmunofluorescencia en tratamiento IPA-3. células H2M y H2P (panel superior) se privaron de suero durante la noche y se trataron con cualquiera de los controles DMSO o IPA-3 (20 mM) durante 15 minutos, seguido de FBS reposición durante 10 minutos. señales de inmunofluorescencia de faloidina (rojo), paxillin (verde) y DAPI (azul) representan fibras de estrés, la adhesión focal y el núcleo, respectivamente (magnificación 40X). El número de adhesión focal (paxillin) se contaron en H2M (inferior, panel izquierdo) y H2P (inferior, panel derecho), y representado en el gráfico de barras. Las barras de error, media ± SD de muestras por triplicado. *
P Hotel & lt; 0,01 (
t-test
) en comparación con el control de DMSO. (B) análisis de transferencia de Western de los niveles de fosforilación de PAK1 y paxilina. células privadas de suero se trataron con varias concentraciones de IPA-3 tal como se indica durante 15 minutos, seguido de FBS reposición durante 10 minutos. (C) Imágenes representativas de ensayo de migración de las células Transwell H2M. Las células se trataron con DMSO o 10 mM IPA-3, y se les permitió migrar durante 24 horas. Las imágenes muestran las células que han migrado a la cámara inferior (panel superior). El número de células migradas se contaron y se representa en el gráfico de barras (panel inferior). Las barras de error, media ± SD de muestras por triplicado. *
P
. & Lt; 0,01 (
t-test
) en comparación con el control de DMSO
IPA-3 suprime la NF-kB nuclear translocación
informes anteriores demostraron que PAK1 estimula la actividad y la translocación subcelular del factor nuclear-cadena ligera potenciador de las células B activadas (NF-kB), y promueve la supervivencia celular [17], [18]. Por lo tanto, se examinó si IPA-3 es capaz de inhibir la actividad de NF-kB. H2M con un alto nivel de expresión endógena de PAK1 y hepatocitos inmortalizadas, células MIHA fueron privadas de suero y después se trató por separado con IPA-3 seguido de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). Como se muestra en la Fig. 5A, NF-kB tinción positiva se detectó predominantemente en el citoplasma de la control de DMSO, mientras que la tinción de NF-kappa B se acumula en el núcleo después de la inducción de TNF-α. Curiosamente, las células pretratadas con H2M IPA-3 dieron lugar a una tinción citoplásmica de NF-kappa B, lo que indica que IPA-3 suprime la focalización nuclear TNF-α inducida por NF-kB. A diferencia de las células H2M, IPA-3 no suprimió inducida por TNF-α activación de NF-kB en las células MIHA, que carecen de la PAK1 endógeno. Este resultado sugiere que la inhibición de la activación de NF-kB por IPA-3 es PAK1-dependiente. Para investigar más si la inactivación PAK1 está implicado en la supresión inducida por IPA-3 de NF-kappa B translocación, se determinó la fosforilación de PAK1 (Fig. 5B). De acuerdo con un estudio anterior que demostró que PAK1 se activó rápidamente por TNF-α en diversas líneas de células [19], el nivel de fosfo-PAK1 fue elevada en las células estimuladas con TNF-α (20 ng /ml). El nivel de fosforilación fue mayor en 0.5 horas y después se redujo gradualmente después. Por otra parte, la fosforilación de PAK1 fue completamente suprimida en IPA-3 células pretratadas. Este resultado sugiere que IPA-3 es capaz de suprimir la activación PAK1 inducida por TNF-α, que se correlaciona bien con la inhibición IPA-3 en inducida por TNF-α translocación de NF-kB. La inducción de la metaloproteinasa (MMP) -9 por TNF-α se demostró estar mediada por PAK1 [19]. Para dilucidar el efecto de IPA-3 sobre la actividad inducida por TNF-α de la MMP-9 y la COX-2, que son objetivos de abajo de NF-kappa B [20], [21], hemos realizado QRT-PCR para cuantificar el ARNm producción de MMP-9 y la COX-2. Después de la normalización con β-actina, las células H2M respondieron a TNF-α con una producción creciente de mRNA de MMP-9 y la COX-2 (Fig. 5C). Sin embargo, los resultados mostraron que el tratamiento de IPA-3 suprimió significativamente la expresión de MMP-9 y la COX-2 transcripciones de una manera dependiente de la dosis.
(A) Efecto de IPA-3 en la localización subcelular de NF- kappa B se evaluó por tinción de inmunofluorescencia. Después de la privación de suero durante la noche, las células H2M (panel izquierdo) y MIHA (panel derecho) se trataron con DMSO o IPA-3 (20 mM, 15 minutos), seguido de una adición de TNF-α (20 ng /ml, 15 minutos) . NF-kB se detectó con un anticuerpo específico (verde) y el núcleo se tiñó con DAPI (azul). (B) Análisis de transferencia de Western de P-PAK1 (T423) y PAK1 totales se detectaron en las células H2M estimuladas por TNF-α (20 ng /ml) con o sin tratamiento previo IPA-3 (20 mM, 15 minutos). TNF-α se incluyó en el medio de cultivo durante 0, 0,5, 1, 2 o 4 horas. (C) Expresión de cuantitativa en tiempo real PCR se realizó para analizar el nivel de mRNA de MMP-9 (panel izquierdo) y la COX-2 (panel derecho). células H2M privadas de suero se trataron con o sin IPA-3 pretratamiento (10 o 20 mM, 15 minutos) seguido de TNF-α (10 o 20 ng /ml, 24 horas). Los resultados cuantitativos de los niveles de MMP-9 y la COX-2 mRNA se normalizaron a ß-actina. Los valores representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,001 (ANOVA), ***
P
. & Lt; 0,05 (ANOVA) en comparación con el control de TNF-α
IPA- 3 suprime la tumorigénesis en ratón desnudo modelo de xenoinjerto
La amplitud de la actividad antitumoral IPA-3
in vivo
se evaluó utilizando un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos. Desde la línea celular H2M era incapaz de desarrollar tumores sólidos en ratones desnudos, se utilizó otra línea de HCC humano MHCC97L con el nivel PAK1 similar (fig. 1A). Después del establecimiento del tumor (100 mm
3), cinco ratones por grupo se trataron con DMSO o diversas dosis de IPA-3 (2 mg /kg y 4 mg /kg) tres veces por semana mediante inyección i.p. inyección. Mientras que el tratamiento fue bien tolerado como resultado de ninguna pérdida significativa de peso, IPA-3 suprimió significativamente el crecimiento del tumor (Fig. 6A) y dio lugar a pesos de los tumores inferiores (Fig. 6B). Además, el análisis de transferencia Western mostró que IPA-3 reduce la fosforilación de PAK1 y su objetivo aguas abajo JNK (Fig. 6C). En conjunto, estos resultados indicaron que el IPA-3 puede suprimir la tumorigénesis
in vivo
mediante la reducción de la actividad de PAK1.
Se utilizaron células (A) MHCC97L para el modelo de xenoinjerto. Los ratones se trataron tres veces por semana, ya sea con DMSO o IPA-3 (2 mg /kg o 4 mg /kg, i.p.). *
P Hotel & lt; 0,001 (ANOVA) en comparación con el grupo control de DMSO. (B) pesos de los tumores se midieron al final del estudio. *
P Hotel & lt; 0,001, **
P Hotel & lt; 0,01, (ANOVA) en comparación con el grupo control de DMSO. (C) Los resultados representativos de análisis de transferencia de Western. P-PAK1 (T423), PAK1 total, se detectó P-JNK y JNK total. ***
P Hotel & lt; 0,05 (ANOVA) en comparación con el control de DMSO. Las barras de error, media ± DE de 5 animales por grupo.
Discusión
PAK1 está implicada en la transducción de una red de señalización compleja que está vinculado a diversos procesos celulares, incluyendo el modelado del citoesqueleto, célula motilidad, la supervivencia y la proliferación, y la progresión del ciclo celular [5]. Desregulado o PAK1 hiper-activa se asocia comúnmente con HCC [19]. Por lo tanto, PAK1 se ha convertido en una potencial diana terapéutica en el control de la tumorigénesis y metástasis de carcinoma hepatocelular [22]. IPA-3 ha sido identificado como un inhibidor de molécula pequeña alostérica de PAK1 [8]. Con los informes pequeños o menos de IPA-3 en el tratamiento del carcinoma hepatocelular humano, se emplearon varios
in vitro e
in vivo
experimentos para investigar la capacidad anti-tumorigénico del tratamiento IPA-3 en líneas celulares de HCC humanos.
en este estudio, hemos demostrado que la IPA-3 podría inhibir la tasa de proliferación de HepG2, H2P, células H2M, y MHCC97L de maneras dosis y tiempo dependiente.