Extracto
Antecedentes
Anterior homólogo gradiente de 2 (AGR2) es una proteína funcional con papeles críticos en una amplia gama de sistemas biológicos, incluyendo el desarrollo de vertebrados tejido, las respuestas de la lesión de tejidos inflamatorios, y la progresión del cáncer. Los estudios clínicos han demostrado que la proteína AGR2 se sobreexpresa en una amplia gama de cánceres humanos, incluyendo carcinomas del esófago, páncreas, mama, próstata, y pulmón, haciendo que la proteína como un biomarcador potencial de cáncer. Sin embargo, las funciones bioquímicas generales de AGR2 en las células humanas permanecen sin definir, y los mecanismos de señalización que conducen a AGR2 para inhibir p53 todavía no están claramente ilustrados. Por lo tanto, es de gran interés para el desarrollo de sondas moleculares que reconocen específicamente AGR2 para su detección y para aclarar el mecanismo molecular AGR2 asociada.
Metodología /Principales conclusiones
A través de una basada en perlas y fluya la tecnología SELEX citometría supervisado, hemos identificado un grupo de aptámeros de ADN que pueden unirse específicamente a AGR2 con
K
d
valores en el rango nanomolar después de 14 rondas de selecciones. Aptámero C14B fue elegida para estudiar más a fondo, debido a su alta afinidad de unión y especificidad. El C14B1 optimizado y se acorta tiene características especiales G-rico, y el G-rica región de este motivo de unión se caracterizó además para revelar un paralelo intramolecular G-quadruplex por espectroscopia de CD y espectroscopia UV. Nuestros experimentos confirmaron que la estabilidad de la estructura G-quadruplex era fuertemente dependiente de la naturaleza de los iones monovalentes y la formación de estructura G-quadruplex también era importante para la capacidad de unión de C14B1 al objetivo. Por otra parte, se ha diseñado un tipo de sonda de baliza alostérico molécula (AMB) para la detección selectiva y sensible de AGR2.
Conclusión /Importancia
En este trabajo, hemos desarrollado nuevas sondas de aptámero específico para el reconocimiento de la AGR2. Estudio estructural han identificado que el motivo de unión de aptámero es una estructura G-quadruplex paralelo intramolecular y su estructura y la afinidad de unión son fuertemente dependientes de la naturaleza del ion monovalente. Además, con nuestro diseño de AGR2-AMB, AGR2 podría ser detectado de manera sensible y selectiva. Esta sonda aptámero tiene un gran potencial para servir como una herramienta útil para el diagnóstico precoz y pronóstico del cáncer y para la investigación fundamental para dilucidar las funciones bioquímicas de AGR2
Visto:. J Wu, Wang C, Li X, Y Canción , Wang W, Li C, et al. (2012) Identificación, caracterización y aplicación de una proteína G-quadruplex estructurado DNA aptámero contra el cáncer de biomarcadores anterior Gradiente Homólogo 2. PLoS ONE 7 (9): e46393. doi: 10.1371 /journal.pone.0046393
Editor: Pierre Busson, Instituto Gustave Roussy de Cancerología, Francia |
Recibido: 2 de Junio, 2012; Aceptado: 29 Agosto 2012; Publicado: 28 Septiembre 2012
Copyright: © Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (2010CB732402), Programa Nacional de Instrumentación (2011YQ03012412), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Fujian para Distinguidos jóvenes estudiosos (2010 J06004), y el Fondo Nacional para el Fomento de talentos de la ciencia básica (J1030415). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
anterior gradiente homólogo 2 (AGR2) fue identificado inicialmente como un factor de secreción expresada en la región anterior del ectodermo dorsal en los embriones Xenopuslaevis, donde se postula para mediar en la especificación del destino ectodérmica dorsoanterior, en particular en la formación de la glándula de cemento [1]. Los estudios clínicos han demostrado además que la proteína AGR2 se sobreexpresa en una amplia gama de cánceres humanos, incluyendo carcinomas del esófago, páncreas, mama, próstata, y pulmón [2] - [6]. Más estudios biológicos en estas líneas celulares de cáncer han indicado un papel significativo para AGR2 en las vías asociados a tumores, incluyendo el crecimiento tumoral, la transformación celular, la migración celular, la regeneración de miembros, y las metástasis [5], [7] - [9]. Sin embargo, las funciones bioquímicas generales de AGR2 en las células humanas permanecen sin definir, y los mecanismos de señalización que conducen a AGR2 para inhibir p53 todavía no están claramente ilustrados [10]. Por lo tanto, el desarrollo de ligandos moleculares que reconocen específicamente AGR2 es de gran importancia para el diagnóstico precoz y el pronóstico de cáncer y para la investigación fundamental para la elucidación de las funciones bioquímicas de AGR2
.
Varios ligandos se han desarrollado para el reconocimiento molecular específico , tales como moléculas pequeñas, anticuerpos y péptidos [11] - [13]. Más recientemente, otro tipo de ligando molecular, llamada aptámero, ha llamado la atención significativa. Los aptámeros, monocatenario modificados o los oligonucleótidos no modificados (ARN o ADN), se generan a través de
vitro
proceso en la selección o SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) con alta afinidad de unión y la especificidad hacia los objetivos definidos [14 ], [15]. Los aptámeros seleccionados pueden reconocer una amplia variedad de objetivos, incluyendo moléculas pequeñas, proteínas, células y tejidos que dependen de sus diversas estructuras terciarias. En comparación con los anticuerpos, aptámeros tienen bajo peso molecular, la tasa de penetración en el tejido rápido, de alta estabilidad y bajo inmunogénesis [16]. Se pueden sintetizar químicamente con bajo costo y fácilmente modificados con varios reporteros [17]. Además, se pueden ligar y /o amplificados por enzimas
in vitro
[18]. Estas ventajas hacen que prometen aptámeros ligandos para la investigación médica y farmacéutica, tales como el desarrollo de fármacos, el diagnóstico de la enfermedad, y la terapia dirigida [19]
.
Las posibilidades que ofrecen los aptámeros son enormes, y algunos aptámeros ya han demostrado muchas aplicaciones importantes en bioanalysisand biomedicina [20] - [23]. En particular, varios aptámeros se han generado contra las proteínas relacionadas con el cáncer, tales como PDGF, VEGF, HER3, NFkB, tenascina-C, o PMSA [24] - [26]. Muchos aptameric sensores, sondas y ensayos se han desarrollado para permitir la detección sensible y selectiva de estas proteínas biomarcadores del cáncer [27]. Por ejemplo, Yang
et al
ha informado de una conmutación de luz sondas aptámeros excimer para la detección sensible cuantitativa de PDGF en los medios de células [28]. Kwon
et al
han desarrollado un nanotubo de polipirrol funcionalizado con aptámero para construir un biosensor VEGF [29]. Los aptámeros también se han aplicado a la imagen molecular de
in vivo
caracterizan a las complejas actividades patógenas que acompañan el crecimiento del tumor para el diagnóstico precoz de la enfermedad y la medición de la patogénesis [30] - [33]. Dado que los objetivos para los aptámeros pueden ser intracelular, biomoléculas extracelulares o de la superficie celular, diversos métodos terapéuticos se han desarrollado utilizando los aptámeros como reactivos de segmentación [34] - [37], que amplían considerablemente la gama de terapia dirigida. Además, se han encontrado algunos aptámeros terapéuticamente útiles para inhibir las interacciones proteína-proteína, tales como las interacciones receptor-ligando, y por lo tanto funcionar como antagonistas [38].
En este estudio, usando el basado en perlas y el flujo de citometría de tecnología SELEX supervisado, que tuvo como objetivo obtener aptámeros específicos para AGR2 y estudiar los suyos estructura y la función potencial. SELEX basado-Beads permitió el uso de simple, pero eficaz, citometría de flujo análisis para controlar el progreso de la selección, evitando el tedioso, el tiempo y el proceso radiactivo EMSA [39] - [43]. Después de 14 rondas de selección, se ha identificado un grupo de aptámeros de ADN que unen específicamente a AGR2 con altas afinidades. Estudios estructurales en una de las secuencias de aptámero, C14B, revelaron un paralelo G-quadruplex intramolecular, y su estructura y la afinidad de unión a AGR2 dependen de K
+ ion intensamente. Por otra parte, hemos diseñado una molécula alostérica faro AGR2-AMB basado en el aptámero identificado, que permite sencillo, sensible y detección selectiva AGR2. Las secuencias de aptámeros y AGR2-AMB reportados en este estudio son herramientas potencialmente útiles para el diagnóstico precoz y pronóstico del cáncer y para la investigación fundamental para dilucidar las funciones bioquímicas de AGR2.
Resultados y Discusión
Selección aptámeros de ADN para reconocer AGR2
para identificar aptámeros contra AGR2, AGR2 recombinante se fusionó con glutatión-S-transferasa (GST) para facilitar la unión de la proteína a soportes sólidos (GSH-Sepharose bolas). Los AGR2-GST-perlas resultantes se utilizaron como diana positiva en SELEX mientras que los de GST-cuentas como control negativo para eliminar las secuencias de unión a la superficie no específicos. El proceso de
in vitro
sefarosa-a base de grano SELEX se ilustra esquemáticamente en la Figura 1.
En la base de sefarosa-cuentas-proceso SELEX para la proteína AGR2, las GST-perlas se incubaron con el biblioteca de ADNss de contra-selección para eliminar secuencias no específicas. Los ADN no unidos se incubaron después con AGR2-GST-cuentas para target-selección. Después de lavar con dureza, las secuencias de ADN-AGR2 específica se amplificaron posteriormente mediante PCR para la próxima ronda de selección, o para la clonación y secuenciación para identificar aptámeros individuales después de citometría de flujo.
Un 87 nucleótidos ( 87-nt) de ADN monocatenario (ssDNA) biblioteca con 45 bases aleatorias flanqueados por dos secuencias de cebadores (22-nt y 20-nt) se sometió al procedimiento SELEX. La biblioteca se permitió por primera vez para interactuar con el exceso de perlas de control negativo, y se recogieron sólo las secuencias de ADN que no se unían a las GST-cuentas. Las secuencias recogidos fueron incubadas con AGR2-GST-cuentas. Después del lavado rigurosa, se descartaron aquellas secuencias que, o bien no se unen o sólo débilmente con destino a la meta. Sólo las secuencias que limitan la fuerza suficiente se retuvieron sobre perlas, y se recogieron y se amplificaron por PCR para la siguiente ronda de selección de los complejos de perlas-ssDNA. Después de múltiples rondas de selección, el proceso de sustracción reduce eficientemente las secuencias de ADN que se unieron a las perlas de GST, mientras que los candidatos de aptámero-AGR2 específica se enriquecieron gradualmente. El progreso del proceso de selección se monitorizó mediante citometría de flujo. Cuanto más fuerte es la unión de la biblioteca de ADN para AGR2, más FAM marcada secuencias unido a las perlas, por lo que la intensidad de fluorescencia más alta las perlas emitirían. Con el aumento del número de ciclos de selección, un aumento constante de la intensidad de fluorescencia de las perlas de destino se observaron (Figura 2a). La afinidad de unión de la biblioteca enriquecida después de 14 rondas de selección estaba determinado a estar en el intervalo nanomolar (K
d = 64,1 ± 5,4 nM), mientras que no hubo unión observable de la biblioteca para el control de cuentas (figura 2b). Estos resultados sugieren que los aptámeros de ADN que reconocen específicamente AGR2 se enriquecieron durante el proceso de selección.
a) La citometría de flujo ensayo para vigilar la unión de una piscina seleccionada con AGR2 (proteína diana) y GST (proteína de control). La curva roja representa la unión de la biblioteca no seleccionada de fondo. Para el AGR2 proteína diana, se produjo un aumento de la capacidad de la piscina de unión como la selección progresó, mientras que no hubo cambios observables para el GST proteína de control. La concentración final de la piscina seleccionado en tampón de unión fue 100 nM. b) Determinación de la constante de disociación de la biblioteca enriquecida y la biblioteca no seleccionada a AGR2. c) Las medidas de fluorescencia para determinar la constante de disociación de C14B aptámero seleccionado. Dos controles negativos, GST-cuentas y GSH-cuentas, se llevaron a cabo. Los datos fueron el promedio de los resultados del experimento por triplicado.
Caracterización de las secuencias de aptámeros seleccionados
Después de 14 rondas de selección, la combinación de ADN enriquecido fue clonado y secuenciado. Los datos de secuenciación para clones se analizaron mediante el uso de software de análisis de secuenciación de Clustal W 6.0 [44]. Las secuencias se agruparon en base a la similitud de homología de las secuencias de ADN de clon individual. Entre las secuencias de 62 clones, había dos subfamilias cada uno que contiene múltiples secuencias con características comunes. Una subfamilia secuencias de guanosina es rico en (22 clones), y el otro es rico en secuencias de timina (40 clones) (Figura S1). Cuatro secuencias se eligen y se sintetizaron para una caracterización adicional (Tabla S1): tres secuencias de G-rico subfamilia, C14A (apareció 2 veces), C14B (apareció 3 veces) y C14C (apareció 5 veces), y una secuencia C14D (apareció 2 veces) de subfamilia T-rica. Sólo una secuencia rica en T fue elegido debido a las secuencias de T-ricos tienden a partir de estructuras terciarias no rígidos y la posibilidad de ser aptámero se piensa que es muy bajo. Como se muestra en la Figura 2c, C14B puede unirse AGR2 con la más alta afinidad (
K
d
= 13,1 ± 7,2 nM). La titulación de C14B a GST-cuentas no reveló ninguna unión observable, estableciendo que el objetivo vinculante de C14B era de hecho AGR2. Otros tres secuencias tienen constantes de unión similares a AGR2 pero un poco más débil que C14B, en el que el
K
d Red de C14A es de 20,9 ± 5,2 nM, C14C es 44,6 ± 7,0 nM y 48,4 ± C14D es 15,6 Nuevo Méjico. (Figura S2).
optimización de la secuencia de aptámero C14B
Desde C14B es la mejor aptámero que obtuvimos de las cuatro secuencias de prueba, fue choses para la futura optimización y caracterización. La longitud de C14B es 87mer, lo que es desventajoso para futuras aplicaciones, ya que es incómodo y caro de sintetizar una secuencia tan larga. Para identificar la región de unión del aptámero, las secuencias marginales de C14Bwas truncados gradualmente. Dos sequencesC14B0 truncado y C14B1 de C14B se muestra en la Tabla 1. Los experimentos de afinidad de unión posteriores revelaron que tanto C14B0 (8,5 ± 3,6 nM) y C14B1 (19,1 ± 5,1 nM) tienen similares
K
d
a AGR2 como la de C14B original (13,1 ± 7,2 nM). La mayoría de las secuencias eliminadas eran secuencias de cebadores, dando a entender que la región de unión del aptámero era el medio de secuencias aleatorias y las secuencias de los cebadores o no contribuyen poco a la afinidad de unión del aptámero. C14B1 tiene cinco porciones de poli-G y hemos diseñado cinco secuencias truncadas por la eliminación de una porción de poli-G, cada uno (Tabla S2). La eliminación de cualquier porción de poli-G destruiría su afinidad de unión se extienden a cierta (Figura S3), lo que sugiere será de aplicación el G-motivo para la unión de aptámeros. Tomando en conjunto, estos resultados indican que C14B1, que era sólo el 33 mer, fue la región de unión esencial para AGR2. Por lo tanto, C14B1 se aplicó para su posterior caracterización y diseño de la sonda.
Selectividad de aptámero C14B1
Con el fin de demostrar la interacción específica entre AGR2 y C14B1, tres proteínas de control de BSA, y trombina tripsina se acoplaron con los NHS-Sepharose-cuentas y después se incubaron con C14B1. Como se muestra en la Figura 3, C14B1 pudo enlazar con el objetivo AGR2 fuertemente, mientras que hubo poca o ninguna afinidad de unión hacia la trombina, la tripsina y la BSA, lo que demuestra la alta selectividad del aptámero.
La relación de señal a fondo (SBR) se define como la relación de la señal de fluorescencia de FAM aptámero marcado con secuencia aleatoria marcado con FAM en el tratamiento con perlas de proteína modificada. Los datos fueron el promedio de los resultados del experimento por triplicado.
aptámero C14B1 es un intramolecular paralelo G-quadruplex
Un examen más detallado reveló que C14B1 tiene varios tramos de guanines (CGGGTGGGAGTTGTGGGGGGGGGTGGGAGGGT). Es bien sabido que las secuencias ricas en guanina pueden doblar en cuatro de cadena estructuras secundarias llamadas quadruplexes. De acuerdo con G-quadruplex fórmula de predicción d (G
3 + N
1-7G
3 + N
1-7G
3 + N
1-7G
3 +) [45], C14B1 tenía gran probabilidad para formar una estructura G-quadruplex. En el G-cuádruplex, la disposición cuadrada plana de cuatro guanines (tétrada) está estabilizada por enlaces de hidrógeno de Hoogsteen. Dependiendo de la dirección de las hebras o partes de una hebra que forman las tétradas, las estructuras se pueden describir como paralelo o antiparalelo. Además, estos quadruplexes pueden formar a través de la asociación intermolecular de cuatro o dos moléculas de ADN, o por el plegamiento intramolecular de una sola hebra que contiene cuatro bloques de guanines se realizaron [46] experimentos de CD para investigar la estructura secundaria de aptamerC14B1. El espectro de CD de C14B1 mostró un pico negativo cerca de 240 nm y un pico positivo cerca de 260 nm, un espectro típico de un paralelo G-quadruplex [47]. Con el fin de investigar si C14B1 forma una estructura G-quadruplex intermolecular 4 hebra o intramolecular de cadena sencilla, se estudió la dependencia de la temperatura de fusión de la concentración de C14B1 [48]. Se encontró que la temperatura de fusión de C14B1 ser 59 ° C, que era independiente de la concentración de oligonucleótidos (Figura S4), lo que indica que el aptámero forma un intramolecular G-quadruplex.
afinidad de unión y estabilidad estructura de C14B1 es K se han encontrado
+ dependiente
Muchas aptámeros de ADN para formar estructuras G-quadruplex [49] - [51]. Está bien establecido que la existencia de un catión monovalente (especialmente potasio) en el centro de estas tétradas puede estabilizar de manera significativa G-quadruplex [52] - [54]. Por lo tanto, se investigó cómo un catión afectaría a la estabilidad estructural de C14B1 y su actividad de unión hacia a AGR2. Como se muestra en la Figura 4a, la estabilidad de la estructura G-quadruplex C14B1 es fuertemente dependiente de la presencia del ion monovalente. Con 60 mM de KCl, se observaron fuertes picos de CD, lo que sugiere la formación de estructura G-quadruplex estable. Sustitución de KCl con la misma concentración de LiCl, NaCl, y MgCl
2 llevado a una disminución dramática en la intensidad de CD.
a) los espectros de CD de la C14B1 aptámero en presencia de diferentes cationes. Este aptámero tiene una banda positiva cerca de 260 nm que se puede asignar a una quadruplex estructuras paralelas. b) La estabilidad estructural del aptámero basa en gran medida en [K
+]. Se investigó c) Señal de fluorescencia migración de C14B1 unión a AGR2-cuentas a diferentes concentraciones de K
+. d) Las constantes de unión de C14B1 en el búfer w /w y /o K
+. Los datos fueron el promedio de los resultados del experimento por triplicado.
A continuación, estudiamos el efecto de K
+ concentración en la estabilidad del G-quadruplex. En la Figura 4b, la adición de 0,1 mM K
+ en tampón fosfato aumentado dramáticamente la intensidad CD en 240 y 260 nm. intensidad de absorción de CD mejorado con el aumento de K
+ concentración y alcanzó una meseta cuando K
+ concentración fue mayor de 20 mM. También se investigó la afinidad de unión de C14B1 a diferentes concentraciones de K
+. A medida que la citometría de flujo resultados mostrados en la Figura 4c, muy débil unión de C14B1 hacia AGR2-cuentas se observó cuando no había K
+ en el tampón, y la afinidad de unión siguió aumentando con la adición de K
+. Las constantes de unión de C14B1 se midieron y se compararon en presencia o ausencia de K
+ (Figura 4d). El
K
d
valor en presencia de K
+ se determinó que era 6,2 ± 1,9 nM. Los resultados demostraron que la formación de G-quadruplex es importante para la capacidad de unión de C14B1 aptámero a su objetivo, que es altamente K
+ dependiente.
alostérica balizas moleculares para la detección de AGR2
los estudios clínicos han demostrado que la proteína AGR2 se sobreexpresa en una amplia gama de cánceres humanos. La detección sensible y selectiva de AGR2 es por lo tanto de gran importancia para el diagnóstico del cáncer temprano. En este documento, mediante la aplicación de la C14B1 aptámero seleccionado y optimizado, diseñamos y desarrollamos una baliza molecular alostérico contra AGR2, llamado AGR2-AMB, que convierte la propiedad reconocimiento molécula de aptámero de flujo de fluorescencia citometría de señal para detectar AGR2 [55]. La Figura 5 ilustra el principio de funcionamiento de AGR2-AMB. Un AGR2-AMB es un ssDNA que consiste en un estreptavidina (SA) secuencia de aptámero [56], una secuencia C14B1, una secuencia corta de cortesía a una pequeña parte de la secuencia de aptámero SA, y un fluoróforo. Una estructura de horquilla estable está formado por la hibridación intramolecular entre la secuencia de aptámero SA y la secuencia complementaria, la desactivación temporal de la capacidad de la sonda para unirse con SA perlas. En consecuencia, cuando se incubaron con perlas SA, ninguna sonda puede unirse a perlas SA, y las cuentas de mostrar fluorescencia muy baja. En presencia de AGR2, sin embargo, la secuencia de C14B1 en el bucle de AMB se une a la secuencia diana, que a su vez altera la estructura de horquilla para liberar a la secuencia de unión a SA, activando de este modo la afinidad de unión de la sonda a SA perlas. De este modo, la sonda unida a AGR2 se unirá a las perlas SA, que será fluorescente fuertemente debido a que la sonda se marca FAM. Las moléculas diana pueden ser detectados y cuantificados mediante la lectura de la intensidad de fluorescencia de perlas SA a través del citómetro de flujo
Hemos diseñado AGR2-AMB, con la siguiente secuencia:. CGACGCACCGATCGCAGGTTCGGGATTTTCGGGTGGGAGTTGTGGGGGGGGGTGGGAGGGTT-FAM, donde se subraya la región de unión AGR2 y la secuencia de aptámero SA está en negrita. estructura de horquilla estable está formado por la hibridación intramolecular (Figura S5). En nuestro experimento, cuando sólo AGR2-AMB incubó con perlas SA, ninguna sonda puede unirse a perlas SA, y las cuentas fluoresced muy débilmente. En presencia de AGR2, sin embargo, la intensidad de fluorescencia de perlas SA aumenta de manera significativa, lo que sugiere la unión de la sonda AGR2 unida a SA perlas. Con el aumento de la concentración de AGR2, se observó un aumento constante de la intensidad de fluorescencia de las perlas de destino. AGR2 a 100 nM de concentración puede detectarse fácilmente (Figura 6a). Una serie de proteínas, incluyendo BSA, tripsina, trombina, y la IgG se utilizaron como controles (500 nM), y no hay señales fluorescentes distintas se observó (Figura 6b), lo que indica una excelente especificidad de la AGR2-AMB hacia molécula diana. Los resultados demostraron la sensibilidad y especificidad de la sonda de baliza molecular alostérico, lo que implica su potencial para su aplicación en el análisis de muestras reales, tales como el estudio de la función de proteínas y diagnóstico de enfermedades.
a) Respuesta de AGR2-AMB a diferentes concentraciones de AGR2 en tampón Tris-HCl. b) Respuesta de AGR2-AMB a diferentes objetivos, incluyendo AGR2 (100 nM), BSA, IgG, tripsina y trombina (500 nM cada uno para proteínas de control). Los datos fueron el promedio de los resultados del experimento por triplicado.
Nuevas sondas de aptámeros
En conclusión, hemos desarrollado para el reconocimiento específico de la AGR2. En el proceso SELEX, la proteína AGR2-GST fusionado se usó como la proteína diana, y ligada a perlas de sefarosa mediante la interacción de GST-glutatión leve, pero específica, no covalente. SELEX basado-Beads permitió el uso de simple, pero eficaz, citometría de flujo análisis para controlar el progreso de la selección, evitando el tedioso, el tiempo y el proceso de EMSA radiactivo. A través de múltiples rondas de selección con GST como un control, hemos identificado aptámeros que reconocen selectivamente AGR2 con nanomolar
K
d
valores. mediciones de CD y ensayos de fusión de temperatura demostraron que la C14B1 aptámero óptima forma una estructura G-quadruplex paralelo intramolecular y su estructura y la afinidad de unión son fuertemente dependientes de la naturaleza del ion monovalente. Además, con nuestro diseño de AGR2-AMB, AGR2 podría ser sensible y detecta selectivamente Las secuencias de aptámeros y sensores informó aquí tiene un gran potencial para servir como una herramienta útil para el diagnóstico precoz y pronóstico del cáncer y para la investigación fundamental para dilucidar las funciones bioquímicas de AGR2.
Materiales y Métodos
diseño de la biblioteca inicial ¿
La biblioteca purificada por HPLC que contiene una secuencia al azar central de 45 nucleótidos flanqueada por dos imprimación 20-nt y 22-nt sitios de hibridación. biblioteca inicial fue: 5'-CGG TCT ACG CGT GTG GTC GG-N45-C TCG CTG CCT CCT GGC AGA GTG-3 ', cebador directo: 5'-FAM-TCT CGG ACG CGT GTG GTC GG-3', cebador inverso : 5'-biotina-CAC TCT GCC AGG AGG CAG CGA G-3 '
Preparación de la proteína fusionada GST-AGR2
el plásmido pGEX-GST-AGR2 se transformó en la cepa de ingeniería. se expresó BL-21 y la proteína marcada con GST AGR2. Después de la purificación con perlas de glutatión sefarosa (GE Healthcare) mediante cromatografía de afinidad, la proteína GST-AGR2 fusionado estaba ligada a sefarosa los granos para la selección positiva. Después de ser lavado varias veces con tampón de W1 (Tris-HCl 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,07% β-mercaptoetanol, 1% de Triton X-100), los AGR2-GST-cuentas finales purificados se almacenaron en tampón de PBS esterilizado. Análisis de citometría de flujo con un anticuerpo marcado con TAMRA anti-AGR2 monoclonal (Santa Cruz) y SDS-PAGE indicó que la proteína GST-AGR2 fusionado estaba vinculado con éxito a las perlas de sefarosa.
La selección de aptámeros de unión AGR2
Los procedimientos de selección fueron los siguientes. La combinación de ADNss (200 pmol) disuelto en tampón de unión (200 l, 1 x tampón PBS que contenía NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na 10
2HPO
4 y KH 2,0 mM
2 PO
4, pH 7,4) se desnaturalizó por calentamiento a 95 ° C durante 5 min, después se enfrió rápidamente en hielo durante 10 min, y posteriormente se incubaron durante otros 10 minutos a temperatura ambiente antes de la unión. A continuación, la combinación de ADNss se incubó con perlas de GST negativos (1,0 × 10
5 perlas) para la selección en contra de eliminar las secuencias de unión no específica a las perlas de GST. Después de filtrar con un filtro de columna hecha en casa, el filtrado se incubó con AGR2-GST-cuentas positivas (1,0 x 10
5 cuentas) a 37 ° C durante 45 minutos. Los oligoes no unidas o no específicamente unidas se eliminaron por filtración. Las secuencias unidas a las perlas recubiertas de destino-A continuación, se amplificaron por PCR con FAM y cebadores marcados con biotina (5-15 ciclos de 0,5 min a 94 ° C, 0,5 min a 53 ° C, y 0,5 min a 72 ° C, seguido por 5 min a 72 ° C; la Easytaq más polimerasa y dNTPs se obtuvieron de Transgen Beijing). Después de la desnaturalización en NaOH (0,1 M), el sentido seleccionado ssDNA se separó de la hebra antisentido ssDNA biotinilado sobre perlas de sefarosa recubiertas de estreptavidina (GE Healthcare) y usó para la siguiente ronda de selección. Para la selección de primera ronda, la cantidad de ssDNA grupo inicial fue de 5 nmol, disuelto en tampón de unión 500 l, y la etapa de contra-selección fue eliminada. Para adquirir aptámeros con alta afinidad y especificidad, la fuerza selección se mejoró gradualmente al aumentar el número de lavados (de tres a diez veces con 200 l 1 × tampón PBS cada uno) y la disminución de la cantidad de la biblioteca de ADNss por ronda (de 200 a 150 pmol).
la clonación y secuenciación del ADN
la piscina resultante de la 14
ª ronda fue amplificado por PCR, clonado y secuenciado (instalación de secuenciación Shanghai Sangon). Las 62 secuencias resultantes se sometieron a análisis de alineación de secuencias múltiples utilizando Clustal W 6.0 software para descubrir los motivos altamente conservados en grupos de secuencias de ADN seleccionadas. Las secuencias de consenso descubiertos con altas repeticiones entre piscinas seleccionados se sintetizaron químicamente para su análisis posterior.
Flujo de análisis de citometría de
Para controlar el enriquecimiento de los aptámeros después de la selección, la combinación de ADNss marcado con FAM se incubó con 5 × 10
4 AGR2-GST o GST-perlas-cuentas en tampón (200 l) que se une a 37 ° C durante 45 minutos. Las perlas se lavaron tres veces con 200 l de tampón de unión por medio de filtración, y se suspendieron en tampón de unión (250 l). La intensidad de fluorescencia de las perlas resultantes se controló con un citómetro de FACSAria (Becton Dickinson Immuno citometría de sistemas) contando 10000 eventos. Las afinidades de unión de los aptámeros se determinaron mediante la incubación de AGR2-GST-cuentas (5 × 10
4) con varias concentraciones de aptámeros marcadas con FAM (tratado-pre-calor) en tampón (200 l) de unión a 37 ° C durante 45 min en la oscuridad. entonces perlas se lavaron tres veces con el tampón de unión, a continuación, se resuspendieron en tampón (250 l) de unión y se sometió a análisis de citometría de flujo. La biblioteca de ADNss no seleccionado marcado con FAM se utilizó como control negativo para la evaluación unión no específica. Todos los experimentos de unión se repitieron dos a cuatro veces. Se utilizó la intensidad media de fluorescencia de la proteína diana marcada por aptámeros para evaluar la afinidad de unión restando la intensidad media de fluorescencia de unión no específica producida por la biblioteca no seleccionada ssDNA. Las constantes de disociación (
K
d
) de los ligandos fluorescentes se obtuvieron mediante el ajuste de la dependencia de la intensidad de fluorescencia de la unión de la concentración de los ligandos a la ecuación (1) específico: Y = B
maxX /(
K
d
+ X) usando el software SigmaPlot.
espectroscopía de dicroísmo circular
CD mediciones se llevaron a cabo en un espectropolarímetro Jasco J-810 equipada con una unidad de control de temperatura programable (Julabo HP-4). La concentración de muestras de ADN fueron 2 mM. Antes de la medición del espectro de CD, las muestras de ADN se hibridaron por calentamiento a 95 ° C durante 5 min, después se enfrió rápidamente en hielo durante 10 min, y se incubaron durante otros 10 min a temperatura ambiente. Los espectros de 400 a 200 nm se obtuvieron mediante el uso de 1 nm anchura de la ranura y resolución de escaneado 0,1 nm. Cada espectro de DC era un promedio de 8 exploraciones con el fondo tampón sustraído.
experimento UV-térmica desnaturalización
absorbancia UV y la fusión de los estudios se realizaron en un espectrofotómetro Agilent 8453 equipado con una temperatura programable -control unidad (Agilent 89090A). Las temperaturas de fusión (T
m) se toma como la temperatura del medio-disociación del quadruplex y se obtuvieron a partir del máximo de las primeras parcelas dA /dt derivados a 295 nm. Las soluciones de ADN tratadas con calor a varias concentraciones se introdujeron en una cubeta de cuarzo y recubrieron con una fina capa de aceite de silicona para evitar la evaporación. La longitud del camino óptico fue de 1 cm. Absorbencia y la temperatura se registraron todos los 2 ° C.
Evaluación de AGR2-AMB
AGR2-AMB (40 nM) fue recocida por calentamiento a 95 ° C durante 5 minutos en 200 l de Tris HCl buffer (25 mM Tris-HCl, NaCl 120 mM, KCl 0,5 mM, MgCl 2
2 a pH 7,4), y después se enfrió rápidamente en hielo durante 10 min, y posteriormente a la espera de otro 10 min a temperatura ambiente antes utilizar. A la solución de AGR2-AMB, se añadieron diversas concentraciones de AGR2 y se permitió que las soluciones resultantes incubar a 37 ° C durante 30 min. A la mezcla, 1 l de perlas de estreptavidina (aproximadamente 5 x 10
4 perlas) se añadieron y la mezcla se dejó reposar durante 45 min en la oscuridad. Después de lavar dos veces con tampón Tris-HCl, SA perlas se filtraron para eliminar no unido AGR2-AMB y se resuspendieron en Tris-HCl solución tampón 250 l antes de citometría de flujo análisis.