Extracto
Antecedentes y objetivos
GLI1 es el factor de transcripción clave en la vía de señalización Hedgehog en el cáncer de páncreas. RegIV está asociado con la regeneración y el crecimiento celular, la supervivencia, la adhesión y resistencia a la apoptosis. El objetivo fue estudiar la expresión RegIV en el cáncer de páncreas y su relación con GLI1.
Métodos
GLI1 y expresión RegIV se evaluaron en el tejido del tumor y los tejidos normales adyacentes de los pacientes con cáncer de páncreas y 5 células de cáncer pancreático líneas de QRT-PCR, Western blot e inmunohistoquímica (IHC), y la correlación entre ellos. El vector lentiviral GLI1-shRNA se construyó y transfectó en PANC-1, y el vector lentiviral que contiene la secuencia de expresión GLI1 se construyó y transfectó en BxPC-3. GLI1 y expresión RegIV fueron evaluados por qRT-PCR y Western blot. Finalmente hemos demostrado RegIV a ser el blanco de GLI1 por inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) y ensayos de movilidad electroforética (EMSA).
Resultados
Los resultados de IHC y QRT-PCR mostró que RegIV y expresión GLI1 fue mayor en tejidos de cáncer de páncreas en comparación con los tejidos normales adyacentes (p & lt; 0,001). expresión RegIV correlacionada con la expresión GLI1 en estos tejidos (R = 0,795, P & lt; 0,0001). Se verificaron Estos resultados para la proteína (R = 0,939, p = 0,018) y la expresión de ARNm (R = 0,959, p = 0,011) en 5 líneas celulares de cáncer de páncreas. RegIV ARNm y la expresión de la proteína se redujo (94,7 ± 0,3%, 84,1 ± 0,5%; respectivamente) cuando se GLI1 fue derribado (82,1 ± 3,2%, 76,7 ± 2,2%; respectivamente) mediante la técnica de ARNi. GLI1 sobreexpresión de ARNm y proteínas (924,5 ± 5,3%, 362,1 ± 3,5%; respectivamente) inducida por la sobreexpresión RegIV (729,1 ± 4,3%, 339,0 ± 3,7%; respectivamente). Por otra parte, los ensayos de chip y EMSA mostraron proteína GLI1 con destino a las regiones promotoras (RegIV GATCATCCA) en las células de cáncer de páncreas.
Conclusión
GLI1 promueve RegIV la transcripción mediante la unión al promotor del gen RegIV en el cáncer de páncreas.
Visto: Wang M, L Xu, Guo C, Ke A, G, Hu, Xu X, et al. (2011) Identificación de RegIV como una novela GLI1 objetivo de genes en el cáncer pancreático humano. PLoS ONE 6 (4): e18434. doi: 10.1371 /journal.pone.0018434
Editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Octubre, 2010; Aceptado: March 4, 2011; Publicado: 11 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81072065), Fundación para el Comité de Ciencia y Tecnología de Shanghai (núm 09JC1412200, No. 09410705400), y el Fondo de Doctorado del Ministerio de Educación de China (Nº 20090072110022). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de páncreas (CP) es la cuarta causa relacionada con el cáncer más común de mortalidad en el mundo occidental [1] - [3] y tiene un pronóstico sombrío a pesar del progreso considerable en la gestión. La mediana de supervivencia de PC es menos de 6 meses; la tasa de supervivencia a 5 años es menor del 5% [1], [2]. Más del 80% se presentan con enfermedad no resecable; un tercio tiene la enfermedad local, mientras que el resto tiene metástasis a distancia. La investigación durante las últimas dos décadas se ha demostrado que la PC es una enfermedad genética, fundamentalmente, causada por la línea germinal heredadas y adquiridas mutaciones somáticas en los genes asociados con el cáncer. modelo de progresión tumoral para PC en el que el epitelio ductal pancreático progresa desde la normalidad a mayores grados de neoplasia intraepitelial pancreáticas (PanINs) a cáncer invasivo. Múltiples alteraciones en los genes que son importantes en la progresión del PC se han identificado, por ejemplo, K-ras, INK4A, p53, y SMAD4 /DPC4 [4], [5]. PC se caracteriza por mutaciones casi universal en K-ras y la desregulación frecuente de las vías de señalización embrionarias cruciales, incluyendo el erizo (HH) vía de señalización [6], [7]. Una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes al desarrollo de PC podría ayudar a mejorar el diagnóstico precoz y potencialmente identificar dianas terapéuticas moleculares.
El erizo (HH) vía de señalización se identificó por primera vez en el desarrollo embrionario de Drosophila [8] y se ha demostrado ser crucial para el crecimiento y el patrón en el páncreas durante el desarrollo embrionario. la señalización de HH regula la diferenciación celular y la formación de órganos durante el desarrollo embrionario, y se expresa en las células epiteliales pancreáticas [9], [10]. La activación constitutiva de la señalización de HH se detecta en una variedad de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de páncreas [9] - [13]. Dada su expresión errónea en ambas líneas celulares de cáncer de páncreas metastásico y en lesiones precursoras (PanIN) [14], la activación de la señal HH pueden estar implicados tanto en la tumorigénesis pancreática temprana y tardía.
De los tres ligandos de mamífero de la familia de HH , sonic (SHH), Desert (DHH), y el indio (IHH) Hedgehog [15], el primero ha sido asociado tanto con la organogénesis de páncreas y cáncer de páncreas. señales HH se transmiten y modificados por dos proteínas transmembrana, patched (PTCH) y smoothened (SMO), y por factores de transcripción aguas abajo que son miembros de la familia del oncogén glioma-asociado (GLI) (GLI1, 2, y 3). GLI2 y GLI3 tienen transactivación y dominios de represión, mientras que las funciones probables Gli1 sólo como un transactivador transcripcional y de destino de la ruta de HH en sí [16] - [19]. La familia de genes de la regeneración (REG), un grupo de pequeñas proteínas de secreción, está implicado en la proliferación celular o la diferenciación en los órganos digestivos [20], está regulada positivamente en varios cánceres gastrointestinales, y funciona como trófico o factores antiapoptóticos [21] - [23] . RegIV, un miembro de la familia de genes de regeneración, está implicado en los tumores malignos del tracto digestivo, incluyendo el estómago [24], colorrectal [25], [26], y el páncreas [27], [28], así como en las enfermedades benignas tales como colitis ulcerosa [29]. RegIV sobreexpresión en células tumorales se ha asociado con el crecimiento celular, la supervivencia, la adhesión y la resistencia a apoptosis. Recientemente, se informó de RegIV sobreexpresión de estar asociado con el inicio y la progresión del cáncer de páncreas, y se sugirió como un marcador tumoral prometedor para la pantalla del PC etapa temprana y objetivo para la terapia adyuvante en PC [28], [30].
las funciones de GLI1 y RegIV parecieron ser similares en nuestra revisión de la literatura; por lo tanto, se determinó la expresión y la correlación de GLI1 y RegIV en tejidos y líneas celulares PC. También se analizó el posible mecanismo entre GLI1 y RegIV, mediante el uso de ensayos de chip y EMSA.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y tejidos
líneas celulares de cáncer de páncreas humano, PANC -1, AsPC-1, BxPC-3, Capan-2 y SW1990, fueron adquiridos de la Academia china de Ciencias banco de células Comité Type Culture Collection. PANC-1 se cultivó en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) (Gibco BRL, EE.UU.), los otros tipos de células se cultivaron en RPMI-1640 (Gibco BRL, EE.UU.), y todos los medios se complementaron con 10% de FBS (Gibco BRL, EE.UU.), penicilina G (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /ml). Las células se incubaron a 37 ° C con 5% de CO2. Doce pares de PC y los tejidos del páncreas no cancerosas correspondientes se obtuvieron a partir Décima Hospital del Pueblo de Shanghai con el consentimiento por escrito ética completa. Ninguno de estos pacientes habían recibido quimioterapia o radioterapia antes de la resección del cáncer. Otros 9 tejidos emparejados rebanadas se obtuvieron del departamento de Anatomía Patológica del Hospital Shanghai Décima Popular. El estudio fue aprobado por el Comité Ético de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida de la Universidad de Tongji.
corto horquilla RNA (shRNA) Diseño y producción del vector
secuencias interferentes que corresponden a regiones distintas de GLI1mRNA, como así como control negativo sin homología de genes humanos o de ratón fueron diseñados por Shanghai GeneChem Biotech (Tabla 1). Tres dúplex de siRNA fueron seleccionados para GLI1 knock-down por Western blot en los experimentos de cotransfección con el plásmido de expresión GLI1 en células HEK 293T. La secuencia más éxito y una secuencia no silenciar luciferasa fueron diseñados en una plantilla de oligonucleótido que consiste en shRNA sentido, bucle de horquilla, antisentido, y secuencias de terminación, todos los cuales estaban flanqueadas por sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación direccional sub. Los vectores resultantes GFP codificados bajo el control transcripcional del promotor EF1 y un promotor H1 aguas arriba de la clonación de los sitios de restricción (
Mlu I y
Cla
i) para permitir la introducción de oligonucleótidos que codifican shRNAs. Cualquiera de shRNA contra GLI1 o un shRNA nonsilencing-luciferasa se encuentra bajo el promotor H1 (Figura 1). La inserción correcta del shRNA específica se confirmó por secuenciación directa del ADN.
Para el vector GLI1-shRNA, dos ADN de una sola hebra que codifican dos engarces, las secuencias diana y un elemento de bucle, se sintetizaron. Estos fueron recocidas a ADN bicatenario, y se ligaron en el siguiente pLVTHM
Mlu I y
Cal
I digestión. La forma de horquilla corta de shGLI1 se expresa bajo el control del promotor H1 humano. El vector también contiene un promotor EF1-α humano que dirige el gen marcador de GFP para el seguimiento de las células transducidas. Los vectores fueron generados por transfección transitoria de PRSV-REV, pMDLg-pRRE, pMD2G, y la codificación de shRNA pLVTHM en células 293T. Abreviaturas: RRE, elemento de respuesta Rev; cPPT, tracto de polipurina central; EF1-α, factor de elongación humano 1-α promotor; H1, el promotor H1 humana; GFP, proteína fluorescente verde; PRE, virus de la hepatitis humana elemento regulador post-transcripcional.
Para la producción del vector lentiviral, las células HEK 293T fueron cultivadas a 30-40% de confluencia por el día siguiente. El día siguiente, el medio se reemplazó con DMEM /10% de FBS sin antibióticos. Posteriormente, 20 g de ADN plásmido shRNA (sin sentido shRNA o GLI1 orientación shRNA; GeneChem Biotech, Shanghai, China), 7,5 g pMD2G, 10 g PRSV-Rev, y 15 mg pMDLg-pRRE se mezclaron con estéril ddH
2O de un volumen final de 1.800 l, luego se mezcla con 200 l de 2,5 M CaCl
2. La mezcla de ADN se oxigena y 2000 l 2 × PBS (pH 7,05) añadido en gotas, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de transfección se añade a sus respectivas placas y se incubó durante la noche. El medio se sustituye después de 12 horas con DMEM suplementado con 10% FBS. Después de 48 horas, se recogió el medio acondicionado que contiene shRNA lentivirus y se filtra a través de filtros de acetato de celulosa de tamaño de poro de 0,45 micras, y se almacena en hielo. El virus se concentró por centrifugación a 70.000 G durante 2 horas y se resuspendió con 500 l de PBS. La unidad de transducción (UT) del título se evaluó en las células HEK 293T en presencia de polibreno 8 mg /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Los títulos de 2-5 × 10
8 TU /ml se alcanzaron de forma rutinaria.
La sobreexpresión-GLI1 vector lentiviral construcción
GLI1 ADNc humano se adquirió en Abrir-Biosystem (EE.UU.). La secuencia de ADNc completa de GLI1 se generó por PCR usando el cebador directo, 5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTCAACTCGATGACCCCAC-3 '; y cebador inverso, 5 'TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGGCACTAGAGTTGAGGA-3'; a continuación, se inserta en un PGC-FU-EGFP-3FLAG vectorial (GeneChem Company, Shanghai, China). Los transformantes se analizaron mediante secuenciación. El fragmento de 3320 pb resultante se confirmó por secuenciación (Figura S1) y se compara con la secuencia de la región de la expresión de genes GLI1 en GenBank (NM_005269.2). Para producir de stock lentiviral, 293FT células fueron cultivadas a 70-85% de confluencia al día siguiente. Se retiró el medio de cultivo completo. Las células se expusieron a 5 ml de medio (Opti-MEM; Invitrogen) con complejos que contienen construcción de empaquetamiento ayudante (GeneChem Company, Shanghai, China), 20 g plásmido de expresión de ADN (PGC-FU-EGFP-3FLAG-GLI1), o el plásmido de control ADN (PGC-FU-EGFP-3FLAG) con 100 l de lipofectamina 2000 (Invitrogen, EE.UU.) en presencia de polibreno (8 mg /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Después de la incubación durante 24 horas, el medio de infección fue sustituido con medio de cultivo completo. sobrenadantes que contienen lentivirus se cosecharon 72 horas después de la transfección. Los sobrenadantes se centrifugaron para eliminar los restos de pellets y se almacenaron a -80 ° C. Los títulos de 2-5 × 10
se lograron rutinariamente 7 TU /ml.
Lentiviral transfección
Las células (1 × 10
5) en una placa de seis pocillos se transfectaron con el vector lentiviral a una multiplicidad de infección (MOI) = 5 (PANC-1) o 20 (BxPC-3) en presencia de 8 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Después de 72 horas de la transfección, el medio se reemplazó con 2 ml de medio de cultivo completo. 48 horas después de la transfección, expresión GLI1 se estableció mediante análisis de transferencia de Real-Time PCR y Western.
Citometría de Flujo
Las células se ajustaron a 1 x 10
6 células /100 L y usados por citometría de flujo. Se analizaron un total de 10.000 eventos para determinar la eficacia de transfección usando FACS Calibur (Becton Dickinson, EE.UU.) el software Cell-Quest.
QRT-PCR
reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) se realizó con el sistema ABI Prism 7900HT de detección de secuencias (Applied Biosystems, CA, EE.UU.). GLI1 y la expresión de ARNm RegIV se analizó mediante qRT-PCR utilizando SYBR Green Dye. β-actina se utilizó como gen de mantenimiento. expresión del gen diana se normalizó a ß-actina y analizada por el 2
-ΔΔCT
fórmula. El primer secuencias son las siguientes: GLI1, hacia adelante: TTCCTACCAGAGTCCCAAGT, revés: CCCTATGTGAAGCCCTATTT, RegIV, hacia adelante: CGCTGAGATGAACCCCAAG, revés: TGAGAGGGAAGTGGGAAGAG. β-actina, hacia adelante: AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA, revés: CTGGAACGGTGAAGGTGACA. Todas las reacciones se realizaron al menos tres veces.
análisis de transferencia de Western
Las células se lavaron dos veces en PBS, después se lisaron durante 2 horas en tampón de lisis RIPA en hielo y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. La concentración de proteína se determinó por el método BCA estándar (BCA ™ Kit de ensayo de proteínas, Pierce, EE.UU.). 50 g de proteína total se separó por SDS-PAGE usando 6% o 12% en gel de poliacrilamida con Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, EE.UU.). GLI1 y proteínas RegIV en gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 m con mini célula de transferencia y Trans-Blot SD transferencia Semi-Dry Cell (Bio-Rad, EE.UU.), respectivamente.
Los inmunorreactivos utilizados para Western blot fueron anticuerpo monoclonal de conejo contra GLI1 (1:200; Santa Cruz, EE.UU.) y de cabra policlonal de anticuerpos anti-RegIV (1:100; Santa Cruz, EE.UU.). Ratón anticuerpo anti-β-actina policlonal (1:5000; Santa Cruz, EE.UU.) se utilizó como control de carga. Las transferencias fueron desarrolladas por un método estándar aumento de quimioluminiscencia (ECL) (Pierce, EE.UU.). Todos los experimentos se repitieron varias veces y dieron resultados similares.
Inmunohistoquímica
Tumor secciones se desparafinaron, se rehidrataron, y se trataron con tampón citrato 10 mM (pH 6,0) a 95 ° C para recuperar antígenos. Después de extinguir la actividad peroxidasa endógena con H
2O
2 y el bloqueo con suero de caballo normal al 10%, las secciones se incubaron secuencialmente con los anticuerpos primarios de cabra anti-RegIV (1:100; Santa Cruz, California, EE.UU.), conejo anti-GLI1 (1:200; Santa Cruz, California, EE.UU.), los anticuerpos con biotina secundaria, y el reactivo ABC (Gen Tech, Shanghai, china). La inmunotinción se visualizó con 3,3 -Diaminobencidina (Gen Tech, Shanghai, China). Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina. Se realizaron controles negativos en cada caso mediante la sustitución del anticuerpo primario con PBS.
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
Hemos modificado el protocolo previamente informado [31] para la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP). En resumen, las células PANC-1 (3 × 10
7) fueron reticulado con 1% de formaldehído. La reacción de fijación se detuvo añadiendo 10 ml Glicina (0,125 M), entonces la cromatina se recogió con 1 ml de tampón IP que contiene un cóctel inhibidor de proteasa. La cromatina se cortó mediante el uso de un aparato de ultrasonidos con una sonda de punta de 4 mm 3 veces durante 10 segundos impulsos (60 W, 80 W y 100 W, respectivamente, 90 s intervalos) en una caja de hielo. La reticulación se invirtió mediante la adición de 20 l de 5 M NaCl durante la noche a 65 ° C. Se extrajo el ADN usando el ensayo de fenol /cloroformo. 20 l de ADN se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y el resto se conservó a -20 ° C como ADN de entrada. cromatina soluble se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-GLI1 anticuerpo monoclonal de conejo 2 g (Santa Cruz, California, EE.UU.). Se añadió la IgG de ratón 2 g (Santa Cruz, California, EE.UU.) como un control aleatorio, la ARN polimerasa II como control positivo, y el anticuerpo β-actina como control negativo. complejos inmunes ADN-proteína se eluyeron y revertir reticulado, y el ADN se extrajo con fenol /cloroformo y se precipitó. La presencia del dominio promotor RegIV que contiene motivos GLI1 en el ADN inmunoprecipitado fue identificado por PCR utilizando los siguientes cebadores: RegIV-A para el sitio 1 (118 pb), hacia adelante: 5'-5-TGGTCCCTTCCAGACTTA-3-3 ', inversa: 5 '- TCCAGTATAGATGGCAAA -3'. RegIV-B para el sitio 2 (131 pb), hacia adelante: 5'-CTAACCCTTTGCCATCTA -3 ', inversa: 5'-GACCTGGACACTGAACCTTG-3'. RegIV-C para el sitio 3 (70 pb), hacia adelante: 5'-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ', inversa: 5'-GTGTTACATAACGGGTTT-3'. RegIV-D para acuáticos4 (70 pb), hacia adelante: 5'-TGTAACACACTCTGTTGATGTAAGC-3 ', inversa: 5'-CTATTTGAGCTTCTCCCGCAG-3'. RegIV-E para los sitios 3 y 4 (226 pb), hacia adelante: 5'-CTCGGAAGGTTTCTAATC-3 ', inversa: 5'-TTCAACATGCGTGAGTTT-3'. RegIV-F para los sitios 3 y 4 (481 pb), hacia adelante: 5'-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ', inversa: 5'-AGACGGCTTCAGAATGTA-3'. RegIV-G para el sitio 5 (315 pb), hacia adelante: 5'-TTCCTGAGGCAAGAAGAT-3 ', inversa: 5'-CCAAGATTTAACCCAACA-3'. Las condiciones de PCR para la región promotora RegIV fueron: desnaturalización de 30 segundos a 94 ° C, recocido 30 s, alargamiento de 1 hora a 72 ° C. temperaturas de recocido para RegIV-A-G fue de 55 ° C, 56 ° C, 56 ° C, 47 ° C, 56 ° C, 56 ° C y 52 ° C, respectivamente. La amplificación de la región promotora RegIV se analizó después de 35 ciclos. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) guía
Los extractos nucleares se prepararon con NE-PER nucleares y citoplasmáticas de extracción Reactivos (Pierce, Rockford, EE.UU.). EMSA y supershift EMSA con sondas marcadas con digoxina se realizaron utilizando el kit de cambio DIG-Gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche, Basilea, Suiza). Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados fueron 5'-AGAACATGGATGATCATGTCA-3 '(motivo de unión subrayado). oligonucleótidos mutantes utilizados fueron 5'-AGAACAAAAAATTTTATGTCA-3 '. En el estudio supershift, el anticuerpo monoclonal de conejo 5 mg contra GLI1 se incubó con 5 g de extracto nuclear en hielo durante 30 minutos antes de la adición de la sonda marcada, y se incubó de nuevo en hielo durante 30 minutos. Toda la reacción de unión 20 l se resolvió en un gel de poliacrilamida al 7% y se transfirieron a una membrana de nylon cargada positivamente (Bio-Rad, EE.UU.) en 0,5 x tampón de Tris borato-EDTA.
El análisis estadístico
los datos cuantitativos se expresan como la media ± desviación estándar (SD). Datos en tiempo real PCR se analizó de acuerdo con las diferencias de expresión del gen diana por la prueba t pareada y eran 2
-ΔΔCT
transformados antes del análisis. La relación entre GLI1 y expresión RegIV se analizó utilizando Spearman. IHC datos se analizaron mediante la prueba de Chi-cuadrado. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
GLI1 y expresión RegIV en tejidos de cáncer de páncreas
Para estudiar GLI1 y expresión RegIV en PC, QRT -PCR y la IHC se utilizaron en 12 tejidos de biopsias pareadas. GLI1 expresión fue mayor en 9 casos (9/12) en comparación con los tejidos pancreáticos normales adyacentes (p = 0,011; Figura 2); expresión RegIV fue mayor en 9 casos (9/12) (p = 0,011; Figura 2). Hubo una correlación positiva entre GLI1 y RegIV en los tejidos de PC (r = 0,795, P & lt; 0,0001; Figura 2). En IHC, encontramos RegIV que se expresa sólo en las células beta pancreáticas endocrinas de los tejidos normales, lo que confirmó el informe de Oue [37]. En IHC, GLI1 y expresión RegIV fueron superiores en más PC en comparación con los tejidos normales (15/21 frente a 4/21, p = 0,001; 14/21 frente a 5/21, p = 0,005; respectivamente; Figura 3). 15 de 21 casos de PC tenían una alta expresión de la proteína GLI1, entre los cuales 11 casos expresan altos niveles de proteína RegIV (p = 0,001; Figura 3).
La expresión de ARNm GLI1 RegIV en 12 pares de tejidos y PC tejidos normales adyacentes (A-B). ADN de las muestras se obtuvieron de biopsias quirúrgicas, y GLI1 relativa y la expresión RegIV ARNm se detectaron mediante qRT-PCR. correlación estadística entre la expresión de mRNA y GLI1 RegIV en 12 pares de tejidos de PC y los tejidos normales adyacentes se analizó mediante la prueba de Spearman (C). Todos los resultados se normalizaron a beta-actina expresión mRNA. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar y se calcularon mediante la prueba t pareada. Significativamente diferente entre los dos grupos: * p & lt; 0,05. ** P & lt; 0,01. NS:. No significativa
Se recogieron todas las muestras, de la fijada en formalina, embebido en parafina, y detectado por IHC. se muestran imágenes representativas. La tinción positiva de GLI1 se observó en el núcleo de la célula PDAC (A); sin embargo, los tejidos normales adyacentes no exhibieron o tinción débil para GLI1 (B). En los tejidos pancreáticos normales adyacentes, sólo las células de los islotes mostraron tinción positiva de RegIV (D), mientras que se observó la tinción positiva de RegIV así como gránulos citoplasma caliciformes-como en los tejidos de PC (C). Todas las fotomicrografías se obtuvieron a 200 × magnificación. Las barras de escala, 100 m.
La correlación entre GLI1 y RegIV
Hemos probado expresión GLI1 y RegIV en 5 líneas celulares PC por qPCR y Western blot. Hubo una correlación positiva entre el nivel de mRNA y GLI1 RegIV y proteínas (R = 0,958, p = 0,011 y R = 0,939, p = 0,018, respectivamente; Figura 4). GLI1 y RegIV se sobreexpresa en PC frente a las células pancreáticas normales.
La expresión de proteínas Gli1 y RegIV en 5 líneas celulares de cáncer de páncreas tal como se detectó por análisis de transferencia Western sobre extractos de células, usando anticuerpos anti-Gli1 y anti-RegIV ( UN). β-actina se utilizó como control de carga en todos los experimentos. Los resultados se cuantificaron mediante la determinación de las intensidades de las bandas en comparación con la de β-actina (B). correlación estadística entre la expresión de la proteína y GLI1 RegIV en 5 líneas de células PC se analizó mediante la prueba de Pearson (C). GLI1 relativa y la expresión de ARNm RegIV fueron examinados por QRT-PCR (D). La expresión de ARNm y GLI1 RegIV se normalizó a ß-actina de la expresión del ARNm. correlación estadística entre la expresión de mRNA y GLI1 RegIV en 5 líneas de células PC se analizó mediante la prueba de Pearson (E). Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
RegIV expresión cambió con la expresión GLI1 en PANC-1 y BxPC-3
A fin de verificar la relación entre GLI1 y RegIV en células PC, hemos diseñado y construido shRNA-GLI1 vector lentiviral, y se transfectaron en PANC-1, una línea celular PC con la más alta expresión de GLI1 (Figura 4). 48 horas después de la transfección, la eficiencia de transfección se demostró por citometría de flujo (FCM) para ser más de 95% (Figura S2); fluorescencia estable aún se podía detectar incluso después de 20 pasajes (Figura S3).
Después, QRT-PCR y Western blot se utilizaron para detectar la expresión en células RegIV GLI1-shRNA-PANC-1. Las células sin transfección se utilizaron como controles, mientras que se utilizaron células transfectadas con scramble shRNA como controles negativos. RegIV ARNm disminuyó en un 94,7 ± 0,3% cuando GLI1 ARNm disminuyó en un 82,1 ± 3,2%. RegIV proteína disminuyó en un 84,1 ± 0,5% cuando la proteína GLI1 disminuyó en un 76,7 ± 2,2% (Figura 5). Esto sugiere que la expresión RegIV disminuye cuando GLI1 fue silenciado por RNAi.
células PANC-1 fueron transfectadas con GLI1-shRNA o GFP-shRNA, BxPC-3 células fueron transfectadas con LV-GLI1-eGFP o LV-eGFP , a continuación, la expresión de mRNA GLI1 relación a la de mRNA β-actina se evaluó mediante qRT-PCR (a, D). Después de la transfección, la expresión de proteínas Gli1 se analizó mediante transferencia Western (C, F). El recuadro muestra una disminución sustancial en la expresión RegIV por tiempo real RT-PCT (B, E) y Western blot (C, F). Los resultados se normalizaron a la de la expresión de β-actina. Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
más diseñarse y construirse un vector lentiviral que expresa GLI1, y se transfectaron en BxPC-3, con la expresión más baja de la GLI1 5 líneas celulares (Figura 4), para determinar si la expresión RegIV cambiado junto con GLI1. 48 horas después de la transfección, QRT-PCR y Western blot se utilizaron para detectar RegIV en las células LV-GLI1-BxPC-3. Las células sin transfección se utilizaron como controles, mientras que se utilizaron células transfectadas con el vector vacío lentivirus como controles negativos. RegIV ARNm se incrementó en 729,1 ± 4,3% cuando GLI1 ARNm se incrementó en 924,5 ± 5,3%. proteína RegIV aumentó en 339,0 ± 3,7% cuando la proteína GLI1 aumentó en 362,1 ± 3,5% (Figura 5). Esto implica que la expresión RegIV aumenta cuando GLI1 se sobreexpresa. Sobre la base de estos resultados, se concluye que GLI1, un factor de transcripción, podría regular la expresión génica RegIV.
identificación del candidato Gli1 sitios de unión en el promotor RegIV
La correlación positiva entre GLI1 y en RegIV tanto PC de tejidos y líneas celulares nos llevó a buscar el promotor RegIV para sitios de unión potencial Gli1 a la secuencia de ADN consenso 5'-GACCACCCA-3 '[42]. análisis de la base de datos reveló cuatro sitios potenciales localizadas aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (Figura 6). La homología de cada sitio de unión GLI1 a la secuencia consenso canónico varió de 67% (sitios 1, 2, 3 y 5) a 78% (sitio 4), lo que sugiere que el promotor del gen RegIV podría unirse a GLI1.
(a) Localización de los posibles sitios de unión GLI1 (números 1-5) en relación con la estructura del gen. P representa el sitio de inicio de la transcripción. El marco gris representa el sitio de empalme variable. Marcos en blanco representan los exones. (B) Posición de los sitios de unión en el promotor en relación con el sitio de inicio de la transcripción P y la homología de secuencia con la secuencia de unión GLI1 consenso, GACCACCCA.
Confirmación de la proteína GLI1 une a la región promotora de RegIV gen por CHIP
el ensayo de solución de cromatina sonicado mostró que el fragmento de ADN total aparecía manchado en el rango de 100 pb a 1 kb en el grupo de 80 W (figura S4). El resultado de la electroforesis de ADN mostró la banda de ADN predicho en INPUT, GLI1-Ab, y los grupos de control utilizando postive humano RegIV imprimación-D-F, y no en la IgG y los grupos de control negativo (Figura 7). Sólo de entrada y el control positivo mostró la banda predicho usando humano RegIV imprimación-A-C, G, pero no en GLI-Ab, IgG, y los grupos negativos (datos no presentados). Los resultados de análisis de la secuencia mostró que las secuencias eran la misma que la del promotor del gen RegIV de sitio 4 (Figura S5, S6, S7). Todos los datos sugirieron que GLI1 estaba obligado al promotor del gen RegIV del sitio 4 (GATCATCCA), y regulada RegIV en PC a través de la vía de señalización de HH
.
Las ubicaciones de RegIV imprimación-AG en la región promotora del gen RegIV . Los números en el diagrama esquemático del gen RegIV (números 1-5) corresponden a los posibles sitios de unión Gli1. P representa el sitio de inicio de la transcripción. Los lisados de células PANC-1 fueron sometidas a inmunoprecipitación de la cromatina por el anticuerpo anti-GLI1. RegIV humano imprimación-A-G se utilizaron para amplificar la región del promotor RegIV que contiene el sitio de unión GLI1-putativo. cromatina sonicado se utilizaron como control de entrada de ADN. IgG, la ARN polimerasa II, y β-actina Ab se utilizaron como controles al azar, controles positivos y controles negativos. (B) Sólo ENTRADA, control positivo, y GLI1-Ab mostró la banda predicho en bromuro de etidio-manchado geles de agarosa utilizando los productos CHIP-PCR que fueron amplificados por RegIV imprimación-D (i), RegIV imprimación-E (ii), y RegIV imprimación-F (iii). No se observó transcrito detectable en la plantilla amplificado a partir de IgG o de control negativo y un control positivo carril confirmó el fragmento esperado. Se utilizaron patrones de peso molecular (Marcador) para estimar el tamaño de las bandas amplificadas.
Confirmación de GLI1 unido al promotor RegIV por la EMSA
sitio
Como se ha descrito anteriormente, la unión GLI1 en la región promotora del gen RegIV se confirmó con chip-PCR. A continuación, utiliza los ensayos de EMSA para abordar directamente si se une GLI1 RegIV
in vivo
. Se sintetizaron oligonucleótidos específicos que contienen el elemento GLI1 presente en el promotor RegIV en experimentos EMSA con extractos nucleares de las líneas de PANC-1 de células. Como se muestra en la Figura 8, la incubación de las células PANC-1 extrae con la secuencia GLI1-RegIV marcado con biotina produjo un desplazamiento de banda de ADN-proteína. Estos complejos ADN-proteína fueron específicos al sitio GLI1 por ensayos de competición con éxito utilizando diferentes pliegues de oligonucleótidos marcados no marcado en exceso GLI1-RegIV GLI1-RegIV y mutante. Para confirmar la unión de GLI1 a la secuencia GLI1-RegIV, estas reacciones EMSA se incubaron adicionalmente con el anticuerpo anti-GLI1. Como se muestra en la Figura 8, la adición de este anticuerpo dio lugar a un complejo supershifted además de la banda de ADN-proteína. Estos datos demostraron la presencia de GLI1 en el complejo de la proteína nuclear que se une al sitio de unión del promotor GLI1 RegIV (-528~-520).
EMSA se realizó con extractos nucleares de células PANC-1 (carriles 2 a 7) o sin extractos nucleares (carril 1). La sonda RegIV se generó por hibridación de oligonucleótidos de una sola hebra y marcados en el extremo que contienen la región promotora RegIV (nucleótidos -528-520). Los experimentos de competición se realizaron con 1 veces (carriles 3), 10 veces (carriles 4), y 100 veces (carriles 5) el exceso de oligonucleótidos no marcados, respectivamente (carriles 3 a 5) o de 100 veces de oligonucleótidos mutantes marcados (carril 6). Para super-cambio, el anticuerpo anti-GLI1 (carril 7) se incubaron con extractos nucleares antes de añadirse a la reacción.
Discusión
En este estudio, se confirmó que GLI1 y RegIV se sobreexpresa en líneas celulares de tejido PC y, confirmado por otros informes [12], [20], [32]. Se demostró además una correlación positiva significativa entre la expresión de GLI1 y RegIV. La interferencia de ARN y los experimentos de sobreexpresión mostraron que la expresión RegIV cambió con la expresión GLI1 en líneas celulares de PC; esto fue confirmado por CHIP y EMSA.