Extracto
Antecedentes
aberración genómica es una característica común de los cánceres humanos y también es uno de los básicos mecanismos que conducen a la sobreexpresión de oncogenes y subexpresión de genes supresores de tumores. Nuestro estudio tiene como objetivo identificar los cambios genómicos frecuentes en el cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Se utilizó gama de hibridación genómica comparada (CGH array) para identificar alteraciones genómicas recurrentes y se valida la expresión de proteínas de los genes seleccionados mediante técnicas de inmunohistoquímica.
resultados
Dieciséis ganancias y treinta y dos pérdidas se produjeron en más de un 30% y el 60% de los tumores, respectivamente. amplificaciones de alto nivel en 7q21.3-q22.1 y 19q13.2 y deleciones homocigóticas en 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13. 2, se identificaron 17q21.31 y 22q13.1. Especialmente, se detectó amplificación de AKT2 en dos carcinomas y homocigotos supresión de CDKN2C en otros dos casos. En 15 muestras de validación independientes, se encontró que AKT2 (19q13.2) y MCM7 (7q22.1) se amplificaron en 6 y 9 de los casos, y CAMTA2 (17p13.2) y PFN1 (17p13.2) se homocigótica eliminar en 3 y 1 casos. AKT2 y MCM7 se sobreexpresa, y CAMTA2 y PFN1 se underexpressed en tejidos de cáncer de páncreas que en los tejidos de márgenes operativos morfológicamente normales. Tanto logís- y 22q13.1 identificados software Genómica Workbench contienen APOBEC3A y APOBEC3B como la única región de deleción homocigótica. Y los niveles de expresión de APOBEC3A y APOBEC3B fueron significativamente menores en los tejidos tumorales que en los tejidos de margen operativas morfológicamente normales. Una validación adicional mostró que la sobreexpresión de PSCA se asoció significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos, y la sobreexpresión de HMGA2 se asoció significativamente con la profundidad invasiva de cáncer de páncreas.
Conclusión
Estos cambios genómicos recurrentes puede ser útil para revelar el mecanismo de la carcinogénesis pancreática y proporcionar biomarcadores candidatos
Visto:. Liang JW, Shi ZZ, Shen TY, Che X, Wang Z, Shi SS, et al. (2014) Identificación de Genomic Las alteraciones en el cáncer pancreático Uso basado en series de hibridación genómica comparada. PLoS ONE 9 (12): e114616. doi: 10.1371 /journal.pone.0114616
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 16 Julio, 2014; Aceptado: 12 Noviembre 2014; Publicado: Diciembre 11, 2014
Derechos de Autor © 2014 Liang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81241086) Nacional de Ciencia y Tecnología Proyecto Principal de China (2012ZX09506001, 2011YQ17006710), y, y el Provincial de Yunnan Fundación de Investigación para la Investigación básica, china (Grant No. 2013FD012). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Antecedentes
el cáncer de páncreas es uno de los cánceres más malignent del mundo, con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 5% [1]. Hasta ahora, no hay un tratamiento convencional con un impacto significativo en el curso del cáncer de páncreas, de manera que el pronóstico de los pacientes sigue siendo pobre. Por lo tanto, la identificación de los cambios moleculares que subyacen a este tipo de cáncer sentará las bases para la mejora de la gestión clínica y los resultados.
La inestabilidad genómica es un rasgo característico de los tumores casi humanos [2]. número de copias cambios se encuentran con frecuencia en los cánceres, y se cree que contribuyen a la iniciación y progresión de los tumores mediante la amplificación y la activación de oncogenes o la supresión inducida por la expresión de genes supresores de tumores. Varios estudios anteriores han identificado algunas alteraciones cromosómicas recurrentes en el cáncer pacreatic, tales como ganancias en el 1T, los cromosomas 2, 3 y 5, 7p, 8q, 11q, 12p, 14q, 17q, 19q y 20q, las pérdidas en los cromosomas 1p, 3p, 6 , 8p, 9p, 10q, 13q, 14q, 15q, 17p y 18q, y amplificaciones de FGFR1, HER2 y DcR3 [3], [4], [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Sin embargo, la información disponible es aún limitada, especialmente para el cáncer de páncreas chino.
En el presente estudio se identificaron las ganancias comunes, pérdidas, amplificaciones y deleciones homocigóticas en el cáncer de páncreas. Además, evaluó el nivel de expresión de la proteína de la HMGA2 copia genes aumento de número y PSCA.
Materiales y Métodos
Diseño del estudio
En primer lugar, las aberraciones genéticas en los carcinomas de páncreas eran detectado mediante el uso de Agilent 44K Genoma humano CGH microarrays y cambios genómicos comunes fueron identificados. A continuación, se validó la expresión de la proteína de PSCA HMGA2 y que se encuentra en las regiones de aberraciones cromosómicas comunes en el cáncer pancreactic.
Pacientes y muestras
tejidos recién extirpados de pacientes con carcinoma de páncreas se recogieron 93 por el Departamento de Patología, hospital del cáncer, Academia china de Ciencias médicas, Beijing, china, de 2006 a 2008. Todos los pacientes con cáncer pancreático fueron tratados con operación radical, y ninguno de ellos ha recibido ningún tipo de tratamiento antes de la cirugía. regiones representativas del tumor fueron extirpados por patólogos experimentados y se almacenan inmediatamente a -70 ° C hasta su uso. Todas las muestras utilizadas en este estudio fueron muestras residuales después del muestreo diagnóstico. Cada paciente firmó formularios de consentimiento informado separados para el muestreo y análisis molecular. Características clínicas de los pacientes utilizados en el array CGH estudio se muestran en la Tabla 1. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Cáncer y el Hospital, Peking Union Medical College, Academia China de Ciencias Médicas (núm NCC2013B-30).
Extracción de ADN genómico
ADN genómico se aisló de los tejidos tumorales utilizando el Qiagen DNeasy Blood & amp; Kit de tejido como se describe por el fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania). el contenido de las células tumorales de todas las muestras fue mayor del 50% por tinción con HE.
Array basado en CGH
array CGH experimentos se llevaron a cabo utilizando protocolos estándar Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) . Se utilizó ADN genómico humano comercial (Promega, Warrington, Reino Unido) como referencia. Para cada hibridación CGH, 500 ng de ADN genómico de referencia y la misma cantidad de ADN tumoral se digirieron con Alu I y la enzima de restricción Rsa I (Promega, Warrington, UK). Los fragmentos de ADN digeridos de referencia se marcaron con cianina-3 dUTP y el ADN tumoral con cianina-5 dUTP (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Después de la limpieza, las sondas de referencia y de ADN del tumor se mezclaron y se hibridó en Agilent 44K genoma humano CGH microarrays (Agilent) para 40 h. Los procedimientos de lavado, exploración y extracción de datos se realizaron siguiendo los protocolos estándar.
microarrays de análisis de datos
Se analizaron los datos utilizando microarrays de Agilent Genómica Workbench (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y BRB-ArrayTools ( http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html). Agilent Genómica Workbench se utilizó para calcular log
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ratio para cada sonda y para identificar aberraciones genómicas. El promedio diario de
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relación de todas las sondas en una región cromosómica entre 0,25 y 0,75 se clasificó como ganancia genómica, & gt; 0,75 como la amplificación de ADN de alto nivel, & lt; -0.25 pérdida en cuanto hemizygous, y & lt; -0.75 como deleción homocigótica. En el análisis de enriquecimiento de vía, p-valor se calcula para cada vía en base a la distribución nula obtenida por un método de muestreo aleatorio de 1000 el tiempo.
-PCR en tiempo real
Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 20 l, incluyendo 10 l de 2XPower SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK), 2 l de ADNc /ADN genómico (5 ng /l), y 1 l de mezcla de cebadores (10 mM cada uno ). La amplificación por PCR y la detección se llevaron a cabo en el ABI 7300 (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) como sigue: una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min; 45 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60ºC durante 1 min. La expresión génica relativa o número de copias relativo del gen objetivo se calculó utilizando el método de CT comparativo normalizado a un GAPDH endógeno. La relación con el calibrador se obtiene mediante la fórmula 2
-ΔΔCt. Ct se calculó restando la media GAPDH CT de la CT promedio del gen de interés. La relación define el nivel de expresión relativa o número de copias relativo del gen diana a la de GAPDH. 2
-ΔΔCt & gt; 2,0 se fijó para una amplificación de la diana, y 2
-ΔΔCt. & Lt; 0,25 se fijó para una deleción homocigótica objetivo
tinción inmunohistoquímica
fijado en formalina, tumores pancreáticos incluidos en parafina se colocaron en los microarrays de tejidos. Para cada caso se repitieron los tejidos de cáncer por tres veces y tejidos morfológicamente normales adyacentes por dos veces. Los portaobjetos se desparafinaron, se rehidrataron, inmerso en una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min, se calentó en tampón de citrato (pH 6) durante 25 min a 95 ° C, y se enfriaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se bloquearon por el suero de cabra normal al 10% durante 30 min a 37 ° C y después se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón contra HMGA2 (Abcam, Cambridge, MA) y el anticuerpo policlonal de conejo contra PSCA (Abcam, Cambridge, MA) durante la noche a 4 ° DO. Después de ser lavado con PBS, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado (diluido 1:100) durante 30 min a 37 ° C, seguido de estreptavidina-peroxidasa (1:100 dilución) la incubación durante 30 min a 37 ° C. Immunolabeling se visualizó con una mezcla de solución de 3,3'-diaminobencidina. Contratinción se realizó con hematoxilina. Se determinó
El nivel de expresión sobre la base de intensidad de la tinción y el porcentaje de células inmunorreactivas. expresión negativa (puntuación = 0) no fue o tinción débil o moderada a fuerte tinción en & lt; 25% de las células. expresión débil (puntuación = 1) era una tinción moderada o fuerte en 25% a 50% de las células. Y una fuerte expresión (puntuación = 2) era & gt;. El 50% de las células con tinción fuerte
Análisis estadístico
t de Student y la prueba de Chi cuadrado se realizaron con el paquete estadístico SPSS 15.0 . Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando el
P
dos caras valor correspondiente eran. & Lt; 0,05
Resultados
Las ganancias y pérdidas en el carcinoma de páncreas detectado por CGH array
Quince muestras de carcinoma de páncreas fueron analizados en este estudio y todos ellos tenían cambios genómicos (rango: 1 a 387). No se detectaron con frecuencia dieciséis ganancias y pérdidas de treinta y dos (frecuencia de ganancia de & gt; 30%, y la pérdida de & gt; 60%). Las ganancias más frecuentes fueron 8p23.3 (41,7%), 1q44 (40%), 14q32.33 (40%), 19q13.43 (36,7%), 1q21.3 (36%) y 5q31.1-q31.2 (35,6%), y la mayoría de las pérdidas comunes fueron 11p15.4 (70,7%), 15q15.1-q21.1 (70%), 3p21.31 (68,9%), 17p13.3-p13.2 (66,7%), 19p13.3-p13.2 (66,7%), 5p13.3 (63,3%), 11p11.2 (63,3%) y 19p13.3-p13.11 (63,3%). logís- análisis mostró que el número de copias disminución de APOBEC3A (22q13.1) y APOBEC3B (22q13.1) fue significativa (Fig. 1 y Tabla 2).
A. gráfico de frecuencias en todo el genoma de cáncer de páncreas en un array CGH análisis. Línea a la derecha del eje y 0%, la ganancia; la línea a la izquierda del eje x 0%, la pérdida. B. Números de aberraciones en el cáncer de páncreas. X, número de aberraciones; Y, el número de casos. C. Las ganancias y pérdidas (HDS) identificados por logís-.
Las amplificaciones y deleciones en homocigosis en el carcinoma de páncreas detectado por CGH array
Se detectaron amplificaciones de alto nivel en dos cromosomas regiones, incluyendo 7q21.3-q22.1 y 19q13.2. deleciones homocigóticas se identificaron en 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13.2, 17q21.31 y 22q13.1 (Tabla 3). Especialmente, AKT2 gen del cáncer (19q13.2) se amplificó en dos carcinomas, y CDKN2C (1p33) se suprimió homocigótica en otros dos casos. (Figura 2). Mediante la búsqueda en la base de datos COSMIC, se encontró que la amplificación de AKT2 se asoció con el aumento de la sentitivity al fármaco Z-LLNIe-CHO. Más interesante aún, deleción homocigótica de 22q13.1 que contiene APOBEC3A y APOBEC3B fue identificado en tanto logís- y análisis genómico de Agilent Workbench (Fig. 3).
A. amplificación de AKT2. B. homocigotos supresión de CDKN2C. Las flechas indican la posición de AKT2 y CDKN2C.
Ciclos representan las sondas de APOBEC3A y APOBEC3B.
selecciona adicionalmente los genes amplificados AKT2 (19q13.2 ) y MCM7 (7q22.1) y los genes suprimido CAMTA2 homocigotos (17p13.2) y PFN1 (17p13.2) para su validación por PCR en tiempo real. En 15 muestras de validación independientes, se detectaron amplificaciones de AKT2 y MCM7 en 6 y 9 de los casos, y deleciones homocigóticas de CAMTA2 y PFN1d en 3 y 1 de los casos, respectivamente (Fig. 4A y 4B). AKT2 y MCM7 se sobreexpresa, y CAMTA2 y PFN1 se underexpressed en tejidos de cáncer de páncreas que en los tejidos normales morfológicamente operativos de margen (Fig. 5A y 5B).
A. amplificación de AKT2 y MCM7. B. homocigotos supresión de CAMTA2 y PFN1. C. homocigotos supresión de APOBEC3A y APOBEC3B. Ratio = (número de copias del gen candidato en los tejidos tumorales) /(número de copias del gen candidato en el ADN genómico humano comercial).
A. La sobreexpresión de AKT2 y MCM7. B. disminución en la expresión de CAMTA2 y PFN1. C. disminución en la expresión de APOBEC3A y APOBEC3B.
En las muestras de validación independientes, APOBEC3A y APOBEC3B fueron homocigotos suprime en 3 y 4 tumores, respectivamente (Fig. 4C). Los niveles de expresión de ARNm de APOBEC3A y APOBEC3B en los tejidos tumorales fueron significativamente más bajos que en los tejidos de márgenes operativos morfológicamente normales (Fig. 5C)
Rutas enriquecido para Copy Number Alteraciones
Pathway análisis de enriquecimiento usando bases de datos KEGG se aplicó a los datos de CGH. Hemos encontrado que las dos vías enriquecidos en los genes con el aumento y que los seis vías enriquecidas en genes con pérdida. Las ganancias genómicas en el carcinoma de páncreas cambiaron las vías de degradación gamma-hexaclorociclohexano y la fosforilación oxidativa. Sin embargo, cyanoamino metabolismo de los ácidos, el metabolismo del glutatión, la degradación de la atrazina, la taurina y el metabolismo hipotaurina, el metabolismo del ácido araquidónico y vías de la enfermedad de Parkinson se cambiaron por las pérdidas genómicas (Tabla 4).
Validación de HMGA2 y PSCA en El cáncer de páncreas mediante inmunohistoquímica
Copia aumento de número de HMGA2 y PSCA se detectó en uno y cuatro tumores, respectivamente. Debido a su importante papel en la tumorigénesis [10], [11], [12], [13], se analizó la expresión de la proteína de PSCA y HMGA2 mediante inmunohistoquímica (IHC). Los resultados mostraron que se detectó la sobreexpresión de HMGA2 y PSCA en 76,7% y 65,0% de los pacientes con cáncer de páncreas, respectivamente (Fig. 6). Además, la sobreexpresión de PSCA se asoció significativamente con la metástasis de los ganglios linfáticos (Tabla 5), y la sobreexpresión de HMGA2 se asoció significativamente con la profundidad invasiva de cáncer de páncreas (Tabla 6).
A. expresión fuerte y negativo de HMGA2. B. Expresión fuerte y negativo de la LCSP.
Discusión
aberraciones genómicas pueden contribuir a la progresión de la carcinogénesis y el tumor. Con el fin de identificar el número de copias de ADN cambios en el cáncer de páncreas, se realizó la hibridación genómica comparativa basada en matrices y se encontró que dieciséis ganancias con frecuencia por encima de 30% y treinta y dos pérdidas superiores al 60%, con dos amplificaciones de alto nivel en 7q21.3- q22.1 y 19q13.2 y diez deleciones homocigóticas en 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13.2, 17q21.31 y 22q13. 1. Al comparar nuestros resultados con los datos presentados en CGH sitio web progenetix [14], [15], encontramos que la mayoría de las aberraciones genómicas fueron consistentes. Pero todavía había algunas diferencias. Por ejemplo, la pérdida de 9p fue más frecuente de la pérdida de 9Q en datos progenetix, pero la frecuencia de la pérdida de 9Q fue mayor que la pérdida de 9p en nuestro estudio. La ganancia del cromosoma 7 era muy común en los datos progenetix, pero la pérdida de este cromosoma fue más frecuente en nuestros datos
.
De manera significativa, AKT2 gen del cáncer se amplificó en dos pacientes con cáncer de páncreas, cáncer y CDKN2C gen fue suprimido homocigótica en otros dos casos. Hemos validado la amplificación de AKT2 y MCM7 (7q22.1) y homocigotos supresión de CAMTA2 (17p13.2) y PFN1 (17p13.2) en el cáncer de páncreas, y, además, que AKT2 y MCM7 se sobreexpresa, y CAMTA2 y PFN1 estábamos underexpressed en el cáncer de páncreas en comparación con los de los tejidos de margen operativas morfológicamente normales. Estos resultados sugieren que genes incluyendo AKT2, MCM7, CAMTA2 y PFN1 podría desempeñar un papel importante en el cáncer de páncreas. homocigotos supresión de CDKN2C se ha encontrado en el mieloma, y disminución del número de copias de CDKN2C se asoció significativamente con una peor supervivencia global [16], [17], [18]. Sin embargo, todavía había poca información sobre el papel de CDKN2C en el cáncer de páncreas. En cuanto a la alteración de AKT2 en tumores malignos humanos, Miwa et al. han informado de la amplificación de AKT2 fue en 3 de 12 líneas celulares de cáncer de páncreas y en 3 de 20 carcinomas primarios de páncreas. La sobreexpresión de AKT2 también se detectó en las líneas celulares con 3 AKT2 amplificado [19]. La regulación de AKT2 se correlacionó con el pronóstico [20]. Tanno et al. encontró que AKT activo promueve la invasividad de células de cáncer pancreático a través hasta la regulación de la expresión de IGF-IR [21]. IARN simultáneamente AKT2 y K-ras podría inhiben esta el crecimiento del tumor de páncreas [22]. Chen et al. demostró que la inhibición AKT2 podría derogar la activación inducida por gemcitabina de AKT2 y NF-kappa B, y la promoción de gemcitabina inducida upregulation PUMA, resultando en quimiosensibilización de tumores pancreáticos a gencitabine [23]. Nuestros resultados verificaron adicionalmente la amplificación de AKT2 en el cáncer de páncreas. Mediante la búsqueda en la base de datos COSMIC, también encontramos que la amplificación de AKT2 se asoció con el aumento sentitivity al fármaco Z-LLNIe-CHO. Todos estos resultados sugieren que la amplificación de AKT2 tal vez convertirse en un biomarcador para dividir a los pacientes con cáncer pancreático en diferentes subgrupos de aplicación diferente estrategia de terapia. Y en el futuro, si el fármaco Z-LLNIe-CHO podría usarse para tratar a los pacientes con cáncer de páncreas con amplificación AKT2 debe ser estudiado.
Curiosamente, tanto logís- y Genómica Workbench software identificado 22q13.1 (que contiene APOBEC3A y APOBEC3B) como homocigotos supresión región. En tiempo real el ensayo de PCR mostró que APOBEC3A y APOBEC3B se underexpressed en tejidos de cáncer de páncreas que en los tejidos de márgenes operativos morfológicamente normales. enzimas APOBEC funcionan en la respuesta inmune innata, incluyendo aquellos que se dirigen a los retrovirus, lo que sugiere vínculos entre la inmunidad, la mutagénesis y la infección viral en el proceso de desarrollo del cáncer. APOBEC3A podría inducir hipermutación de ADN genómico y ADN de doble filamento se rompe, y catalizar la transición de una saludable para un genoma del cáncer [24], [25]. Pham et al. informó de que APOBEC3A se expresó en los queratinocitos, y regulado en cáncer de piel [26]. APOBEC3B se sobreexpresa en la mayoría de líneas celulares de cáncer de ovario y cáncer de ovario primarios de alto grado. expresión improtantly APOBEC3B se correlacionó con la carga mutaion total, así como los niveles elevados de mutaciones de transversión [27]. Harris et al. informó que APOBEC3B representaba hasta la mitad de la carga mutacional en los carcinomas de mama que expresan esta enzima [28]. En otros tipos de cáncer, incluyendo la vejiga, cuello uterino, pulmón y cabeza y cuello, APOBEC3B también se upregulated y su secuencia diana preferida se mutó con frecuencia y agrupado [29]. Supresión de APOBEC3B atenuada aclaramiento del VHB, y dio lugar a la infección por el VHB y un mayor riesgo de desarrollar carcinoma hepatocelular [30]. Supresión de APOBEC3 también se asoció con el riesgo de cáncer de mama entre las mujeres de ascendencia europea [31]. homocigotos supresión de APOBEC3B se asoció significativamente con resultados desfavorables para el VIH-1 adquisición y progresión a SIDA [32]. Será interesante investigar el papel de la deleción homocigota del APOBEC3A y APOBEC3B en la carcinogénesis pancreática.
HMGA2 y PSCA se ha informado que se asocia con el cáncer de páncreas. Piscuoglio et al. mostró que el porcentaje de células tumorales con HMGA2 y HMGA1 inmunoreactividad nuclear positivamente correlacionado con el aumento de grado de malignidad y metástasis de los ganglios linfáticos [33], [34]. Y HMGA2 mantiene transición epitelio-mesénquima inducida por ras oncogénico en células de cáncer de páncreas humano [35]. Nuestro estudio reveló que se detectaron aumentos de HMGA2 y PSCA en uno y cuatro carcinomas pancreáticos, respectivamente. En ensayo de IHC, se detectó la sobreexpresión de HMGA2 en 76,7% y la de PSCA en 65.0% de los tumores. Y la sobreexpresión de PSCA se asoció significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos, y la sobreexpresión de HMGA2 se asoció significativamente con la profundidad invasiva de cáncer de páncreas.
En general, nuestro estudio identificó alterado de números regiones cromosómicas de copias múltiples en el cáncer de páncreas. Estos resultados proporcionan importantes conocimientos sobre las alteraciones moleculares asociadas con la tumorigénesis pancreática. Nuevos estudios deben llevarse a cabo para explorar las posibles funciones oncogénicas de estos genes número de copias modificadas.