Extracto
Las células madre del cáncer (CSC) representan una única subpoblación de células tumorales con la capacidad de iniciar y sostener el crecimiento del tumor auto-renovación. Aunque biomarcadores CSC se han descrito para varios tumores, sólo unos pocos marcadores se han identificado para el carcinoma nasofaríngeo (NPC). En este estudio, mostramos que las células CD24
+ aisladas de líneas celulares NPC humanos expresan los genes de células madre (
Sox2
,
Oct4
,
Nanog
,
Bmi-1 |, y
Rex-1 |), y muestran la activación de la vía de señalización /β-catenina vía. CD24
+ células poseen características típicas de CSC que incluyen una mayor proliferación celular, aumento de la colonia y la formación de esfera, el mantenimiento del potencial de diferenciación de células en cultivo prolongado, y una mayor resistencia a los fármacos quimioterapéuticos. En particular, CD24
+ células producen tumores después de la inoculación de tan sólo 500 células en inmunodeficientes NOD /SCID. CD24
+ células muestran además aumentó la capacidad de invasión
in vitro
, que se correlaciona con una mayor expresión de metaloproteinasas de matriz 2 y 9. En resumen, nuestros resultados sugieren que CD24 representa un nuevo biomarcador CSC en la APN.
Visto: CH Yang, Wang NS, Lin YS, Kumar KPS, Lin HC, Chang CJ, et al. (2014) Identificación de CD24 como marcador de células madre del cáncer en humanos carcinoma nasofaríngeo. PLoS ONE 9 (6): e99412. doi: 10.1371 /journal.pone.0099412
Editor: Masaharu Seno, Universidad de Okayama, Japón
Recibido: 4 Julio, 2013; Aceptado: 14 de mayo de 2014; Publicado: 23 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas NSC101-2325-B-182-005 y NSC101-2320-B-030-011 del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán, y otorgar CMRPD1B0052 del hospital Memorial Chang Gung (Linkou, Taiwán). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción las tasas de incidencia
APN varían en todo el mundo, pero son más altas en el sudeste de Asia, especialmente en la provincia china de Guangdong, así como en Hong Kong y Taiwán [1]. incidencia intermedia de la APN se observa en los países de la cuenca mediterránea, así como Groenlandia y Alaska, mientras que una baja incidencia se encuentra en la mayoría de los países occidentales [2]. En Taiwán, la incidencia de hembras y machos en 2007 fue de 2,93 y 8,41 casos por cada 100.000 personas, respectivamente [3]. NPC por lo general muestra relativamente alta sensibilidad a la radiación, y por lo tanto la radioterapia es el tratamiento principal para la etapa inicial de la APN [4], [5]. Aunque la combinación de radioterapia y quimioterapia ha mejorado los resultados del tratamiento para los pacientes en estadio avanzado de la APN, la recurrencia del cáncer sigue siendo frecuente [6].
Identificación y caracterización de las células iniciadoras de tumores, también llamado cáncer de células madre (células madre cancerosas ), ha puesto de manifiesto los mecanismos celulares que podrían explicar la refractariedad al tratamiento y el comportamiento en estado latente de muchos tumores [7]. La hipótesis de las células progenitoras de desarrollo de cáncer sugiere que sólo una pequeña subpoblación de células dentro de un tumor (el CSC) tiene tallo-como las propiedades y la capacidad de iniciar nuevos tumores [8]. CSC no sólo pueden iniciar los tumores primarios, pero también puede ser responsable de recurrencia después del tratamiento, un fenómeno que puede ser debido a la capacidad de auto-renovación y quimio- y radio-inherente resistencia de estas células [9]. CSC se han identificado y aislado a partir de varios tumores usando marcadores de superficie celular específicos, incluyendo CD44 para el cáncer de cabeza y cuello [10], CD133 para el cáncer de próstata [11], CD90 para el tumor de hígado [12], CD24 para el cáncer de ovario [13], CD133 para el tumor cerebral [14], CD44
+ CD24
-. /baja para el cáncer de mama [15], y CD133 para el cáncer de pulmón [16]
a pesar de biomarcadores específicos se han utilizado para aislar CSC, cada tipo de tumor muestra marcadores de superficie celular específicos [17]. Para aislar potenciales subpoblaciones de células madre cancerosas de tumores en los que aún no han sido identificados biomarcadores CSC, los investigadores han hecho uso de la capacidad de las células madre cancerosas para excluir a los tintes, Hoechst 33342 o PKH26 [18] - [20]. Usando este método, una subpoblación de células que muestran características CSC se ha identificado en NPC [21], [22]. Sin embargo, el aislamiento de NPC CSC utilizando los responsables de la superficie celular no ha sido posible hasta ahora, con la excepción de CD44, que se identificó en un informe anterior [23]. En el presente estudio, se describe el aislamiento de una subpoblación de CD24
+ células a partir de dos líneas celulares de la APN, y demostrar que las células aisladas expresan marcadores de genes de células madre. El aislado CD24
+ células muestran características típicas de CSC, e iniciar el crecimiento del tumor en ratones diabéticos no obesos /inmunodeficiencia combinada severa (NOD /SCID) en un número bajo de células. También se observaron mayor capacidad de invasión y la expresión aumentada de metaloproteinasa 2 y 9 (MMP2 y MMP9). Nuestras observaciones sugieren que CD24
+ células representan un biomarcador CSC en la APN humana. Estos hallazgos podrían conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la APN células madre cancerosas en pacientes humanos.
Resultados
El aislamiento de una subpoblación de CD24
+ células de líneas celulares NPC
Para caracterizar las células con marcadores de superficie celular específicos, se analizaron varias líneas de células NPC usando citometría de flujo y anticuerpos monoclonales que reconocen marcadores de la superficie celular. Se determinó el porcentaje de células que albergan uno de los marcadores 12 de superficie específicos para las células madre [24], [25] o las células del cáncer [26] (Tabla 1). CD24 se encuentra en 12,03% de las células cultivadas TW02 y en 5,45% de TW04 células, mientras que se encontró en un menor porcentaje de células para las otras líneas de células NPC analizadas (Tabla 1 y Figura 1). El porcentaje de células que albergan los otros 12 marcadores fue muy desigual, con valores que van desde 0 hasta 99,99% (Tabla 1). De acuerdo con un estudio previo en el que se identificó CD44 como un biomarcador CSC en NPC [23], nuestros resultados mostraron que la gran mayoría de CD24
+ células también eran CD44 + (Figura 1). Por lo tanto, nos centramos nuestra atención en CD24
+ células como potenciales candidatos CSC.
La citometría de flujo análisis de CD24
+ y CD44
+ subpoblaciones de TW02 y TW04 células. 1 × 10
se recogieron y se tiñeron con CD24-isotiocianato de fluoresceína anti-humano (FITC) y /o anticuerpos CD44-ficoeritrina anti-humano (PE) 6 células cancerosas. Los anticuerpos humanos del mismo isotipo sirvieron como control.
La expresión de genes de células madre y la activación de la vía Wnt /β-catenina en CD24
+ células
Para examinar si CD24
+ células tienen propiedades de células madre intrínsecas, se analizó la expresión de cinco genes de células madre embrionarias (
Sox2
[27],
Oct4
[28] - [30] ,
Nanog
[31],
Bmi-1 | [32], y
Rex-1 | [33]) en TW02 y TW04 celulares líneas que se utilizaron como representante células NPC. Como se indica en la figura 2A, CD24
+ células expresan consistentemente niveles más altos de los cinco genes de células madre que los padres o CD24
-.
Células
(A) los niveles de expresión de ARNm de
Sox2
,
Oct4
,
Nanog
,
Bmi-1 | y
Rex-1 Hoteles en los padres, CD24
+ y CD24
- las células de las líneas celulares de la APN, TW02 (izquierda) y TW04 (derecha), fue evaluada utilizando análisis de RT-PCR cuantitativa. Los resultados mostrados representan la media de tres experimentos independientes. *:
p Hotel & lt; 0,05, **:
p Hotel & lt; 0,01. (B) Análisis de transferencias Western de fosforilada por GSK, GSK, fosforilada-β-catenina, β-catenina y la β-actina en los lisados de células enteras, y de β-catenina y lamina B1 en las fracciones nucleares de los padres, CD24
+ y CD24
- células aisladas de las líneas celulares TW02 y TW04. resultado cuantitativo se calculó mediante el software ImageJ. *:
p Hotel & lt; 0,05, **:
p Hotel & lt; 0,01, ***:.
p Hotel & lt; 0,001
informes anteriores han indicado que la activación de la vía de señalización /β-catenina Wnt es crucial para el mantenimiento de células madre cancerosas en la leucemia [34], cáncer de mama [35], melanoma [36], adenoma colorrectal [37], y el cáncer de hígado [ ,,,0],38]. Esta vía celular también regula la auto-renovación, la proliferación y la diferenciación de las células madre, como el cáncer en el cáncer gástrico [39]. Por otra parte, en la ruta de Wnt, β-catenina desempeña un papel crucial en la regulación de la invasión y metástasis de numerosos tumores [40]. lo tanto, examinar el estado de la vía /β-catenina en el CD24 aislado
+ células. Los niveles de β-catenina fosforilada se redujeron significativamente en el citosol de CD24
+ células, en comparación con los padres o CD24
- células (Figura 2B). Además, los niveles de 3β fosforilada glucógeno sintasa quinasa (p-GSK-3β), que actúa como un regulador negativo de β-catenina, fueron mayores en CD24
+ células. Al mismo tiempo, se observaron mayores niveles de β-catenina en las fracciones nucleares de CD24
+ células (Figura 2B), lo que sugiere que la vía de señalización /β-catenina vía se activa en estas células.
mayor proliferación y formación clon /esfera de CD24
+ células
Se midió la tasa de proliferación de CD24
+ células cultivadas en DMEM completo. En comparación con los padres y CD24
- células, CD24
+ células mostraron una mayor proliferación, a partir de la 5
º día de la cultura para TW02 células y el 7
º día de TW04 células, con tiempos de duplicación de alrededor de 42 h, 42 h, y 30 h para TW02 parental, CD24-, y las células CD24 +, respectivamente, y de 40 h, 40 h y 28 h para TW04 parental, células CD24- y CD24 + (Figura 3A). La eficiencia en la formación clon (CFE) de CD24 también se determinó
+ células. Después de 10 días de cultivo, cuando la mayoría de los clones eran susceptibles de contener más de 50 células, los valores de CFE calculados de TW02 células fueron 15,1%, 80,8% y 12,2% para los padres, CD24
+ y CD24
- células, respectivamente. Para TW04 células, se obtuvieron valores de CFE de 20.2%, 90.3% y 13.0% para los padres, CD24
+ y CD24
- células, respectivamente (Figura 3B). La formación de agregados de células esferoides (o simplemente esferas), lo que es indicativo de la capacidad de auto-renovación, se analizó adicionalmente mediante el cultivo de las células en condiciones no adherentes que consta de DMEM libre de suero que contiene sólo el factor de crecimiento epitelial (EGF) y de fibroblastos básico factor de crecimiento (bFGF). Después de 30 días de cultivo, CD24
+ células mostraron el mayor número de esferas, alcanzando diámetros entre 100 y 200 micras, mientras que las células parentales y CD24
- células formadas número significativamente menor de esferas, con diámetros inferiores a 100 micras (Figura 3C ). Estos resultados indican que CD24
+ células muestran una proliferación y capacidad para formar clones mejorados /esferas
(A) Curvas de proliferación celular de los padres, CD24
+ y CD24
-. Células de la TW02 (izquierda) y TW04 (derecha) de la APN líneas de células cultivadas en DMEM completo durante 9 días. Los resultados mostrados representan la media de tres experimentos independientes. *:
p Hotel & lt; 0,05, **:
p Hotel & lt; 0,01, ***:
p Hotel & lt; 0,001. eficiencia (B) Clon formación de los padres, CD24
+ y CD24
- las células, y el análisis de cuantificación. *:
p Hotel & lt; 0,05. (C) Esfera capacidad formación de los padres, CD24
+ y CD24
- células cultivadas en DMEM suplementado con 20 ng /ml de bFGF y 20 ng /ml de EGF durante 30 días. (D) Efecto del inhibidor de Wnt en la formación de esferas por CD24
+ células en TW02 y TW04 células. CD24
+ células fueron tratadas o no con el inhibidor de Wnt ICG-001 (10 M) durante siete días anteriores a la esfera análisis de la formación. Las barras de escala:. 100 micras
También examinaron los efectos del inhibidor de Wnt ICG-001 en la capacidad de formación de ámbito de CD24
+ células. Después del tratamiento con el inhibidor de Wnt durante 7 días (10 M), el tamaño de esfera se redujo considerablemente en un promedio de 20% y 45% en TW02 y TW04 células, respectivamente (Figura 3D), lo que sugiere que la vía de Wnt puede contribuir a la CSC fenotipo de CD24
+ células.
potencial de diferenciación
a largo plazo de CD24
+ células
Un cultivo a largo plazo de las células madre cancerosas pueden aumentar su masa celular, sino también someterse a la división asimétrica para generar una población de células tumorigénicas bajo con fenotipos heterogéneos [9]. Para supervisar el potencial de diferenciación de las células CD24
+ células, se analizaron las culturas antiguas de 10 días de CD24
+ y CD24
- células mediante citometría de flujo. Después de cultivar las células TW02 durante 10 días, 11,56% de CD24
+ células se mantuvieron CD24
+, mientras que el 0,14% de las células que estaban inicialmente CD24
- CD24 expresado después del cultivo (Figura 4A). Del mismo modo, después del cultivo de TW04 células, 5.64% de CD24
+ células se mantuvieron CD24
+, mientras que 0,03% de las células que eran CD24
- inicialmente eran CD24
+ después del cultivo (Figura 4B). Estos resultados sugieren que CD24
+ células muestran potencial de diferenciación de células después del cultivo prolongado, aunque el proceso de diferenciación puede ser sólo parcial en estas condiciones.
(A) Para diez días masas de células viejas originalmente cultivadas a partir de CD24
+ y CD24
- se cosecharon cultivos de células en medio DMEM, y se tiñeron con anticuerpo anti-humano isotiocianato de CD24-fluoresceína (FITC), seguido por citometría de flujo análisis. Los porcentajes indicados representan células con CD24
+ marcadores de superficie, de (A) TW02 o (b) líneas celulares TW04. La citometría de flujo análisis de TW02 y TW04 células inmediatamente después de sub-fraccionamiento (paneles de la derecha).
CD24
+ células muestran una resistencia a los fármacos quimioterapéuticos mejorado
Mayor resistencia a los fármacos quimioterapéuticos representa una característica crítica de los CAC [9]. Estudios previos han informado de que las CSC pueden excluir el colorante de unión a ADN, Hoechst 33342, debido a una mayor expresión del transportador ABC, ABCG2 [41], [42]. Para determinar si CD24
+ células no incluyen Hoechst 33342 mejor que los padres o CD24
- células, se realizó el ensayo de exclusión de colorante después de tratar TW02 células con el inhibidor del transportador ABC, verapamil [43]. Como se muestra en la Figura 5A, una mayor población de células negativas 33342-Hoechst se observó para CD24
+ células (12,9%) en comparación con CD24
- células (7,99%). En particular, el tratamiento verapamil invertido el fenotipo de exclusión del colorante observado en CD24
+ células, mientras que este tratamiento no tuvo efecto significativo en CD24
- células (Figura 5A). Se obtuvieron resultados similares para la línea celular TW04 (verapamilo produjo ningún efecto significativo en este caso, ya que casi no TW04 CD24
- células fueron Hoechst 33342-negativo). Estas observaciones sugieren que CD24
+ células poseen una mayor capacidad para excluir tinte
(A) Ordenada CD24
+ y CD24
-. Se trataron células de las líneas celulares TW02 y TW04 NPC o no con 50 mM verapamil durante 30 min antes de la elaboración para el ensayo de exclusión de colorante Hoechst 33342 como se describe en Materiales y Métodos. (B) de los padres, CD24
+, y CD24
- células de las líneas TW02 o TW04 de células se trataron con varias concentraciones de cisplatino y docetaxel durante 24 h, y la viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTT. CD24
+ células mostró viabilidad superior a los padres y CD24
- células después del tratamiento con cisplatino o docetaxel. Los resultados mostrados representan la media de tres experimentos independientes. *:
p Hotel & lt; 0,05, **:
p Hotel & lt; 0,01, ***:
p Hotel & lt; 0,001. IC
50 valores de tratamiento con cisplatino o docetaxel contra los padres, CD24
+ y CD24
-. Se demostró que las células de (C) TW02 y (D) TW04 líneas de células
para examinar si CD24
+ células muestran una mayor resistencia a los fármacos quimioterapéuticos, se trataron las células con cisplatino o docetaxel, y la viabilidad celular evaluó mediante el ensayo MTT. Cisplatino y docetaxel producen mayores efectos citotóxicos contra los padres o CD24
- las células en comparación con CD24
+ células (Figura 5B,
p Hotel & lt; 0,01). Para la línea celular TW02, la media máxima concentración inhibitoria (IC
50) de cisplatino en contra de los padres, CD24
+ y CD24
- células fue 1,84, 3,32 y 1,66 g /ml, respectivamente, mientras el CI
50 valores de docetaxel contra los padres, CD24
+ y CD24
- células fue 4,23, 7,45 y 3,53 mg /ml, respectivamente (Figura 5C). Para la línea celular TW04, cisplatino produjo IC
50 valores de 0,70, 2,45 y 0,46 mg /ml frente a los padres, CD24
+ y CD24
- células, respectivamente, mientras que la IC
50 de docetaxel fue de 1,50, 3,93 y 1,41 mg /ml frente a los padres, CD24
+ y CD24
-. células, respectivamente (Figura 5D)
también observaron que los niveles de proteína de la ABC transportador ABCG2 fueron 1,42 y 2,12 veces mayor en CD24
+ células que en los padres y CD24
- células, respectivamente (Figura 6A). Del mismo modo, en TW04 células, los niveles de proteína de ABCG2 en CD24
+ células fueron 1,85 y 3,56 veces mayor que en los padres y CD24
- células, respectivamente (Figura 6A). De acuerdo con estos resultados, el nivel de expresión de ARNm de
ABCG2
fue mayor en CD24
+ células que en los padres o CD24
- células (Figura 6B). Estos resultados indican que CD24
+ mostrar células quimio-resistencia mejorada, y que este fenotipo puede atribuirse, al menos en parte para aumentar la expresión del transportador ABCG2.
(A) los niveles celulares de proteínas ABCG2 en los padres, CD24
+, y CD24
- TW02 y TW04 células se determinaron por análisis de transferencia Western. resultado cuantitativo se calculó mediante el software ImageJ. *:
p Hotel & lt; 0,05, **:
p Hotel & lt; 0,01. (B) El nivel de expresión de ARNm de ABCG2 en los padres, CD24
+ y CD24
- TW02 y TW04 células se determinó por RT-PCR cuantitativa. Los resultados mostrados representan la media de tres experimentos independientes. *:
p Hotel & lt; 0,05, **:.
p Hotel & lt; 0,01 células
Un pequeño número de CD24
+ es suficiente para producir tumores en ratones NOD /SCID ratones
Hemos probado el potencial tumorigénico de CD24
+ células después de la inyección en la fosa axilar del inmunodeficientes NOD /SCID. Doce semanas después de la inyección, se detectaron tumores en ratones inoculados con ya sea 500 o 1000 CD24
+ células, pero no en los ratones tratados con 100 CD24
+ células (Figura 7A). En contraste, no se detectaron tumores en ratones inoculados con células ≤1,000 en el parental o CD24
- grupo (Figura 7A y 7B). Del mismo modo, no se detectaron tumores en los ratones que recibieron PBS como control negativo (Figura 7A). Además el análisis histológico de secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E) confirmó la presencia de un carcinoma de células escamosas de la nasofaringe y queratinizante de carcinoma epidermoide bien diferenciado en el sitio donde se inyectaron inicialmente CD24
+ células (Figura 7C). La inyección de un pequeño número de CD24
+ células es por lo tanto suficiente para inducir la formación de tumores en ratones inmunodeficientes.
(A) formación de tumores después de la inyección de CD24
+ células. Los grupos de ratones NOD /SCID seis fueron inyectados con 100, 500 ó 1.000 recién ordenados CD24
+ o CD24
- células de la TW02 (izquierda) o TW04 (derecha) línea celular. Los ratones inyectados con PBS se utilizaron como un control negativo. La formación de tumores se evaluó 12 semanas después de la inoculación celular. (B) Los ratones inyectados con TW02 (izquierda) o células TW04 (derecha) se sacrificaron para la evaluación de la formación de tumores doce semanas después de la inoculación. Las flechas indican la presencia de tumores en ratones inyectados con 500 o 1000 CD24
+ células. (C) Tejido H & amp; E resultados de la tinción de TW02 (izquierda) y ratones TW04 (derecha) se inocularon con 500 células. La inoculación de tan sólo 500 CD24
+ células produce signos histológicos de tumores en el sitio de la inyección. Células
Enhanced potencial de invasión y la producción de metaloproteinasa de CD24
+
En estudios previos, muchas poblaciones CSC mostraron una mayor capacidad de invasión en comparación con los no-células madre cancerosas [44], [45]. El uso de un ensayo de invasión in vitro, se observó que CD24
+ células eran más invasivo que los padres o CD24
- células (Figura 8A). Dado que las metaloproteinasas juegan un papel importante en la invasión de células [46], se examinó el nivel de proteínas de MMP2 y MMP9 en estas células. Como se muestra en la Figura 8B, CD24
+ poblaciones de células mostraron un incremento en los niveles de proteína MMP2 y MMP9 en comparación con los padres o CD24
- células. De acuerdo con estos resultados, se observó que las células CD24
+ aisladas de las líneas celulares o TW02 TW04 expresan mayores niveles de MMP-2 y MMP9 ARNm que los padres o CD24
- células (Figura 8C). CD24
+ células también expresó bajos niveles de mRNA de la E-cadherina que los padres o CD24
- células (Figura 8C). por lo tanto CD24
+ células muestran una mayor invasión y aumento de la expresión de MMP-2 y MMP9 pero la expresión de E-cadherina reducidos.
(A) El ensayo de invasión celular se realizó utilizando el ensayo de cámara transwell, tal como se describe en Materiales y Métodos. membranas de Matrigel que contenían células invasoras se observaron por microscopía óptica, y se contaron las células. se cuantificó el número de células invasoras de cada población de células. Los resultados mostrados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes. **:
p Hotel & lt; 0,01, ***:
p Hotel & lt; 0,001 (B) Los niveles de MMP-2 y la proteína MMP9 producidos por los padres, CD24
+ o CD24
- células de las líneas celulares TW02 y TW04 se cuantificaron por análisis de transferencia de Western. resultado cuantitativo se calculó mediante el software ImageJ. *:
p Hotel & lt; 0,05. (C) Los niveles de expresión de ARNm de la MMP-2 y MMP9 en los padres, CD24
+ y CD24
- células fueron determinados por RT-PCR cuantitativa de las líneas celulares TW02 y TW04. Los resultados mostrados representan un promedio de tres experimentos independientes. *:
p Hotel & lt; 0,05, **:.
p Hotel & lt; 0,01
Discusión
Los resultados del presente estudio sugieren CD24 que representa un nuevo marcador de superficie CSC en la APN. Las características de CD24
+ células subpoblaciones aisladas de las líneas celulares TW02 y TW04 NPC son similares a los reportados previamente para células madre cancerosas derivadas de NPC [21] - [23]. Estas características incluyen el aumento de la expresión de genes implicados en el desarrollo y mantenimiento de las células madre, el aumento de la auto-renovación y mantenimiento de la capacidad de diferenciación de las células después del cultivo prolongado, capacidad de formación de aumento de la esfera (también observado en CD24
+ células aisladas a partir de las líneas celulares de la APN HK1 y TW076; ver Figura S1), el aumento de Hoechst 33342 exclusión de colorante y la quimiorresistencia, aumento de la capacidad de iniciar tumores en ratones inmunodeficientes, y la invasión de células mejorado
La proteína de superficie celular, CD24, es altamente expresado en muchas humano. tipos de cáncer [13], [48], [49]. CD24 expresado en las células de cáncer interacciona con P-selectina se encuentran en las células endoteliales, lo que indica que CD24 puede unirse a P-selectina e iniciar la rodadura de las células cancerosas en el endotelio, que puede ser seguido por la iniciación de metástasis [47]. Además de las células de la APN, CD24 se asocia con las CSC de otros tumores, como el de ovario [13] y el cáncer de páncreas [48]. Por ejemplo, CD24
+ CD44
+ ESA
+ células de cáncer de páncreas poseen propiedades CSC [48]. Recientemente, se informó de un hallazgo similar en células madre cancerosas de ovario; es decir, una inyección de xenoinjertos de 5.000 CD24
+ células tumores en ratones desnudos producido, mientras que la inyección de un número igual de CD24
- células no lo hizo [49]. Además, las colonias CD24
+ de células de cáncer aislados de tumores de ovario de un paciente humano mostraron heterogeneidad en la tasa de proliferación, la distribución del ciclo celular, y el perfil de expresión de genes y proteínas, y demostraron propiedades de células madre [49]. Por otra parte, CD24
+ células madre similares detectados en el cáncer de ovario también mostraron una mayor quimio-resistencia [50]. En particular, en el cáncer de mama, la ausencia de CD24 se combina con la presencia de CD44 y EpCAM (CD24
-CD44
+ EpCAM
+) parece ser crítica para la identificación de células madre cancerosas de mama [15]. Un estudio previo ha informado de que CD44 representa un biomarcador CSC en NPC [23]. En consonancia con este hallazgo, el CD24
+ células aisladas a partir de que TW02 y TW04 líneas celulares NPC eran en su mayoría CD44
+ (Figura 1B). Además, la gran mayoría de CD24
+ células en el HK1 y líneas celulares TW076 también eran CD44
+ (Figura S2). Tanto CD24 y CD44 pueden así estar involucrados en la formación de células madre cancerosas en la APN, y la función de estas proteínas en el desarrollo y mantenimiento de CSC objeto de nuevas investigaciones.
Hemos observado que CD24
+ células aisladas de las líneas celulares TW02 y TW04 NPC expresan altos niveles de ARNm de
Sox2
,
Oct-4
,
Nanog
,
Bmi-1 |, y
Rex-1 |, en comparación con los padres o CD24
- células. Un fenómeno similar se observó también en HK1 y líneas celulares TW076 (Figura S3). Estas características son similares a los reportados para las células madre embrionarias [27] - [33] y las células de cáncer de ovario madre-como [51]. Este patrón de expresión génica de células madre embrionarias en CD24
+ NPC CSC indica la presencia de un patrón conservado de la expresión génica de células madre en células madre embrionarias y células madre cancerosas. En las células madre embrionarias, la co-expresión de
Sox2
,
Oct-4
,
Nanog
, y
Rex-1
es esencial para el mantenimiento de pluripotencia y auto-renovación, e impide la diferenciación celular a lo largo del linaje de células del trofoblasto [30], [33].
Sox2
y
Oct-4
codifican factores de transcripción que mantienen la auto-renovación y pluripotencia en el estado indiferenciado de células madre embrionarias mediante la modulación de los genes que mantienen la estructura de la cromatina permisiva y la reparación del ADN, y previenen la apoptosis [ ,,,0],52]. Por otro lado, la expresión de
Nanog
, que también es un factor de transcripción implicado críticamente en la auto-renovación, está regulada positivamente por
Sox2
y
Oct-4
[53]. Estos factores de transcripción forman una red regulación transcripcional funcional que es crítico para el mantenimiento de la pluripotencia en células madre embrionarias [53]. Por otra parte, el grupo Polycomb gen (PcG)
Bmi-1 | silencios
Hox
genes a través de la modulación de la estructura de la cromatina durante el desarrollo embrionario de moscas de la fruta, y, posiblemente, pueden potenciar la actividad proliferativa de las normales y células madre leucémicas [32]. A medida que la expresión de
Bmi-1 | está regulada negativamente por
PTEN
, que actúa como un gen supresor tumoral [54], el aumento de expresión de
Bmi-1 | puede correlacionar con la represión de
Pten
expresión y la inducción de la transición epitelial-mesenquimal, así como aumento de la motilidad e invasividad de las células epiteliales nasofaríngeas humanas [54]. Nuestros resultados muestran que el CD24
+ subpoblación de células NPC también expresa genes de las células madre y exhibe características de células madre auto-renovación y la capacidad proliferativa mejorada.
La vía de señalización /β-catenina vía, que se ha informado para regular la función de células madre y las interacciones de células madre nicho-[56], aumenta la expresión de
Sox2
y
Oct-4
[55]. Por otra parte, la reducción de la expresión de ARNm de E-cadherina se observó por Gao et al. en CD24
+ células madre del cáncer de ovario [49]. Estas observaciones indican que la pérdida de expresión de E-cadherina puede permitir β-catenina para volver a localizar al núcleo y activar la actividad transcripcional [57]. En este estudio, el aumento de la fosforilación de GSK-3β, la fosforilación de β-catenina reducida, y la translocación nuclear de β-catenina se observaron en CD24
+ células, en comparación con los padres o CD24
- células (Figura 2). Estas observaciones indican que la vía de señalización /β-catenina vía se activa en CD24
+ células
Nuestros resultados que CD24
+ células NPC son más invasivos que los padres o CD24
-. NPC células son consistentes con los resultados de estudios anteriores sobre células madre cancerosas en páncreas [58], de pulmón [19], y el cáncer de próstata [59]. Junto con el aumento de la capacidad de invasión, marcadores celulares que caracterizan la invasión de células, tales como MMP2 y MMP9, fueron también aumentaron en niveles más altos en CD24
+ células. MMP2 y MMP9 están involucrados en la degradación de la matriz extracelular, y un aumento en la expresión de ambas enzimas induce capacidad invasión de células [60]. Zhou et al. sugirió que el polimorfismo genético en el promotor de MMP-2 puede explicar la mayor susceptibilidad de los individuos chinos para el desarrollo de NPC [61]. el análisis de microarrays revela que MMP1 y MMP2 son los genes regulados positivamente manera más significativa en las biopsias de la APN, en comparación con lymphohyperplasia, tejidos adenoides, y cáncer de cabeza y cuello [62]. Por otra parte, los estudios realizados en biopsias de tumores NPC o líneas celulares con una mayor capacidad invasiva o transiciones epitelio-mesénquima también reveló una mayor expresión de
Sox2
,
Nanog
Oct-4
, y [63] - [66], similar a los resultados aquí en CD24
+ células. Estos resultados indican que CD24
+ NPC células madre cancerosas puede promover la tumorigénesis y también inician la invasión y la metástasis, y sugieren que más experimentos para confirmar la presencia de CD24
+ células madre cancerosas en las biopsias de la APN humanos están garantizados. Además, si la expresión de genes celular y la invasión madre está bajo el control de una vía de señalización común, como la vía /β-catenina Wnt, que queda por investigar.
En resumen, nuestros resultados muestran que CD24
+ células exhiben características de CSC en líneas celulares de la APN. Las estrategias dirigidas a la erradicación de la CD24
+ células NPC pueden proporcionar nuevas y más efectivas estrategias de tratamiento contra la APN.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
líneas celulares NPC (la línea queratinizante escamoso TW02 celular; la línea celular TW04 indiferenciada; células escamosas diferenciadas hK1; células escamosas CG1 pobremente diferenciado, y el queratinizante TW039 escamosas y líneas celulares TW076) fueron proporcionados por el Dr. Sun Yu-Chang (Chang Gung Universidad) y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 25 mg /B anfotericina ml (Invitrogen). Después de la clasificación como se describe a continuación, las células se cultivaron en DMEM suplementado con 20 bFGF ng /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 20 ng /ml EGF (Sigma-Aldrich), 200 unidades /ml de penicilina, 200 mg /ml de estreptomicina y 50 mg /ml de anfotericina B (Invitrogen). Todas las células se mantuvieron en un humidificado 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C.
La citometría de flujo análisis y clasificación de células NPC
Las células fueron analizadas por fluorescencia de células activadas por la clasificación (FACS) después de alcanzar la fase de proliferación logarítmica. Las células se digirieron con 0,25% de tripsina-EDTA al 0,02% (Invitrogen), se lavó dos veces con calcio /PBS libre de magnesio, y se resuspendieron a una concentración de 1 × 10
6 células /ml en PBS enfriado en hielo suplementado con 2% FBS. Conjugado con FITC CD15 anti-humano, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD59, CD90, CD117 o anticuerpo CD133 (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mountain View, CA) se añadió a una final concentración de 1 g /ml, y se incubaron durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad con mezcla.