Extracto
El principal problema que surge de cáncer de próstata (CaP) es su propensión hacer metástasis al hueso. Los microARN (miRNA) juegan un papel crucial en muchas metástasis tumorales. La importancia de miRNAs en la metástasis ósea del CP no se ha aclarado hasta la fecha. Hemos investigado si la expresión de determinados miRNAs se asoció con metástasis ósea del CaP. Se examinaron los perfiles de expresión de genes miARN de CaP metastásico muestras 6 y 7 óseos primarios de análisis de microarrays miARN. La expresión de miRNAs 5 disminuyó significativamente en la metástasis ósea en comparación con CaP primario, incluyendo MIR-508-5p, -145, -143, -100 y -33a. Además, examinó otras muestras de CaP 16 primaria y 13 metástasis óseas mediante el análisis de PCR en tiempo real. Las expresiones de MIR-143 y -145 fueron verificadas regular a la baja de manera significativa en las muestras de metástasis. Por la investigación de la relación de los niveles de MIR-143 y -145 con las características clínico-patológicas de los pacientes con CaP, encontramos de bajada regulaciones de MIR-143 y -145 se correlacionaron negativamente con metástasis ósea, la puntuación de Gleason y el nivel de PSA libre en el CaP primaria . La sobreexpresión de miR-143 y -145 por transfección retrovirus reducen la capacidad de la migración y la invasión
in vitro
, y el desarrollo del tumor y la invasión ósea
in vivo Red de células PC-3, un ser humano línea celular de CaP se originó a partir de una muestra de CaP metastásico hueso. Su regulación al alza también aumentó la expresión de E-cadherina y fibronectina expresión reducida de las células PC-3, que reveló un fenotipo morfológico menos invasiva. Estos hallazgos indican que MIR-143 y -145 se asocian con metástasis ósea del CaP y sugieren que pueden desempeñar un papel importante en la metástasis ósea y estar implicado en la regulación de la EMT Ambos también se pueden usar clínicamente como nuevos biomarcadores para discriminar diferentes etapas de la PCa humana y la predicción de metástasis ósea
Visto: Peng. X, Guo W, T Liu, Wang X, X Tu, Xiong D, et al. (2011) Identificación de MIR-143 y -145 que se asocia con metástasis en los huesos de cáncer de próstata y implicada en la regulación de la EMT. PLoS ONE 6 (5): e20341. doi: 10.1371 /journal.pone.0020341
Editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Francia |
Recibido: 27 de enero de 2011; Aceptado: April 21, 2011; Publicado: 27 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. NSFC- financiación conjunta de Guangdong, china (Nº u0732001); la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (Nº 06.021.290); Ciencia y Tecnología proyecto de planificación de la provincia de Guangdong, China (Nº 2008B030301037) y Ciencia y Tecnología de Proyectos Planificación de Zhuhai, China (2009). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. El autor Tiejian Liu es empleado de una empresa comercial, Laura Biotech Co., Ltd ., y se unió a grupo de investigación de los autores por razones privadas. Debido a su trabajo en el grupo de investigación, que va a ganar experiencia importante que pueda ser útil para su aplicación para su doctorado. Este documento no tiene relevancia comercial en términos de Laura Biotech, y los datos y resultados que se detallan en este documento no guardan relación con esa empresa. Los autores confirman que esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer de próstata (CaP) es el más frecuentemente diagnosticado un tumor maligno y el segundo causa principal de muerte por cáncer en los países occidentales [1]. El principal problema que surge de CaP es su propensión a producir metástasis en los huesos. metástasis óseas se producen en hasta el 90% de los pacientes con CP avanzado. Es importante destacar que, una vez que los tumores metastatizan a hueso, que son prácticamente incurable y el resultado de la morbilidad significativa antes de la muerte de un paciente [2], [3]. Es muy importante entender el mecanismo de la formación de metástasis para la prevención de la metástasis y el desarrollo de terapias anti-metastásicos que pueden proporcionar una reducción adicional en la morbilidad y la mortalidad de los pacientes con CaP.
Esquelético metástasis del tumor es un multi-etapa complicada proceso que incluye el desacoplamiento celular y la motilidad del microambiente local, la degradación de la matriz extracelular circundante, movimiento celular, detenido en capilares distales, extravasate y finalmente proliferan para formar tumores óseos secundarios distantes. Todos estos procesos están regulados por múltiples factores y vías moleculares [4]. Aunque el conocimiento básico relacionado con este proceso estructurado ha aumentado recientemente, muchos de los elementos clave son aún poco conocidos.
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños ARN no codificantes de regulación (19-25 nucleótidos) expresadas por las plantas y animales implicados en la regulación de la expresión génica. Ellos ejercen su función mediante la unión a la región 3 'no traducida de un subconjunto de mRNAs que resulta en su degradación o la represión de la traducción [5]. Los análisis bioinformáticos han predicho que solo miARN tiene varios objetivos, y por lo tanto miRNAs podrían mediar en la regulación de un gran número de genes codificadores de proteínas. Estimaciones recientes sugieren que un tercio de los ARNm humanos puede ser regulada por miRNAs [6], [7]. miRNAs han demostrado interferir funciones celulares tales como la proliferación celular, la diferenciación celular y la apoptosis [8].
Muchos informes han dilucidado el papel de ciertos miRNAs como promotores o supresores de tumores [9], [10] , [11]. Un número creciente de observaciones también da a colectivos evidencias que los miRNAs coordinan algunos de los programas de expresión génica intrincados y juegan un papel crucial en la metástasis del tumor [12]. miRNAs puede influir en múltiples etapas de cascada metastásica, como la migración de las células tumorales, invasión y intravasación. Por ejemplo, el cáncer de mama es uno de los contribuyentes más importantes de las metástasis óseas [13]. Una serie de microRNAs han sido identificados como promotores de metástasis, incluyendo let-7, miR-9, miR-10b, miR-21, miR-373, miR-520c, y miR-103/107 [de 12], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Por el contrario, el miR-335, miR-206, miR-31, miR-145, miR-661 y miR-126 han sido identificados como miRNAs supresores de metástasis en el cáncer de mama humano [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27].
En el CP, varios miRNAs han sido identificados como mediadores de la metástasis. Se demostró que la desregulación de miR-221 y miR-222 se asoció con la progresión del CaP, mal pronóstico, y el desarrollo de metástasis [28]. miR-21 también fue sobre-expresa en CaP y actúa como un regulador clave oncogénico que contribuye al crecimiento del tumor, invasión y metástasis [29], [30], [31]. Un estudio ha revelado que miR-146a se dirige a Rock1, y niveles elevados Rock1 promover la proliferación celular, la invasión y la metástasis en las células de CaP [32]. Además, la pérdida genómica de miR-101 en el CaP humano, que participan en la progresión del cáncer, conduce a la sobreexpresión de EZH2 [33], [34]. Sin embargo, la importancia de miRNAs en la metástasis ósea del CP no se ha aclarado hasta la fecha.
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es una cierta vía de señalización de la descripción de un paso clave en la progresión de la metástasis de las células tumorales que incluye procesos consecutivos de célula-desprendimiento, migración, invasión, dispersantes y última residen [35]. Se ha identificado como un sello distintivo de la metástasis en tumores múltiples, la conexión a un montón de factores de transcripción [36], [37], [38], [39]. miRNAs son también componentes de los circuitos de señalización celular que regula el programa EMT [40]. Trabajos recientes han demostrado varios miRNAs, incluyendo la familia de miR-200 y miR-205, jugado un papel crítico en la EMT [41], [42]. Hasta ahora, el papel preciso de miRNAs en la regulación de la EMT todavía no está claro.
Para investigar el papel de miRNAs en la metástasis ósea del CaP y su relación con la EMT, en primer lugar es necesario conocer la expresión de los genes miARN perfiles de primaria y ósea metastásica CaP. En el presente estudio, se compararon los perfiles de expresión de genes miARN en CaP metastásico primaria y hueso de los seres humanos y MIR-143 y -145 en relación con metástasis ósea identificadas. Por otra parte, hemos demostrado que los upregulations de MIR-143 y -145 reprimidos migración y la invasión
in vitro
, el desarrollo de tumores y la invasión ósea en
in vivo
, y EMT de las células PC-3, una línea celular humana CaP originó a partir de un hueso metastásico muestra de CaP.
Materiales y Métodos
Las muestras de tejido
muestras de tejidos de dos grupos de pacientes con CaP fueron estudiados. tejidos CaP primarios fueron de la prostatectomía o la resección transuretral en el tratamiento de carcinoma de próstata local. tejidos metastásicos del esqueleto de CaP eran de la operación en el tratamiento de metástasis ósea. Todas las muestras fueron fijados con formalina y embebido en parafina (FFPE) con procedimientos estándar. Regiones de muestras de tejido & gt; tejido canceroso 70% se utilizaron para la extracción de RNA total. El diagnóstico histológico fue realizado por un patólogo y ha sido re-confirmado por un segundo patólogo (D. H.). metástasis ósea fue diagnosticada de acuerdo con los síntomas clínicos y signos, gammagrafía ósea, radiografía, tomografía computarizada y la resonancia magnética. Ninguno de los pacientes había recibido hormonoterapia neoadyuvante, la radiación o quimioterapia antes de obtener los tejidos tumorales. La información clínica fue revisado acerca de la edad, metástasis ósea, el nivel de PSA total, nivel de PSA libre y la puntuación de Gleason en pacientes con CaP primarias. El estudio fue aprobado por el Consejo de Ética Institucional (IRB) en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen y consentido por los pacientes involucrados.
extracción de RNA
Todas las muestras fueron enviadas a CapitalBio Corp . y se aisló el ARN total de muestras de tejidos FFPE como se describe anteriormente [43]. En resumen, las muestras de tejido se cortaron en rodajas de los bloques de parafina y se colocan en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga libre de nucleasa (Eppendorf), a continuación, eliminó la parafina tres veces en 1 ml limoneno, seguido de lavado con 1 ml de etanol al 100% dos veces y secado al aire a la habitación temperatura. Las muestras se incubaron a continuación con tampón de digestión (20 mM Tris-HCl, EDTA 10 mM, 1% SDS) y proteinasa K (Merck) a 55 ° C durante la noche para obtener una digestión completa de las muestras. Posteriormente, se añadió el reactivo TRIzol (Invitrogen), y el resto del protocolo se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. muestras de RNA se resuspendieron en agua libre de RNasa después de la etapa de precipitación final. calidad y cantidad de ARN se evaluó mediante un BioPhotometer (Eppendorf).
Análisis de microarrays
Las muestras de ARN total fueron analizados por CapitalBio (CapitalBio Corp.) para los experimentos de microarrays miARN. Cada chip microarrays miARN contenía 924 sondas por triplicado, lo que corresponde a 677 humana (incluyendo 122 predijo miRNAs), 461 de ratón, rata y 292 miRNAs que se encuentra en el Registro miARN (http://microrna.sanger.ac.uk; miRBase la versión 10.0, 2007). Se llevaron a cabo procedimientos que se describen en detalle en el sitio web de CapitalBio (http://www.capitalbio.com). Brevemente, se aisló el ARN de bajo peso molecular (LMW-RNA) usando PEG método de precipitación con solución de acuerdo con un protocolo anterior [44]. LMW-ARN se desfosforiló por la fosfatasa alcalina (NEB) en la primera siguiendo el protocolo dado por Wang H, et al. [45]. Entonces el desfosforilado LMW-ARN se marcó con 500 ng de 5'-fosfato-cytidyl-uridil-cy3-3 '(Dharmacon) con 2 unidades de RNA ligasa de T4 (NEB) [44]. ARN marcado se precipitó con acetato de sodio 0,3 M, 2,5 volúmenes de etanol y se resuspendió en 20 l de tampón de hibridación que contiene 3 x SSC, 0,2% SDS y 15% de formamida. La matriz se hibridó a 42 ° C durante la noche y se lavó con dos soluciones de lavado consecutivos (0,2% de SDS, 2 x SSC a 42 ° C durante 4 min, y 0,2% SSC durante 4 min a temperatura ambiente). Las matrices fueron escaneados con un escáner láser de doble canal (LuxScan 10K /A, CapitalBio). La configuración de escaneado se ajustó para obtener una intensidad igual visualizada de manchas U6 a través de las matrices. Los datos se obtuvieron a partir de las imágenes TIFF utilizando el software 3.0 (CapitalBio Corp) LuxScanTM. Los datos en bruto se normalizaron y se analizaron usando el software de análisis de Importancia Microarrays (SAM, versión 2.1, de la Universidad de Stanford, CA, EE.UU.). La agrupación de análisis se realizó mediante el Cluster 3,0 [46]. Todos los datos son MIAME compatible y que los datos en bruto ha sido depositado en una base de datos compatible con MIAME (GEO, la adhesión ID: GSE26964).
Quantitative PCR con transcripción inversa
El ADNc obtenido usando TaqMan miARN Kit de detección de Q-PCR (GeneCopoeia). En pocas palabras, los genes miARN se transcribe de forma inversa usando cebadores de secuencia específica de tallo-bucle (Invitrogen) para los siguientes miRNAs: hsa-miR-125 ter, hsa-miR-145, hsa-miR-153, hsa-miR-210, hsa-miR-143 , hsa-miR-100, miR-HSA-363, hsa-miR-451, hsa-miR-572 y miR-HSA-508-5p, basado en el análisis de microarrays y su objetivo genes predichos. La reacción se lleva a cabo con los siguientes valores de los parámetros: 15 min a 37 ° C, 10 minutos a 65 ° C, 5 min a 85 ° C, y -20 ° C hasta su uso. El análisis de PCR en tiempo real se realizó en un sistema de detección de PCR iQ5 Tiempo real (Bio-Rad) con reacción con una capacidad de 20 l que contiene 2 l producto de transcripción inversa, 10 l 2 × All-in-One ™ Q-PCR Mix, 2 l de PCR cebador (2 M), 2 l adaptador universal de PCR Primer (2 M), 4 l ddH2O. Las reacciones se incubaron en placas de 96 pocillos a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos, y luego en rampa de 66 ° C a 95 ° C para obtener la curva de fusión. Cada muestra se analizó por triplicado. No plantilla y ninguna transcripción inversa se incluyeron como controles negativos. U6 snRNA se utilizó como control de normalización. Los valores relativos de expresión de tres experimentos independientes se calculan siguiendo el 2
-ΔΔCt método de Schmittgen y Livak [47].
ácido nucleico cerrado (LNA) hibridación in situ
El procedimiento fue llevado a cabo como se describe anteriormente [48]. Brevemente, las secciones de tejido embebidas en parafina fueron desparafinados, deshidratado, a continuación se trató con proteinasa K (20 mg /ml; Roche) a 37 ° C durante 30 min. Después de lavado por 0,2% de glicina /PBS durante 1 min y se fija con paraformaldehído al 4%, las secciones se incubaron en tampón de hibridación (50% formamida, 5 x SSC, 0,1% de Tween, ácido cítrico 9,2 mM para el ajuste a pH 6,0, 50 g /ml de heparina, 500 mg /ml de ARN de levadura) a 37 ° C durante 2 h. se añadieron marcada con digoxigenina, las sondas de LNA modificada de miR-143 (20 nmol /L;; 5'-GAGCTACAGTGCTTCATCTCA-3 ', Exiqon) y miR-145 (5'-AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-3 20 nmol /L', Exiqon) respectivamente y se incubaron a 55 ° C durante 18 h. Las secciones se lavaron con 2 x SSC dos veces, luego con 2 x SSC y 50% de formamida a 50 ° C tres veces (30 min cada uno). Se añadió el anti-DIG-AP (1:1000, Roche) después de lavado PBS-T (0,1% de Tween 20) y se incubó a 4 ° C durante la noche. Las secciones se lavaron cuatro veces con PBS-T, y se utilizó fosfato de cloruro de nitro-tetrazolio /5-bromo-4-cloro-3-indonyl de mancha.
Cell Cultura y
líneas celulares de CaP metastásico incluidos PC-3 y LNCaP en el presente estudio. PC-3 se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC) y se mantiene en F-12 medio de cultivo (Hyclone) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone). LNCaP fue adquirido de Shanghai Banco de Células de la Academia China de Ciencias, y se mantuvo en RPMI-1640 medio de cultivo (Gibico, Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Hyclone). células transfectadas de forma estable se mantuvieron en medios con la presencia de puromicina (Sigma-Aldrich). Las células fueron cultivadas en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C.
Generación de líneas celulares transfectadas de forma estable
La secuencia de pri-miR-143 y pri-mir -145 se clonaron en el plásmido pMSCV-puromicina con enzima de restricción Bgl II y EcoR I (New England Biolabs). 293FT células fueron transfectadas con los plásmidos construidos anteriormente mencionadas combinadas con vector PIK o en blanco pMSCV-vector como control, utilizando el método de fosfato de calcio como se describe anteriormente [49]. Después de incubación a 37 ° C durante 6 h después de la transfección, los medios se cambiaron y las células se incubaron durante la noche. Para producir nuevo virus, se recogieron los medios de comunicación tres veces al día hasta 293FT células alcanzan hasta la confluencia total. Los virus se usaron para infectar células PC-3 y LNCaP. 24 h después de la adición de virus, las células infectadas se seleccionaron mediante la adición de puromicina a medio de crecimiento. Las líneas celulares estables fueron verificadas por QRT-PCR. Ambos plásmidos pMSCV y PIK fueron concedidos por el profesor Canción generosa LB, Sun Yat-Sen Centro de Cáncer de la Universidad, Guangzhou, China.
cicatrización de heridas ensayo
Un día antes de cero, líneas celulares estables de las células PC-3 y LNCaP se trataron con tripsina y se sembraron en partes iguales en placas de cultivo tisular de 6 pocillos, y crecieron para llegar a confluencia casi total en 24 h. Cuando la inanición de suero no mantuvo durante 24 h después de la formación monocapa de células, una herida homogénea artificial fue creado sobre la monocapa con una punta de 100 l estéril. Después de rascarse, las células se lavaron con medio libre de suero. Imágenes de células que migran hacia la herida fueron capturados en puntos de tiempo de 0 h, 6 h, 12 hy 24 h mediante microscopio invertido (40 ×).
in vitro
ensayo de invasión En
El ensayo de invasión se llevó a cabo mediante el uso de la cámara Transwell que consta de 8 micras cartuchos de filtro de membrana (Corning) recubiertas con Matrigel (BD Biosciences) como se describe anteriormente [50]. Brevemente, las células se trataron con tripsina y se suspendieron en medio libre de suero. A continuación, 1,5 × 10
se añadieron 5 células a la cámara superior, mientras que la cámara inferior se llenó de medio con 10% de SFB. Después se incubaron durante 48 h, las células se invadieron a través de la membrana recubierta a la superficie inferior, en el cual las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con hematoxilina. El recuento de células se realizó bajo el microscopio (100x).
Ensayo de adhesión
El ensayo de adhesión se realizó tal como se describe anteriormente [51]. Brevemente, placas de 96 pocillos se recubrieron con 50 l de fibronectina (50 mg /ml) en medio original en incubadora de células durante 1 h. Después de lavado con los medios calientes, las placas se bloquearon con 1% de BSA a 37 ° C durante 1 h y se lavaron dos veces. Después de tripsinización, las células en suspensión se sembraron en cada pocillo con medio libre de suero a una densidad de 1,5 x 10
4 células por pocillo. Cuando se incubaron las placas durante 30 min, se eliminaron las células no adherentes y las placas se lavaron suavemente dos veces con PBS. Las células adherentes se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente, luego se tiñeron con hematoxilina y contados bajo el microscopio invertido (100 ×).
Western Blot
Para el análisis de la expresión de la EMT- proteínas relacionadas, ensayo de inmunotransferencia se llevó a cabo. Todas las líneas celulares estables, incluyendo PC-3 /vector, PC-3 /miR-143, PC-3 /miR-145, LNCaP /vector, LNCaP /miR-143 y LNCaP /miR-145, fueron sembradas en 100 mm placas de cultivo de tejidos. Después de 24 h, las células se lavaron con PBS previamente enfriado cuando la confluencia llegó a 60 a 70%, seguido de ser cosechadas en tampón de muestra [62,5 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% de glicerol, y 5 % 2-β-mercaptoetanol]. Cantidades iguales de proteína a partir del sobrenadante se cargaron por carril y se resolvieron por electroforesis en SDS-poliacrilamida. En secuencia, la proteína se transfirió a una membrana de PVDF (Millipore), bloqueados por el 5% de leche sin grasa para 1 h a temperatura ambiente, y se sondeó con anticuerpos primarios (1:1000) para 3 h, incluyendo ratón anti-E-cadherina (BD Biosciences ), ratón anti-fibronectina (BD Biosciences) y el ratón anti-vimentina (BD Biosciences). Las membranas se lavaron tres veces (10 min cada una) en tampón TBS-T y se incubaron durante 40 min a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios de rábano picante anti-ratón conjugados con peroxidasa. Las transferencias se lavaron tres veces (10 min cada una) en TBS-T y desarrollados usando el sistema ECL. La carga de proteína se normalizó por reprobing las transferencias con anticuerpo de ratón anti-α-tubulina (Abcam).
En vivo y modelos de metástasis ósea del cáncer de próstata
La inyección intra-tibial se utilizó un modelo. diez ratones macho inmunodeficiencia combinada severa (SCID) de 3~4 semanas de edad fueron adquiridos de HFK Bio-Technology.CO., LTD (Pekín, China). Antes de la inoculación, PC-3 células se resuspendieron en 40 l sin Serun medio F-12 a la densidad de 2 × 10
5 células por 40 l, y se inyectaron con una aguja de calibre 26 en la tibia usando un movimiento de perforación . Los animales fueron divididos aleatoriamente en dos grupos por igual, donde cada 5 animales fueron tratados con PC-3 /miR-143 o PC-3 /miR-145 en la tibia derecha, respectivamente. Todos los 10 ratones fueron inyectados con PC-3 /vector en la tibia izquierda como el autocontrol. Los ratones se controlaron semanalmente para el crecimiento tumoral. En la semana 5, extremidades posteriores se radiographed usando una máquina de rayos X Faxitron (Faxitron de rayos X Corp, EE.UU.) para detectar las lesiones óseas. A continuación, se sacrificaron los ratones y se recogieron tibias, descalcificadas y se fijaron en formalina para su posterior análisis histológico. Las lesiones óseas se evaluaron y se calculan como se describe tal como se describe anteriormente [52], donde 0 grado para ninguna lesión, 1 para lesiones menores, 2 para lesiones pequeñas, 3 por lesiones significativas con rotura de puente de menor importancia de los márgenes, y 4 para lesiones significativas con rotura importante en las lesiones periféricas.
el análisis estadístico
Para determinar diferente expresión de miRNAs en microarrays, análisis de la importancia microarrays (SAM, versión 2.1) se ha realizado mediante la comparación no pareada de dos clases en el procedimiento de SAM. Significativamente miRNAs expresados diferencialmente fueron seleccionados como las normas siguientes: | Puntuación (d) | ≥2 [Numerador (r) /Denominador (s + s0)], Doble Change≥2 o ≤0.5, y el valor de q (%) ≤5 ( tasa de falso descubrimiento, FDR) en la metástasis ósea del CaP en comparación con CaP primario.
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (SD). Las estadísticas se evaluaron utilizando el programa SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.). En PCR en tiempo real y los experimentos con animales, los datos se compararon mediante Estudiante
t-test
. La relación entre la expresión de los genes miARN las reguladas y las características clínico-patológicas en el CP primaria y metastásica ósea se analizó mediante la prueba de correlación de Spearman. En experimentos basados en ensayo de metástasis, los datos se analizaron con ANOVA de una vía. Para entender la relación entre miRNAs, las correlaciones significativas se determinaron mediante la prueba de correlación de rangos de Kendall.
p-valores de
. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
perfiles de expresión de miARN entre CaP primario y la metástasis ósea mediante el análisis de microarrays
Para investigar si miRNAs se expresan diferencialmente en CaP primario y hueso tejidos metastásicos, se recogieron seis parejas de tejidos primarios y metastásicos (de un mismo paciente) y se compararon sus perfiles de expresión utilizando un microarray miARN. Debido a que el ARN total en cinco pares de muestras no fue suficiente para un experimento de microarrays, solamente un par emparejado de las muestras se llevó a cabo con éxito un experimento de microarrays. Obviamente, se observó un incremento en la expresión de 18 miRNAs en la metástasis ósea en comparación con CaP primario, incluyendo MIR-451, -210, -141, -19b, -29b, -16, -20, -30b, -193a-3p, -15a , -181a, -26b, -200a, -106b, -20b, -486-5p, -15b, -363. La expresión de los tres miRNAs (MIR-145, -143, -612) fue, obviamente, se redujo en la metástasis ósea, especialmente la expresión de miR-145 y miR-143 con la reducción de 5,4 veces y 2,7 veces, respectivamente.
con el fin de determinar, además, si la expresión de miRNAs había diferencias estadísticamente en el CaP primario y metastásico tejidos óseos, se comparó la expresión de miRNAs en 6 muestras primarias CaP y 7 de hueso metastásico muestras utilizando un microarray miARN. Hemos encontrado que la expresión de miRNAs 5 tuvo una disminución estadísticamente significativa en la metástasis ósea en comparación con CaP primario, incluyendo MIR-508-5p, -145, -143, -100 y -33a con la reducción de 4,1 veces, 8,1 veces, 5,7 veces, 3,2 veces y 5,3 veces, respectivamente. Sin miARN expresión se incrementó significativamente (Tabla 1).
Tomados todos los datos juntos, hemos vuelto a analizar los datos de expresión de miRNAs 10, incluyendo MIR-508-5p, -143, -145, -100 , -125b, -153, -210, -363, -451 y -572, mediante análisis de agrupamiento (Figura 1
Un
).
A, México La certificación resultado de análisis de microarrays.
B, en tiempo real RT-PCR ensayos sobre el miR-143 (panel izquierdo), el miR-145 (panel derecho), y miR-125 ter (panel inferior) en 16 cáncer de próstata primario y 13 tejidos metástasis óseas . El orden de las muestras de tejido es el mismo para los tres parcelas.
p-valores
por
t-test
.
Verificación de los datos de microarrays miARN por análisis de PCR en tiempo real en el CaP primario y la metástasis ósea
para confirmar nuestros datos de microarrays, PCR en tiempo real se realizó para analizar la expresión de los miRNAs regulados lo más significativo, incluyendo MIR-508-5p, -143, -145, -100 y -33a. Se examinó la expresión de miRNAs por encima de 16 muestras independientes de CaP primaria y 13 metástasis óseas, que no habían sido utilizados para el análisis de microarrays. Después del nivel miRNA individual en cada muestra se cuantificó y se normalizó a la expresión U6, datos en tiempo real PCR confirmó que la expresión de miRs-145, -143, -100 -33a y con la reducción de 17,3 veces, 12,9 veces, 1,7 -fold y 1,7 veces en los tejidos metastásicos del hueso, respectivamente. Los niveles de expresión de MIR-143 y -145 se redujeron regulado de manera significativa en las muestras de metástasis en comparación con CaP primario (
p = 0,012
yp = 0,014, respectivamente) (Figura 1
B Opiniones). Sin embargo, la expresión de MIR-33a y -100 no tuvo significancia estadística (
p = 0,236
y
p = 0,448
, respectivamente). miR-508-5p no expresó en todas las muestras primarias y CaP metastásico muestras óseas. Aunque la expresión de MIR-125 ter, -153, -210, -363, -451 y -572 había terminado cambios de 2 veces en la metástasis ósea en comparación con las muestras primarias CaP en el análisis de microarrays, no hubo diferencias estadísticamente significativas a excepción de la expresión de miR-125 ter con la reducción de 3 veces en los tejidos metastásicos del hueso por análisis de PCR en tiempo real. Esto fue estadísticamente significativa regulación a la baja en las muestras de metástasis óseas (
p = 0,012
) (Figura 1
B Opiniones). Por lo tanto, los resultados indicaron que había una regulación a la baja significativa de MIR-145, -143, y -125b cuando los tumores CaP metástasis en los huesos.
Para identificar mejor las fuentes principales de expresión en muestras de CaP primarias, la se aplicó la técnica de LNA-ISH. Los resultados mostraron que miRs-143 y -145 expresan principalmente en células de cáncer, y su expresión en las células del estroma fueron menores o ausente (Figura 2).
Secciones en el panel superior mostraron la identificación de células tumorales y estroma células de H & amp; E-stainning. Secciones en el panel inferior mostraron la ubicación de miR-143 (izquierda) y miR-145 (derecha) en células de CaP por LNA-ISH. Las señales de MIR-143 y -145 fueron en azul púrpura. Fotos fueron tomadas con un microscopio de 200 aumentos.
Expresión relativa de los MIR-143 y -145 en la misma muestra
Para investigar más a fondo si la tendencia expresión de miR-145 y miR 143 era idéntico en la misma muestra, la expresión relativa de miR-145 y miR-143 en la misma muestra se trazó desde la PCR en tiempo real en todas las 22 muestras de CaP primario (incluyendo 6 muestras de microarrays) (Figura 3
Un
) y 20 muestras de metástasis óseas (incluyendo 7 muestras de microarrays) (Figura 3
B Opiniones), respectivamente. Las correlaciones significativas de miR-145 y miR-143 se encontraron en el CaP primario (Kendall correlación = 0,850,
p Hotel & lt; 0,001) y metástasis óseas (Kendall correlación = 0,765,
p & lt
;.. 0.001)
A-B, Expresiones de MIR-143 y -145 y sus relaciones en muestras primarias de cáncer de próstata (A) y muestras de metástasis ósea (B) guía
regulación a la baja de los MIR-143 y -145 se correlaciona negativamente con metástasis ósea, nivel de PSA sérico y la puntuación de Gleason en la primaria del CP
Como hemos constatado que MIR-143 y -145 fueron regulados a la baja en metástasis ósea, que postula que la regulación a la baja de los MIR-143 y -145 también podría estar asociado con las características clínico-patológicas de los pacientes con CaP. En primer lugar, se realizó una investigación retrospectiva de 22 pacientes con CaP primario. Los resultados mostraron 12 pacientes sin metástasis en los huesos y los 10 pacientes con metástasis ósea. La distribución de la edad en 22 pacientes con y sin metástasis óseas hubo diferencias significativas. La expresión de miRs-143 y -145 en 10 pacientes con metástasis ósea fue significativamente menor que en 12 pacientes sin metástasis en los huesos (
p
= 0,039 y
p
= 0,041, Figura 4,
Un
y
D
). En segundo lugar, se evaluó si la expresión de MIR-143 y -145 se relaciona con el nivel sérico total del antígeno prostático específico (PSA) y el nivel de PSA libre en el CaP primario. Los resultados mostraron correlaciones inversas significativas entre la expresión de MIR-143 y -145 y el nivel de PSA libre (correlación de Spearman = -0,501,
p = 0,018
; correlación de Spearman = -0,536,
p
= 0,010. Figura 4,
B Opiniones y
e
), y una correlación inversa significativa entre la expresión de miR-145 y el nivel de PSA total (correlación de Spearman = -0,456,
p
= 0,033, Figura 4
F
); mientras que hay una correlación entre la expresión de miR-143 y el nivel de PSA total (correlación de Spearman = -0,403,
p = 0,063
). Por último, se investigó si la expresión de MIR-143 y -145 se relaciona con puntuación de Gleason en el CaP primario. También existe una correlación inversa estadísticamente significativa entre la expresión de MIR-143 y -145 y la puntuación de Gleason (correlación de Spearman = -0,574,
p = 0,005
; correlación de Spearman = -0,546,
p
= 0,009, Figura 4,
C
y
G
). Estos resultados indicaron que downregulations de miRs-143 y -145 fueron asociados con la progresión tumoral y la metástasis ósea. Regulación a la baja de miR-125 ter no se correlacionó con metástasis ósea, nivel de PSA y la puntuación de Gleason en primarias PCA (datos no mostrados).
A y D,
La expresión de MIR-143 o -145 en los pacientes con metástasis ósea fue significativamente más bajo que sin metástasis (
t-test
,
p = 0,039
,
p = 0,041
, respectivamente).
B y E de búsqueda Las muestras tumorales fueron divididos en cuatro grupos con tamaños de muestra aproximadamente iguales en función del nivel de PSA libre. El nivel de PSA libre en pacientes con tumor primario se presenta en el eje x. El eje Y es la media de miRs-143 o -145 dentro de cada grupo. Las barras representan los errores estándar. Hubo una correlación estadísticamente significativa de Spearman que caracteriza una relación inversa entre el MIR-143 o -145 expresión y PSA libre (correlación de Spearman = -0,501,
p = 0,018
; correlación de Spearman = -0,536,
p
= 0,010).
F, Francia El nivel de PSA total también se correlaciona con el miR-145 (correlación de Spearman = -0,456,
p = 0,033
).
C y G, España Las puntuaciones de Gleason de grupo tumor primario se presentan en el eje x. El eje Y es la media de miRs-143 o -145 dentro de cada grupo. Las barras representan los errores estándar.