Extracto
Las proteínas de la familia de visualización IQGAP actividades complicadas y con frecuencia contradictorios en la tumorigénesis. IQGAP1 ha documentado bien potencial oncogénico y IQGAP2 tiene la función supresora de tumor putativo. IQGAP3 es la última adición a esta familia y su papel en el desarrollo del cáncer aún no se ha definido. Aquí se demuestra la expresión IQGAP3 se incrementa notablemente en los tejidos de cáncer de pulmón, tanto en los niveles de proteína y ARNm. La sobreexpresión de IQGAP3 promovió el crecimiento de células tumorales y la migración y la invasión, mientras que desmontables de IQGAP3 exhibió efectos opuestos. Por otra parte, la supresión de IQGAP3 en una línea celular de cáncer de pulmón causó una reducción en la tumorigenicidad de estas células en el tejido pulmonar después de la inyección intravenosa. Además, demostramos que IQGAP3 es capaz de interactuar con ERK1 y mejorar su fosforilación después del tratamiento con EGF. Estos datos sugieren que IQGAP3 puede contribuir a la patogénesis del cáncer de pulmón mediante la modulación de la señalización del EGFR-ERK
Visto:. Y Yang, Zhao W, Xu QW, Wang XS, Zhang Y, Zhang J (2014) Promueve IQGAP3 EGFR-ERK señalización y el crecimiento y metástasis de las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (5): e97578. doi: 10.1371 /journal.pone.0097578
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Febrero, 2014; Aceptado: April 21, 2014; Publicado: 21 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibido el apoyo del Programa Nacional de Investigación básica de China (2011CB946103), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31330025 y 30830091), Fundación de Ciencias Naturales Municipal de Beijing (7.122.104) y el Proyecto 111 de China (B07001). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de pulmón ocupa el primer lugar en la mortalidad relacionada con el cáncer en china y en todo el mundo [1], [2]. En China, hay aproximadamente 300.000 nuevos casos de cáncer de pulmón y más de 250.000 muertes por esta enfermedad cada año [3]. Histológicamente, tantos como 85% de los cánceres de pulmón son no pequeñas de cáncer de pulmón tipo de célula (NSCLC), y la mayoría de éstos son o adenocarcinoma o carcinoma de células escamosas [4] - [7]. A medida que el cáncer de pulmón puede ser oculto, la mayoría de los pacientes son inservibles y no tienen metástasis en los ganglios linfáticos regionales o lugares distantes en el momento del diagnóstico. Los pacientes con CPNM con metástasis a distancia sobrevivir por un tiempo corto (de 9 a 12 meses) [5], [8]. Por tanto, existe una urgente necesidad de desentrañar los mecanismos moleculares que conducen a la invasión y metástasis en el cáncer de pulmón [9], [10]. Dicha información se facilitará el desarrollo de nuevas terapias que permitan la mejora de los resultados en pacientes con cáncer de pulmón [11], [12].
Los enfoques terapéuticos contra EGF o EGFR representan una dirección prometedora para el tratamiento del cáncer de pulmón [13], [14]. EGFR se expresa en células normales de la epidermis, mesenquimales y origen neurogénico, y su activación se controla estrictamente en los tejidos normales [15], [16]. Sin embargo, la unión de EGFR por sus resultados ligando en homo- receptor o la heterodimerización y la activación de su actividad de tirosina quinasa intrínseca [17]. La cascada de señalización corriente abajo de este modo se inició, en última instancia conduce a cambios en los comportamientos celulares tales como la proliferación, migración y diferenciación [15], [16]. Es importante destacar que la activación constitutiva de EGFR o la señalización de EGF mejorada se encuentra con frecuencia en diferentes tipos de cáncer, especialmente en el cáncer de pulmón, donde se asocia con la iniciación del cáncer, el crecimiento tumoral /progresión, metástasis y mal pronóstico [17] - [20].
La familia de proteínas IQGAP está bien conservada en los organismos de la levadura a los mamíferos [21]. Se compone de tres miembros, IQGAP1, IQGAP2 y IQGAP3 [22] - [24]. Entre estos, IQGAP1 es el mejor estudiado [25]. El nombre IQGAP se deriva de las múltiples dominios funcionales de estas moléculas albergan tal como cuatro motivos de CI y un dominio relacionados con RasGAP (GRD) [26], [27]. IQGAP1 también contiene dominios homodimerización bobina de la bobina putativo, un triptófano motivo de repetición (WW) de función desconocida, un dominio calponin-homología (CHD) que interactúa con la actina F, y un RasGAP_C-terminal (RGCT) que interactúa con numerosas proteínas incluyendo e-cadherina y β-catenina [27]. IQGAP1 ha sugerido para funcionar en la regulación del citoesqueleto y la migración de células [28] - [30]. También hay evidencia que indica IQGAP1 juega un papel en la progresión del cáncer [31], [32]. Por el contrario, IQGAP2 parece actuar como un supresor de tumores [33]. IQGAP3 es la última adición a esta familia [24]. Los datos actualmente disponibles sugieren que está implicado en la proliferación de células epiteliales [34], [35], sin embargo queda por determinar su papel en la tumorigénesis. En el estudio actual, que proporcionan la primera evidencia de que IQGAP3 promueve el crecimiento del cáncer de pulmón y metástasis mediante la mejora de la señalización de ERK mediada por EGFR. Por lo tanto, IQGAP3 puede jugar un papel similar al de IQGAP1 en la tumorigénesis.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética de la Universidad de Pekín Ciencias de la Salud centro (Pekín, China) y la 306 del hospital del Ejército de Liberación Popular de China (Pekín, China). Para los estudios en animales, se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento y cuando el sufrimiento observado era demasiado grande, se utilizó la eutanasia humanitaria. Se obtuvo consentimiento escrito de los pacientes individuales para el uso de muestras de tejido.
Líneas celulares y muestras de pacientes
células A549 y HeLa se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (Life Technologies , Carlsbad, CA, EE.UU.). células HEK293T se cultivaron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%. Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera.
Para celular ensayos de señalización, las células fueron privadas de suero (0,5% de suero bovino fetal) durante 16 h antes de la estimulación con 100 ng /ml de EGF (Peprotech, Rockville, Nueva Jersey, EE.UU.) durante diferentes períodos de tiempo, como se indica.
25 pares de tejido tumoral de pulmón y muestras de tejidos normales adyacentes se obtuvieron del hospital de 306o del Ejército de Liberación Popular de China.
Los plásmidos y transfección
Myc-pCAGGS-IQGAP3 pCAGGS de control de vectores y fueron amablemente proporcionados por el Dr. Kozo Kaibuchi. HA-etiquetados ERK1 o ERK2 vectores que expresan se construyeron mediante técnicas moleculares estándares y verificadas por la secuencia.
Las células fueron transfectadas con el reactivo de transfección jetPRIME (Polyplus transfección, Illkirch, Francia).
siRNA transfección y La infección lentiviral
Los pequeños oligonucleótidos de ARN de interferencia (oligos) contra IQGAP3 o control siRNA oligonucleótidos se obtuvieron de GenePharma Co., Ltd (Shanghai, china). Las secuencias de direccionamiento de estos siRNAs fueron como sigue: si IQGAP3-1:5'- GAGCCAACCAGGACACUAA-3 '; SI IQGAP3-2:5'- GGCAGAAACUAGAAGCAUA-3 '; control de siRNA: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 '. oligos siRNA (50 nM) se transfectaron en células A549 con el reactivo de transfección jetPRIME.
Alternativamente, la secuencia diana siRNA se clonó en el vector lentiviral pLL3.7. Tras la verificación de la secuencia, los plásmidos y envasado shRNA vectores psPAX2 PLP /VSVG se transfectaron en la línea celular de empaquetamiento HEK293T usando jetPRIME. El medio se cambió 8 h después de la transfección. 48 horas más tarde, el sobrenadante viral se cosechó y se incuba con la línea celular A549 en presencia de 8 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.). Para la selección de la línea celular transfectada de manera estable, GFP fluorescencia se utiliza como marcador de clasificación. Las células con & gt;. Eficiencia de infección del 75% se utilizaron para su posterior análisis
transcriptasa inversa-PCR y PCR en tiempo real
TRIzol (Life Technologies) se utilizó para aislar el ARN total y después a transcripción inversa en ADNc por el sistema de transcripción inversa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). cuantitativa en tiempo real PCR se llevó a cabo en un sistema Bio-Rad Real-Time PCR. Las secuencias de los cebadores en tiempo real para IQGAP3 fueron los siguientes: hacia adelante, 5'-GTTCATCCATAGAGCCTGCCA-3 '; revertir, 5'-GCGATGCTCTCACCAATAAGG-3 '. Los cebadores para GAPDH en tiempo real se han descrito antes [36]. La expresión génica se cuantificó como el rendimiento de IQGAP3 relación a la de GAPDH.
constructos HA-ERK2
inmunoprecipitación y Western Blot Analysis
Myc-IQGAP3 y HA-ERK1 o se transfectaron en células HEK293T. Las células se recogieron y se lisaron en tampón de lisis con cóctel inhibidor de proteinasa (Roche, Basilea, Suiza) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo. A continuación, los lisados celulares se incubaron con el ratón anti-HA mAb (Sigma-Aldrich), anti-Myc mAb (Sigma-Aldrich) o un anticuerpo de control (mIgG) (Sigma-Aldrich) y la proteína-A Sepharose (GE Healthcare, EE.UU.) y resuelto por SDS-PAGE. Para la inmunoprecipitación endógena, lisado celular se prepara a partir de células A549 y inmunoprecipitó con conejo anti-ERK1 MAB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.).
Para el análisis de transferencia Western, cantidades iguales de proteína de cada muestra se cargó y se resolvieron con SDS-PAGE y se transfirieron a manchas. Después del bloqueo, las transferencias se sondaron con anticuerpos indicados y se evaluaron con el Sistema de Odyssey Imaging (LICOR Bioscience, Lincoln, NE, EE.UU.). Los anticuerpos utilizados fueron anti-GAPDH (Tecnología Bioworld, Inc., St. Louis Park, MN, EE.UU.), anti-IQGAP3 (Sigma-Aldrich), anti-ERK (Señalización Celular, Beverly, MA, EE.UU.), anti-fosfo-Erk
Thr202 /Tyr204 (Señalización celular), anti-fosfo-p38
Thr180 /Tyr182 (Señalización celular), anti-fosfo-Akt
Ser473 (Señalización celular), anti-Myc, y anti-HA.
microarrays de tejidos e inmunohistoquímica
Un microarray de tejido de cáncer de pulmón (TMA) se adquirió de Chaoying Biotecnología Co. (Xi'an, china). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IQGAP3 (dilución 1:50) durante la noche a 4 ° C. El anticuerpo primario se identificó utilizando un polímero marcado con enzima peroxidasa de rábano conjugada con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón (Promega). Las secciones teñidas fueron revisados y calificados por un patólogo. El control negativo fue el tejido pulmonar humano normal.
Ensayo de proliferación celular
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3 x 10
3 células /pocillo. La proliferación celular se evaluó cada 24 h usando el Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Japón). Cada experimento se realizó por triplicado.
La migración celular y la invasión de ensayo
Migración ensayos se realizaron en un tamaño de 24 pocillos quimiotaxis cámara (8 micras de poro, Corning Life Sciences, Corning, Nueva York, EE.UU.) recubierta con 10 mg /ml de fibronectina (Sigma-Aldrich). Las células (3~5 × 10
4 células /pocillo) en 200 l de suero libre de RPMI 1640 se sembraron en la cámara superior. Entonces 600 l RPMI 1640 con suero bovino fetal 10% o 100 ng /ml de EGF humano se añadieron a la cámara inferior. Las células en la cámara superior se retiraron usando un hisopo de algodón después de 20 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO
2. Las células unidas a la parte inferior de las membranas se fijaron con metanol y se tiñeron por cristal violeta. El grado de migración se expresó como el número medio de células en seis 10 × campos.
ensayos de invasión de la célula se llevaron a cabo esencialmente de la misma manera que el ensayo de migración, a excepción de que la cámara superior se cubrió con 30 l Matrigel (0,5 mg /ml; BD Biosciences). Los experimentos se realizaron por triplicado.
luciferasa reportero de ensayo
El Elk-1 actividad transcripcional se midieron con el sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega). IQGAP3 siRNA o NC siRNA se co-transfectaron en células A549 con los plásmidos PFR-Luc (plásmido informador), pFA2-Elk-1 (plásmido transactivador) o PRL-TK. Veinticuatro horas más tarde, las células se privaron de suero durante 16 h, después se estimularon con o sin EGF 100 ng /ml durante 6 h. Se recogieron las células y se lisaron. Todos los ensayos de reportero se repitieron al menos tres veces por triplicado. La luciferasa de luciérnaga y la actividad luciferasa de Renilla se midió con un luminómetro Centro LB960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania). actividad de la luciferasa de la luciérnaga se calculó y se normalizó sobre la base de la actividad de luciferasa de Renilla. La actividad de luciferasa en células siRNA-transfectadas de control sin estimulación EGF se establece como 1.
Tumor Análisis de Metástasis
in vivo
NOD /SCID fueron adquiridos de Vital Río de Animales de Laboratorio Technology Co. Ltd (Beijing, china). Los ratones fueron criados en una instalación libre de patógenos en la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud (Pekín, China).
A549 células fueron infectadas con el control de shRNA o shIQGAP3 lentivirus. Las células (1,5 × 10
6) en 0,1 ml de PBS se inyectaron en la vena de la cola de ratones NOD 6 semanas de edad /SCID. Seis semanas después de la infección, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Entonces se retiraron los pulmones, se pesaron, fotografiado, y se fijaron en formalina al 4%. Las secciones de tejido también se tiñeron con hematoxilina-eosina (H & amp; E). para la evaluación histológica
Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo con el programa SPSS, versión 13.0 (SPSS, Inc.). Se utilizó la prueba t de Student para comparar la proliferación celular, la migración y la invasión entre dos grupos independientes. Se realizó la prueba de Chi-cuadrado para determinar las diferencias en edad, sexo, estadio tumoral del paciente y la histología entre los grupos con la expresión IQGAP3 mayor, igual o menor en comparación con los tejidos de tumores no cancerosos adyacentes.
P
valores & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
IQGAP3 expresión está regulada positivamente en el tejido canceroso de pulmón
Un posible papel en la tumorigénesis fue el primero. sugerido para IQGAP3 por los análisis bioinformáticos de expresión IQGAP3 en el tejido tumoral. ECgene (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene/) mostró niveles elevados de IQGAP3 en una variedad de tejidos tumorales o células de origen en el ovario, pulmón, intestino grueso, estómago, médula ósea y de mama (Figura 1A ). RT-PCR se realizó posteriormente para verificar estos datos. Mientras que la expresión IQGAP3 en tejidos normales estaba restringida al colon, el intestino delgado y los testículos, se observaron altos niveles de IQGAP3 mRNA en una serie de tumores, incluyendo cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular, cáncer renal, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de colon y leucemia ( datos no mostrados). Por otra parte, hemos visto la producción de autoanticuerpos contra IQGAP3 en una fracción significativa de los pacientes con cáncer de pulmón IQGAP3-positivas [37]. Esto nos llevó a investigar más a fondo la actividad de esta molécula en el desarrollo del cáncer de pulmón. IQGAP3 se reguló a nivel de ARNm en tejidos de cáncer de pulmón 20, en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes en 25 muestras apareadas de análisis en tiempo real PCR (Figura 1B). A continuación examinó la expresión de proteínas IQGAP3 en una matriz de tejido que contiene 89 tejidos de cáncer de pulmón pareadas. Se observaron niveles elevados de proteína IQGAP3 en 80 tejidos de cáncer (Figura 1C y Tabla S1). Es de destacar que el análisis estadístico mostró que no hubo correlación significativa entre IQGAP3 regulación al alza de proteínas y parámetros como la edad, el sexo o el grado histológico (Tabla S1).
análisis de la expresión (A) EST del gen normal y en IQGAP3 tejidos cancerosos en base a la base de datos ECgene. (B) cuantitativa en tiempo real PCR para la expresión IQGAP3 en 25 pares de cáncer de pulmón en comparación con tejidos no cancerosos adyacentes. IQGAP3 expresión se normalizó en contra GAPDH. Los niveles relativos se calcularon para cada muestra, y se le asignó un valor de 1 para el tejido no canceroso adyacente del paciente 13. Los experimentos se repitieron por triplicado. Los datos de un experimento representativo se presentan como media ± desviación estándar. (C) El análisis inmunohistoquímico de la expresión de proteínas IQGAP3 en cáncer de pulmón en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes. Imágenes representativas se muestran para un carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma. Ca, el tejido del cáncer; Adj, los tejidos no cancerosos adyacentes. Ampliación, × 200.
La alteración de la expresión IQGAP3 Modula el crecimiento, la migración y la invasión de las células tumorales
Para investigar la consecuencia funcional de expresión IQGAP3 upregulated en el cáncer, que supervisó los cambios en comportamiento de la célula tras la alteración de su nivel de expresión en líneas celulares de cáncer. IQGAP3 se sobreexpresa por primera vez en células HeLa, que tenían un nivel relativamente bajo de expresión IQGAP3 endógeno. La sobreexpresión de IQGAP3 promovió la proliferación celular en estas células (Figura 2A). Además, la expresión forzada de IQGAP3 resultó en la migración celular y la invasión mejorada (Figura 2B, C).
Myc-IQGAP3 o de control de vectores se transfectaron en células HeLa y a continuación, las células se recogieron a las 24 h después de la transfección para la migración y ensayo de invasión. Las células para el ensayo de proliferación se recogió en el punto de tiempo indicado. expresión de la proteína (A) IQGAP3 de transfectantes se verificó por transferencia de Western. La proliferación celular se ensayó usando el Kit-8 de conteo celular. ensayos (B, C) de migración celular y la invasión se realizaron usando cámaras de quimiotaxis con o sin recubrimiento con Matrigel. Cada ensayo se repitió al menos 3 veces. Los datos de un experimento representativo se presentan como media ± desviación estándar. *,
P Hotel & lt; 0,05; ***,
P
. & Lt; 0,001
A fin de evaluar los efectos de IQGAP3 sobre el crecimiento de células cancerosas y la migración, la expresión IQGAP3 fue derribado en el cáncer de pulmón línea celular A549 , que tenía un nivel relativamente alto de expresión de IQGAP3 endógeno. Dos shRNA orientación construcciones se utilizaron diferentes secuencias IQGAP3, ambos de los cuales llevó a regulación a la baja eficiencia de IQGAP3 en comparación con los controles no específicos (figura 3A). Como era de esperar, desmontables de IQGAP3 suprime la proliferación de células A549 (Figura 3B). Por otra parte, la reducción de expresión IQGAP3 también fue acompañado por una disminución de la migración y la invasión en las células A549 (Figura 3C, D). Es bien conocido que la señalización de EGFR es críticamente implicado en el desarrollo del cáncer de pulmón. Por lo tanto, a prueba aún más si la expresión IQGAP3 puede modular la sensibilidad celular a EGF estímulo. Como se muestra en las Figuras 3E y F, desmontables de IQGAP3 causó inhibición de la migración celular y la invasión similar a la inducida por EGF. Tomados en conjunto, estos datos sugieren IQGAP3 tiene potencial oncogénico.
A549 células fueron transfectadas con shRNA construcciones de expresión para derribar IQGAP3 endógeno. los niveles de proteína (A) después de la infección con IQGAP3 control (NC) o dos lentivirus shIQGAP3 diferentes (KD1 y Kd2). (B) La proliferación se analizó usando el Recuento celular Kit-8 para las células A549 lentivirus infectados. (C, E) La migración de las células A549 lentivirus infectados en el ensayo de cámara de quimiotaxis en ausencia (C) o presencia (E) de EGF humano (100 ng /ml). (D, F) La invasión de las células A549 lentivirus infectadas a través de Matrigel en ausencia (D) o presencia (F) de EGF humano. Cada ensayo se repitió al menos 3 veces. Los datos de un experimento representativo se presentan como media ± desviación estándar. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01; ***,
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. & Lt; 0,001
Desmontables de IQGAP3 Suprimida cáncer de pulmón Metástasis
en vista de la potente impacto de expresión IQGAP3 sobre la proliferación y migración de células cancerosas cultivadas
in vitro
, el próximo tratado de determinar si también afectó a la tumorigénesis
in vivo
utilizando un modelo establecido de cáncer de pulmón metastásico [38], [39]. Se inyectaron células A549 que albergan un vector lentiviral que expresa shRNA IQGAP3-específica en la vena caudal de los ratones NOD /SCID. Los animales fueron sacrificados en el día 42 y se extrajeron los pulmones y se analizan. En comparación con los controles simulados, desmontables células IQGAP3 parecían ser menos tumorigénicas
in vivo
, como lo sugiere la gran reducción de volumen y el peso de los pulmones afectados (Figura 4A, B). La tinción inmunohistoquímica reveló que la estructura pulmonar relativamente normal se mantuvo en los grupos de derribo IQGAP3, mientras que fue casi completamente destruida por los múltiples nódulos tumorales en el control de simulacro (Figura 4C). Tomando los
in vitro
datos relacionados en consideración, el potencial tumorigénico reducido de células desmontables IQGAP3
in vivo
puede ser el resultado de la colonización ya sea alterada o proliferación o ambas cosas.
NOD /ratones SCID recibieron una inyección intravenosa de 1,5 × 10
6 células A549 transfectadas de forma estable con shIQGAP3 (IQGAP3-KD2) o vectores de control (NC), y fueron sacrificados a día 42 después de la inoculación del tumor (n = 7 para cada grupo). (A) Aspecto macroscópico de los tejidos pulmonares. peso (B) de pulmón. Las barras horizontales y de error muestran el peso medio y la desviación estándar. (C) H & amp; E tinción de los tejidos pulmonares. Se muestran cuatro campos representativos (2 para cada grupo). Ampliación, × 40. **,
P
. & Lt; 0,01
IQGAP3 interactúa con ERK1
Como se predijo por Scansite (http://scansite.mit.edu/), IQGAP3 contiene varios dominios ERK D, que son conocidos para mediar en la interacción con los miembros de la familia ERK. Para explorar esta posibilidad, las células transfectadas HEK293T con constructos HA-Myc-ERK2 IQGAP3 y HA-ERK1 o. El lisado celular se preparó y se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-Myc o anti-HA. El precipitado resultante se detectó recíprocamente con anti-Myc o anti-HA. Fue de particular interés que se observó inmunoprecipitación de IQGAP3 con ERK1, pero no con ERK2 (Figura 5A). Por otra parte, hemos tratado de determinar si se produce una interacción similar entre las proteínas expresadas de forma endógena. lisado celular de las células A549 se inmunoprecipitó con anticuerpo de conejo anti-ERK1 mAb y IQGAP3 fue efectivamente detectado en el precipitado con el anticuerpo anti-IQGAP3 (Figura 5B). Estos resultados indican que IQGAP3 puede interactuar con ERK1, ya sea directamente o indirectamente a través de un complejo más grande.
(A) Myc-IQGAP3 y HA-ERK1 o constructos HA-ERK2 se transfectaron en células HEK293T. El lisado celular se preparó y se inmunoprecipitó con el ratón anti-HA mAb, anti-Myc anticuerpo monoclonal o anticuerpos de control (mIgG). El precipitado resultante, junto con el lisado sin procesar (Input) se resolvió en SDS-PAGE, se transfirieron a manchas y se sondaron con anti-Myc y anti-HA. (B) Interacción de IQGAP3 con ERK1 También se examinó en las células A549 con las proteínas expresadas de forma endógena. lisado celular se prepara a partir de células A549 y se inmunoprecipitaron con anticuerpo de conejo anti-ERK1 mAb. La presencia de IQGAP3 en el precipitado fue evaluado anticuerpos anti-IQGAP3. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces y los resultados se muestran a partir de un experimento representativo.
IQGAP3 Promueve EGF inducida por fosforilación de ERK
La interacción entre IQGAP3 y ERK1 provocó una mayor investigación sobre la influencia de IQGAP3 sobre la activación de ERK y la señalización. La sobreexpresión de IQGAP3 en células HeLa tuvo un efecto mínimo sobre la fosforilación de ERK, en contraste con lo que se ha reportado para IQGAP1 [40]. Cuando se estimulan con EGF, sin embargo, los transfectantes IQGAP3 demostraron la fosforilación de ERK en gran medida mejorado en comparación con el control simulado (Figura 6A). AKT y la activación de p38, por otro lado no se alteró (datos no mostrados). De acuerdo con estos hallazgos, desmontables de expresión IQGAP3 en células A549 dio lugar a la atenuación de la fosforilación de ERK inducida por EGF, mientras que AKT y la fosforilación de p38 no se vio afectada (Figura 6B). Por otra parte, los ensayos de reportero de luciferasa duales mostraron que desmontables de IQGAP3 inhibe la actividad transcripcional de Elk1 que es un sello de la activación de ERK en EGF estimula las células A549 (Figura 6C). Para evaluar la posible correlación entre la señalización mejorada ERK y la proliferación acelerada de células transfectadas con IQGAP3, U0126 que es un inhibidor MEK1 /2 se añadió al cultivo. Como se muestra en la figura 6D, la inhibición de la activación de ERK abolió el efecto de proliferación de promoción de IQGAP3. Estos resultados apoyan el concepto de que la actividad oncogénica de IQGAP3 está probablemente mediada por la señalización de ERK mejorada.
células (A) HeLa transfectadas transitoriamente con Myc-IQGAP3 o vector control (mock) fueron privadas de suero de suero fetal bovino (0,5% ) durante 24 h antes de ser estimuladas con 100 ng /ml de EGF. Las células se recogieron a diferentes puntos de tiempo y se examinaron para la fosforilación de ERK. (B) células A549 se infectaron con shIQGAP3 lentivirus (IQGAP3-KD1 o KD2) o el virus de control (NC) y (suero bovino fetal al 0,5%) de suero privado antes de la estimulación con 100 ng /ml de EGF. Los niveles de ERK fosforilado, ERK total, el p38 fosforilada y AKT fosforilada fueron evaluados con western blot en diferentes puntos temporales después de la estimulación de EGF. Se llevaron a cabo (C) los ensayos de reportero de luciferasa para medir la actividad Elk1 aguas abajo de la cascada de señalización del EGFR-ERK en células A549 transfectadas con siRNA oligos. (D) La proliferación de células Hela que albergan IQGAP3 que expresan o de control de vectores se ensayó usando el Cell Counting Kit-8 con la adición de 20 mM U0126 o DMSO. Cada ensayo se repitió al menos 3 veces. Los datos de un experimento representativo se presentan como media ± desviación estándar. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01
Discusión
Hasta la fecha, tres miembros de la familia IQGAP se han descrito [22] - [24].. Hay pruebas de que IQGAP1 funciona principalmente como un oncogén [27]. IQGAP2 muestra la actividad anti-tumor, a pesar de su similitud estructural con IQGAP1 [33]. Aquí hemos demostrado que IQGAP3 es altamente expresado en una gran proporción de las muestras de cáncer de pulmón. Mientras que la expresión forzada de IQGAP3 causa la proliferación y la migración acelerada /invasión de las células cancerosas, la supresión de su expresión conduce a una reducción en el potencial tumorigénico. A nivel molecular, IQGAP3 interactúa con ERK1 y promueve la activación inducida por EGF de ERK, que a su vez parece estar estrechamente asociado con su actividad promotora de tumores.
IQGAP3 se encuentra en 1q21.3, que es una punto de acceso para la amplificación de genes en el cáncer [24]. la amplificación de ADN en 1q21.3 tiene por ejemplo sido informado de que vinculado con carcinoma gastroesofágico y carcinoma ductal infiltrante de mama [41], [42]. Además, las ganancias en 1q21.3 tienen una correlación significativa con la reducción del tiempo de supervivencia global en leiomiosarcoma de útero [43]. Bioinformática análisis muestra que IQGAP3 es upregulated en múltiples tipos de cáncer, incluyendo ovario, pulmón, intestino grueso, estómago, médula ósea y enfermedades malignas de mama (Figura 1A). El estudio abordó específicamente su papel en el cáncer de pulmón. Entre 25 pares de cáncer de pulmón y los tejidos no cancerosos adyacentes, 20 tejidos de cáncer mostraron un aumento en IQGAP3 mRNA. La regulación positiva de la expresión IQGAP3 se confirmó a nivel de proteínas mediante la visualización de fuerte tinción inmunohistoquímica en el cáncer que en los tejidos no cancerosos en 80 de 89 muestras de cáncer de pulmón. Especulamos que IQGAP3 puede representar un importante gen que está implicado críticamente en tumores malignos se caracterizan por 1q21.3 amplificación. Sería interesante determinar si la amplificación 1q21.3 contribuye a la regulación al alza de IQGAP3 que se encuentra en el cáncer de pulmón, y si la amplificación 1q21.3 observado en carcinomas gastroesofágico o cáncer de mama se asocia con aumento de la expresión IQGAP3. Aunque en nuestro estudio, hemos demostrado que upreguation de IQGAP3 es un evento común en el cáncer de pulmón, debemos mencionar que hay algunas muestras de cáncer de pulmón que presentan, sin cambios o incluso disminución de la expresión de IQGAP3. Esto no es sorprendente. Por ejemplo, Her2, el oncogén representa en cáncer de mama, sólo es upregulated en el cáncer de aproximadamente el 20% de mama [44], [45]. Algunos genes, tales como p16, que pueden ser reguladas al alza o downregulated en los tumores y actúan, ya sea como un supresor de tumor o un oncogen en función del contexto del cuerpo [46]. Por lo tanto, si la diferencia de patrón de expresión de IQGAP3 sugiere una regulación más confundir y función de IQGAP3 en el desarrollo tumoral necesita más estudios.
La desregulación de la expresión de IQGAP3 en tejido de cáncer sugiere un posible papel de esta molécula en la tumorigénesis. De acuerdo con este concepto, la sobreexpresión de IQGAP3 mejorado crecimiento de células tumorales, migración y la invasión, mientras que desmontables de expresión IQGAP3 muestran efectos opuestos. por lo tanto IQGAP3 es funcionalmente similar a IQGAP1, que se sabe que tienen potencial oncogénico [31], [32]. Como otros miembros de la familia IQGAP, IQGAP3 posee motivos estructurales que puede unirse ERK. Por coimmunoprecipitation recíproco, que confirmó la interacción entre IQGAP3 y ERK1. La relevancia funcional de esta interacción con el soporte de la fosforilación aumentada de ERK y aumento de la actividad transcripcional Elk1 a la estimulación de EGF en las células transfectadas con IQGAP3. Más importante, el efecto de la proliferación de la promoción fue casi completamente abolida por el U0126 inhibidor de la señalización de ERK, lo que indica que IQGAP3 ejerce su función principalmente por la regulación de la señalización de ERK. Es interesante observar que a pesar de su similitud funcional, IQGAP3 y IQGAP1 muestran claramente diferentes especificidades para los socios de unión. Mientras IQGAP1 se une principalmente a ERK2, IQGAP3 interactúa exclusivamente con ERK1 [40]. La importancia de tal selectividad queda por determinar, sin embargo se especula que IQGAP1 y IQGAP3 pueden cooperar en la regulación de la señalización de ERK, ejerciendo de este modo un efecto sinérgico sobre la progresión del tumor.
inoculación intravenosa de ratones desnudos ha sido ampliamente utilizada para evaluar el potencial metastásico de las células del cáncer [38], [39]. Usando este modelo, desmontables de IQGAP3 en células de cáncer de pulmón se encontró a afectar en gran medida su capacidad de generar lesiones metastásicas en el pulmón. Este resultado es consistente con nuestro
in vitro
de datos que muestra la migración celular y la invasión alterado después de la manipulación de la expresión IQGAP3. Sin embargo, los detalles específicos de estos mecanismos no están claros. La microscopía confocal reveló que IQGAP3 se enriquece en el borde delantero de la migración de células (Figura S1), lo que sugiere su posible implicación en la formación de bordes de ataque. Además, perfiles de expresión génica mostró un aumento del nivel de E-cadherina en IQGAP3 desmontables células (Figura S2). Es bien reconocido que la E-cadherina es muy importante para la adhesión celular. Regulación a la baja de la misma junto con su complejo asociado catenina es concomitante con la reducción de la adhesión intercelular y aumento de la capacidad invasiva [47], [48]. Como tal, IQGAP3 puede facilitar la migración celular y la invasión en parte a través de la supresión de la expresión de E-cadherina.
En resumen, nuestros estudios revelan por primera vez la participación de IQGAP3 en el desarrollo de cáncer de pulmón y los mecanismos moleculares potenciales subyacente su tumor-promoción de la actividad. Estos resultados amplían nuestros conocimientos sobre el complicado papel de la familia IQGAP en la tumorigénesis. En mayor profundidad el potencial de estas moléculas como objetivos para la invención terapéutica se justifica.
Información de Apoyo
figura S1.
IQGAP3 se enriqueció en el borde delantero de células que migran.