Resumen
Los microARN (miARN) han sido reconocidos como una importante participación en el cáncer de próstata (CaP). Desde receptor de andrógenos (AR) desempeña un papel central en la carcinogénesis y la progresión del CaP, es imperativo para dilucidar sistemáticamente la asociación causal entre AR y miRNAs, centrándose en los mecanismos moleculares por los cuales median miRNAs AR señalización. En este estudio, hemos realizado una serie de microarrays de tiempo-luego de observar las expresiones dinámicas de todo el genoma de los ARNm y miRNAs en paralelo en células LNCaP de cáncer de próstata sensibles a las hormonas estimuladas por andrógenos. En consecuencia, hemos introducido Score de respuesta para identificar miRNAs objetivo AR, así como la modulación Score para identificar los genes miARN ARNm diana. Sobre la base de la identificación teórica y validación experimental, eran descodificados nuevos mecanismos de direccionamiento de la viabilidad celular en el CaP durante 3 miRNAs recientemente reconocidos como objetivos AR. (1) miR-19a es directamente hasta reguladas por AR, y reprime SUZ12, RAB13, SC4MOL, PSAP y ABCA1, respectivamente. (2) miR-27a es directamente hasta reguladas por AR, y reprime ABCA1 y PDS5B. (3) miR-133b es directamente hasta reguladas por AR, y reprime CDC2L5, PTPRK, RB1CC1, y CPNE3, respectivamente. Por otra parte, encontramos el miR-133b es esencial para la supervivencia celular CaP. Nuestro estudio da algunas pistas sobre miRNAs señalización mediada por AR a la viabilidad celular, influyendo en vías críticas, sobre todo por el gran avance por efecto de la restricción del crecimiento de andrógenos en el tejido prostático normal
Visto:. Mo W, Zhang J, Li X, Meng D , Gao Y, Yang S, et al. (2013) Identificación de Targeted-AR Novel microARNs Mediar andrógenos de señalización a través críticos Caminos para Regular la viabilidad celular en el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (2): e56592. doi: 10.1371 /journal.pone.0056592
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: 7 Septiembre, 2012; Aceptado: January 11, 2013; Publicado: 22 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Lu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por dos subvenciones 31071142 y 31171246 de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, y por Shanghai clave Laboratorio de Procesamiento inteligente de la Información de China (Nº IIPL-2010-002). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miRNA) son 20~24 nt ARN en proteínas endógenas nonencoding, y se han convertido en una clase importante de moléculas reguladoras implicadas en el desarrollo embrionario de mamíferos y la patogénesis [1]. Recientemente, un creciente número de estudios han señalado que los miRNAs juegan un papel fuerte en el cáncer de próstata (CaP) la iniciación, progresión y metástasis [1], [2], [3]. De próstata depende de los andrógenos para el crecimiento y el desarrollo, mientras tanto su tejido normal es controlada por ciertos mecanismos de restricción de crecimiento para evitar andrógenos inducido-sobre-crecimiento, es imperativo para revelar cómo el receptor de andrógenos (AR) media estas acciones y rompe a través de la restricción del crecimiento para guiar el CP carcinogénesis. Por lo tanto, hemos intentado identificar sistemáticamente miRNAs que unen las vías de estimulación AR al efecto fenotípico celular en el CP.
miRNAs En la actualidad, varios informes identificados en la señalización AR en el cáncer de próstata [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. miR-21 fue directamente hasta reguladas por AR en células de CaP sensibles a andrógenos [6], debido a la AR vinculante para el promotor definido. J. Ribas et al. encontrado además la inhibición de miR-21 puede disminuir la proliferación celular inducida por andrógenos CaP, y miR-21 era suficiente para los tumores dependientes de andrógenos para superar la detención del crecimiento inducida por la castración [6]. miR-125b, fue directa estimulada por AR, y promovió el crecimiento CaP independiente de los andrógenos por la represión de la expresión de BAK1 que regulaba la señalización apoptótica en CaP [7]. J. Ribas et al. [6] realizado el análisis de microarrays de expresión de miARN en dos líneas celulares de CaP andrógeno-dependientes LNCaP y LAPC-4 para encontrar miRNAs objetivo regulados por la AR. Sin embargo, no se puede distinguir claramente los objetivos directos e indirectos de la AR, ya que se obtuvo el perfil de expresión de miARN a las 72 h después de la estimulación androgénica. Recientemente, K. Takayama et al. han realizado una proyección de todo el genoma de los genes diana de AR mediante la integración de análisis de la jaula y el chip-chip para identificar los sitios de unión (AR) ARBSs en el genoma humano en células LNCaP [4]. Determinaron ARBSs de todo el genoma en el entorno de 100 kb de los genes miARN. Sobre la base de la unión cromosoma, K. Takayama et al. proporcionado información útil para dilucidar la red de señalización AR miARN mediada. Sin embargo, en las condiciones biológicas especiales, no todos los objetivos identificados por análisis de chip-chip son los objetivos reales de la AR; entre todos los miRNAs AR-dirigida, los miRNAs críticos que contribuyen a la señalización AR, pueden no encontrarse a cabo sólo a través de análisis de unión al cromosoma.
Por otra parte, para estudiar cómo miARN media la señalización AR, es necesario para identificar ARNm diana de miARN. predicciones basadas en la semilla de la secuencia de los genes miARN objetivo, como TargetScanS, bases de datos y miRDB Miranda, proporcionarán las claves informativas necesarias; aplicación de estas bases de datos de predicción en el contexto específico puede identificar objetivos reales de miARN. En la mayoría de los casos para los animales, aunque miRNAs y mRNAs diana no son completamente de base con ajuste, miRNAs todavía puede causar la degradación del ARNm diana mediante exonucleasas o P-cuerpo [8]. Es decir, el cambio de expresión de ARNm diana puede reflejar principalmente la regulación de los genes miARN. Por lo tanto, es ideal para observar al mismo tiempo expresión de las dos miRNAs y mRNAs de una forma de series de tiempo con el fin de identificar de manera eficiente la regulación de los genes miARN en el blanco en un contexto específico de tejido. Recientemente, V. Jayaswal et al. [9] han proporcionado un conjunto de datos dinámicos de observación simultánea miARN y expresiones de ARNm en una línea celular de mieloma U266. odds en base a los datos de tiempo-por supuesto miARN-mRNA emparejados, calcularon la estadística [9] para cada par miARN-mRNA obtenido a partir de la predicción basada en la secuencia. Por otra parte, la expresión de los genes miARN cambio no necesariamente producir un cambio instantáneo en la expresión del ARNm diana [9], este efecto lapso de tiempo debe ser considerado cuando se determina la regulación de los genes miARN. En V. Jayaswal y cols. Método [9], la importancia de probabilidades estadística no fue evaluada por la tasa de falso descubrimiento que es el estándar para evaluar la significación, y al tiempo transcurrido con diferentes intervalos para la representación de efecto retardado de miARN fueron tratados de igual modo que no está en consonancia con las circunstancias reales. Por lo tanto, un algoritmo mejorado para identificar con precisión los genes miARN objetivo en un contexto específico es, básicamente, exigió.
En principio, los miRNAs críticos que juegan papeles fuertes en la mediación de las vías de AR en células de CaP andrógeno-dependientes serán significativamente hasta reguladas después de la estimulación de andrógenos, y probablemente mantener la alta expresiones para un tiempo relativamente largo. En este estudio, hemos realizado un microarray de series de tiempo para observar simultáneamente miARN ARNm y expresiones de todo el genoma en virtud de la dihidrotestosterona (DHT, un andrógeno típico) la estimulación de las células LNCaP que son dependientes de andrógenos. Con el fin de determinar los roles miRNAs 'en la señalización AR, introdujimos Puntuación de Respuesta para identificar miRNAs objetivo AR, así como la modulación Score para identificar los genes miARN ARNm diana. Después de la validación experimental biológica, varios mecanismos interesantes para mediar en la señalización de miRNAs 'AR han sido recientemente revelados, que contribuyen significativamente a la supervivencia celular y la patogénesis del CP, y el estudio también reveló una posible mecanismo para romper a través de la restricción del crecimiento de andrógenos.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamiento con andrógenos
La línea celular LNCaP de cáncer de próstata humano sensible a hormonas se obtuvo de ATCC y se mantuvo en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y penicilina (100 unidades /ml) -streptomycin (100 g /ml) a 37 ° C en una incubadora de células CO2 al 5% humidificada. células LNCaP se cultivaron en RPMI exento de rojo fenol 1,640 (GIBCO /BRL) suplementado con 10% de carbón-dextrano-FBS durante 3 días antes del tratamiento de andrógenos, a continuación, se indujeron con DHT a una concentración de 10 nM. La respuesta dinámica de todo el genoma en DHT se analizó a diez puntos de tiempo - 0 h, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 24 hy 48 h, donde "0 h ' representa el estado antes de la acción de andrógenos. En este estudio, los 10 puntos de tiempo son numeradas como
k
= 0, 1, 2, ... 9. Para cada punto de tiempo, se extrajo el ARN total y se purificó usando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
Genoma en todo el perfil de expresión por Illumina BeadArray
total ARN en cada punto de tiempo se hibrida con Illumina Sentrix humano WG-6_V2 arrays de expresión (por BeadChip ARNm) y MicroRNAExpression perfiles (paneles de miARN) por separado. Los datos de microarrays primas se cargan en el Gene Expression Omnibus repositorio público (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/;. Gene Expression Omnibus serie sin GSE21245).
Datos Pre-procesamiento
Hemos normalizado microarrays de datos utilizando el método cuantil, y procesa los datos no auténticos. Para un gen, 'Detección
P
valor' evalúa la autenticidad de los datos de las señales detectadas. Si 'Detección
P
valor' & lt; 0,01, la señal es considerado como auténtico; de lo contrario es no auténtico. Hemos propuesto un criterio para la modificación de los datos no auténticos. En cada uno de microarrays, el valor mínimo de la señal de auténtico se establece como umbral, y denota como Min
au. Para un conjunto de datos de señal no auténtica,
a
es el valor original y el valor modificado = max {a, Min
au}. Se excluyeron los genes con más de 5 señales no auténticos. Posteriormente, los datos enteros fueron considerados como creíbles.
Identificación de AR candidatos blancos primarios
1) los genes sensibles a andrógenos.
Para gen
g
, representa el vector de transcripción, donde
N
es el número de puntos de tiempo con exclusión de 0 h, y
N = 9
en este estudio. (
k
= 0, 1, 2, ...,
N
) denota el valor transcripción en tiempo de
k
, y funciona como control de estímulos de DHT. Por gen en cada punto de tiempo, 'Diffscore' representa la expresión diferencial de importancia en comparación a 0 h. Nosotros consideramos como downregulated y upregulated como, correspondiente a. denota el vector de expresión discretizada de un ARNm, es decir, (
k
= 1, 2, ...,
N
) = 1, -1 o 0 debido a la regulación positiva, regulación a la baja o indiferenciación en el tiempo
k
; y denota el vector de expresión de los genes miARN datos discretos. Si un gen se expresa de forma diferente significativamente en un punto de tiempo en comparación con el 0 h, que se define como "gen sensible a los andrógenos 'en este estudio.
2) discriminador Tiempo de temprana y tardía respuesta.
para identificar sistemáticamente AR objetivos directamente regulados, desarrollamos una estrategia para detectar 'discriminador de tiempo' que distingue principalmente las etapas temprana y tardía de respuesta. En cada punto de tiempo, el número de diferencial expresado genes (en comparación con 0 h) se contó. Trazamos una curva del número de genes miARN expresados diferencialmente a lo largo transcurso de tiempo. Como el número de genes expresados diferencialmente en una etapa tardía son definitivamente mucho más grande que en una etapa temprana debido al efecto de amplificación en cascada [10], se define el discriminador de tiempo que el punto de tiempo cuando aparezca la segunda ráfaga de número génica diferencial, es decir, desde, la expresión diferencial está en una etapa tardía.
3) puntuación de respuesta para medir la respuesta de andrógenos-gen.
en general se considera que el objetivo directo de AR debe tener una expresión temprana respuesta al tratamiento con andrógenos; Por otra parte, los genes con andrógenos respuesta temprana y durative es probable no sólo ser regulados directamente por AR, pero también juegan un papel esencial en la señalización AR. En consecuencia, con el fin de identificar miRNAs que son ambos respondieron temprano y tardío, es decir, con andrógenos respuesta temprana y durativo, proponemos un índice de respuesta estadística (RS) para medir la respuesta de la expresión de un gen de andrógenos estímulos: (1) donde
En la Ec. (1), es el componente del vector de expresión discretizada del gen, es el primer elemento no nulo en el conjunto secuencial;
I gratis (
x =
y
) es igual a 1 si la condición se cumple y 0, de lo contrario; Int (
x
) toma la parte integral de
x
para ser su valor. El primer término de la ecuación. (1) es el efecto acumulativo de andrógeno-respuesta señalado por el factor de peso
N + 1-
k
, es decir, la expresión diferencial sucedió en un momento anterior tiene la mayor contribución a la función . El segundo término de la ecuación. (1) es el castigo por alteración frecuente de dirección diferencial, ya que los genes con el cambio de dirección de oscilación es menos importante en la conducción de la señal. Reflejada por, se castiga más pesado para la dirección alteración ocurrió en una etapa temprana, y castigado más ligera para una etapa tardía, ya que la respuesta temprana es más importante para la regulación primaria AR. Sobre la base de la definición RS, los genes con valores mayores RS son más proclives a ser regulados directamente por AR, y son más propensos a jugar un papel esencial en la realización de los efectos celulares de AR. En este estudio, los mejores 10% de genes según RS se identifican como blancos teóricamente candidato AR primarias.
identificación de dianas significativamente modulada por miARN
1) O-estadística.
Para ver la modulación mundial miRNAs 'de los ARNm, observamos los perfiles de expresión más de evolución en el tiempo, y se centran en si existe un cambio en la expresión en lugar de la dirección del cambio. Let.where
M
es el número total de miRNAs, es el número de secuencia basada en objetivos para predijo miARN
i
, y significan la diferenciación de expresión en tiempo de
k Opiniones de miARN
i
y ARNm
j
respectivamente. La odds ratio (OR) =
ad
/
bc
. Si O & gt; 1, miRNAs son considerados como la modulación a nivel mundial las expresiones de ARNm objetivo previsto
2) Puntuación de modulación para un predicho miARN-mRNA par basado en la secuencia
Para un miARN predijo.. -mRNA par cuyos miembros son tanto andrógeno-sensibles, es necesario para determinar si el mRNA se modula de manera significativa por el miARN en el contexto específico. coeficiente de Pearson que refleja la asociación de una manera continua se utiliza comúnmente para medir la correlación de expresión de los genes miARN y ARNm [11], mientras que la expresión diferencial de mRNA que refleja efecto de modulación discreta de miARN en cada punto de tiempo también debe ser considerado. Además, un cambio en la expresión de los genes miARN no puede producir un cambio de expresión instantánea en ARNm diana, el efecto 'desfase' debe ser considerado. Por lo tanto, proponemos una estadística - Modulación Puntuación (MS) - para medir la regulación de los genes miARN en la secuencia basada en predijo ARNm diana. Para un par predijo miARN-mRNA, (2) cuando, por
j
= 1, 2, ...,
N
, y por
k
= 2, 3, ... ,
N
.
En la Ec. (2),
r
es el coeficiente de correlación de Pearson calculado por los datos de expresión de miRNA y el ARNm, (
k
= 1, 2, 3, ...,
N
) representan los
N
puntos de tiempo, y,,, ..., en este estudio. Eq. (2) parece similar a
r
-a-
z
transformación de Fisher, que se distribuye normalmente [12]; con todo eso la ecuación. (2) se hace avanzar con el factor de peso
E
describir miRNA y de ARNm discreta correspondencia expresión diferencial. Medidas diferenciales correspondencia expresión sin retardo de tiempo; mientras que complementa la modulación con efecto retardado debido a diferentes retrasos de tiempo. La importancia de la EM se evalúa mediante nominal
valor de p
y ajustado
q
valor (Suplemento). En este estudio,
q
= 0,2 se establece como umbral para la identificación de importancia, es decir, si
q
& lt; 0,2, el ARNm se identificó como el blanco directo modulada de manera significativa por el miARN en el específica contexto.
cuantitativa en tiempo real RT-PCR para los genes miARN ARNm y
La cuantificación de los miARN se realizó a través del bombeo-miARN LoopTM qPCR (ribo). U6 pequeños ARN nucleares era el control endógeno. Para la cuantificación de ARNm, de ADNc se sintetizó a partir de RNA total usando el kit de reactivo PrimerScript ™ RT (Takara). La RT-PCR se realizó utilizando el kit de SYBR Premia Ex Taq ™ (Takara) en 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Los cebadores se indican en la Tabla S5 de archivo S1. Todos los valores de las muestras se normalizaron a GAPDH. El 2
- ΔΔCt método se utilizó como medida de cuantificación relativa de la expresión diferencial
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Ensayo
Se llevaron a cabo ensayos de chip como se describe en la ref.. [13]. Brevemente, las células después de tratamiento deseado se fijaron con formaldehído 1% a 37 ° C durante 7 min, a continuación, se recogieron las células en tampón de lisis SDS [mM Tris.Cl 50, pH 8,1, EDTA 10 mM, SDS al 1%] y se sonicaron a cizallar la cromatina (200~500 pb). Para cada chip, la fracción soluble de 2 × 10
6 células se recogió y se incubaron con anticuerpo de conejo anti-4 ug AR (PG-21, Upstate) o control de suero normal de conejo (IgG) a 4 ° C durante la noche. Los complejos inmunes fueron capturadas con 20 ul de la proteína A /G más-agarosa bolas (Santa Cruz). Después de un extenso lavado, los fragmentos de ADN unidas se eluyeron y purificaron. Los cebadores para el análisis de qPCR de fragmentos de ADN que contienen ARE se enumeran en la Tabla S3 y S4 de la tabla de archivos S1, particularmente KLK3 (PSA) potenciador funciona como control positivo, mientras que XBP-1 promotor funciona como el control negativo. Cada chip de ensayo se repitió tres veces biológicamente.
miARN transfección
En efectivo sobre-expresión de los genes miARN, imitan las moléculas precursoras miARN y control negativo (Ambion) se transfectaron en células LNCaP utilizando neón ™ transfección sistema (Invitrogen) a una concentración de 30 nM. Para la transfección en situación de hambre, las células LNCaP se pusieron en medio de hormonas despojado durante 3 días antes de la transfección.
proliferación celular /viabilidad Ensayo
Para probar la contribución de miARN a la proliferación celular, las células LNCaP CaP después de la transfección transitoria se sembraron en placa de 24 pocillos a una concentración de 15.000 células /pocillo. Después de 1, 2, 3, se añadió 4 días de la transfección, 80 ul de MTT (5 mg /ml de stock) a cada pocillo y se incubaron durante 3 h. Las células tratadas se lysised por DMSO y se midió la absorbancia a 450 nm. Cada transfección a cada día se repitió 3 veces.
Western Blot
Western blot se realizó como se describe anteriormente [14] utilizando anticuerpos contra AR (Millipore), PSAP (Santa Cruz) y actina ( Sigma). Para la extracción de proteína nuclear, las células LNCaP fueron lysised con Tampón A (10 mM HEPES pH 7,9, KCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, 0,1 mMEGTA, DTT 1 mM, PMSF 0,5 mM). Los núcleos se recogieron por centrifugación y lysised con Tampón C (20 mM HEPES pH 7,9, NaCl 400 mM, EDTA 1 mM, 1 mMEGTA, DTT 1 mM, PMSF 0,5 mM). lisado nuclear se recogió por centrifugación y se cuantifica.
ensayo de luciferasa
Un plásmido indicador que contiene el sitio de unión putativo miARN en la 3'-UTR del ARNm diana se clonó a partir del promotor pGL3 luciferasa vectorial. Los cebadores usados se proporcionan en la Tabla S6 de archivo S1. El plásmido se verificó mediante secuenciación de ADN. Para el ensayo de luciferasa, las células LNCaP (7,5 x 10
4 por pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante 2 días. Después las células se cotransfectaron con miRNA, pGL3-promotor de luciferasa vector y pRL-TK Renilla plásmido de luciferasa (Promega) usando X-tremeGENE siRNA reactivo de transfección (Roche). La actividad de luciferasa se midió a las 48 h después de la transfección por doble luciferase kit de ensayo de informador (Promega).
Resultados
La estrategia para la construcción de la red de señalización AR miARN mediada en este estudio se ilustra en la Fig . 1. Los resultados se presentan paso a paso de la siguiente manera.
Este es el resumen de todo el procedimiento para el análisis de datos de microarrays para la construcción de la red AR en este estudio. Pasos detallados se proporcionan en las secciones de metodología y de resultados.
Proyección miRNAs sensibles a andrógenos
Para identificar miRNAs AR-dirigida por un enfoque de ganancia de función, se realizó tiempo- por supuesto microarrays para observar simultáneamente expresiones miARN y mRNA en las células LNCaP dependientes de andrógenos bajo estimulación DHT en una serie de tiempo de 0 h, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 24 h y 48 h, respectivamente. El '0 h' funciona como el control que representa el estado antes de la estimulación celular DHT. células LNCaP se cultivaron en un medio de hormona-agotado durante 72 h antes de la estimulación DHT. Después de pre-proceso de los datos originales, había 16.172 ARNm y permanecieron 241 miRNAs. En primer lugar, se exhibió datos para encontrar 'gen sensible a los andrógenos' ( 'ARG): si un gen demuestra un cambio significativo en la expresión de un punto de tiempo en comparación con 0 h, se denomina' sensible a los andrógenos '. La expresión diferencial en comparación con 0 h se mide por 'DiffScore', que representa la importancia de la expresión diferencial. En consecuencia, los ARNm 5.203 y 137 miRNAs fueron sensibles a andrógenos. Cabe señalar que, siendo de andrógenos sensible no lo hace significa ser directa regulado por AR; En cambio, algunos genes pueden estar regulados por ciertos mediadores en las vías de AR. Nuestro principal objetivo es seleccionar los miRNAs directamente regulados por AR, que desempeñan un papel importante en la mediación de la red mediante la modulación de AR ARNm diana.
Entre los 137 miRNAs sensibles a andrógenos, 22 miRNAs están bien documentados en el CaP [11 ], [15], [16] [17]. En ella, el miR-101, miR-145, miR-34a, miR-182, miR-375, miR-181, miR-92b y miR-125a están regulados por la estimulación DHT. Se informó que estos miRNAs altamente sobreexpresado en el CP [11], [17], [18], [19]. miR-16, miR-126 *, miR-23b, miR-100, miR-222, miR-133a-1, miR-499 y miR-340 se ha reducido regulado, que están en consonancia con los informes anteriores [11], [15], [16].
Los ARNm sensibles a andrógenos encontrados en este estudio son muy coherentes con los informes anteriores. Hemos establecido con anterioridad una base de datos especificada denomina base de datos ARGDB [20], que se centró en AR genes regulados por la integración de las literaturas hasta el año 2009. Para los 5.203 ARNm sensibles a andrógenos encontrados en este estudio, el 80% llegó a los genes sensibles a andrógenos en la base de datos ARGDB . El cumplimiento implica la exactitud de nuestros resultados experimentales para la observación de las expresiones genoma dinámicos en células LNCaP bajo estimulación DHT. Interesante, algunos genes implicados en el procesamiento de miRNA se upregulated por los andrógenos (Figura S1 S1 en el archivo). Por ejemplo
Dicer
, una proteína de unión al ARN que procesa pre-miARN en miARN maduro, está regulada al alza. Esto es coherente con la regulación al alza ya se ha informado en el CaP [21].
DGCR8
, un socio de la RNasa III Drosha nuclear, que corta el tallo-bucle pri-miARN en el pre-miARN libre de flanqueo, también se regula positivamente de manera significativa.
Identificación de Tiempo discriminador para Early - y Tardío-respuesta
La expresión de genes de respuesta a la estimulación androgénica puede ocurrir en cualquier punto de tiempo después del tratamiento DHT; por lo tanto, que sólo depende de los andrógenos sensibles no puede dar más reflexión sobre la determinación de qué gen de respuesta es crítico. Especulamos que los genes con expresión cambio significativo que suceden en una fase anterior pueden jugar un papel más central en la mediación de señalización AR, y pueden tener una mejor oportunidad de ser el blanco directo de AR. Por lo tanto, con el fin de identificar los miRNAs críticos que son probablemente los objetivos de AR, clasificamos respuesta miARN en etapas tempranas y tardías en este estudio mediante la determinación de un discriminador de tiempo de
τ
, que marca el comienzo de la respuesta tardía. Se trazó el número de miRNAs expresados diferencialmente que abarcan el curso del tiempo. Como se muestra en la Fig. 2A,
τ =
6, que corresponde a la vez que se identifica el punto 8 h, lo que significa que para la expresión de miRNAs respuestas 'a andrógenos, [20 min, 8 h) es la primera etapa, mientras que [8 h, 48 h] es la última etapa.
Figura 2A. perfil curso temporal del número de miARN expresados diferencialmente. La línea discontinua se refiere a discriminador de tiempo para distinguir las etapas temprana y tardía respuesta. La Figura 2B. perfil de expresión de temprana y tardía respuesta a los estímulos miRNAs 'DHT. Expresión diferencial con relación a 0 h está representado por. separa respuesta miARN en etapas tempranas y tardías. miRNAs están agrupados en 4 grupos: a principios de upregulated (1), a finales upregulated (2), regulado por disminución temprana (3) y downregulated tarde (4). Figura 2C. diagrama de Venn para la distribución de número de miRNAs de respuesta temprana y de respuesta miRNAs finales. La parte roja indica la miRNAs andrógenos resonsive con respuesta ocurrieron únicamente en la primera etapa, la parte azul denota miRNAs con la respuesta exclusivamente en la fase tardía, y la parte púrpura denota miRNAs con la respuesta tanto en las etapas tempranas y tardías. Figura 2D. Previstos son el enriquecimiento en los genes miARN de respuesta temprana y tardía. ARE están en los ± 10 kb secuencias que flanquean el sitio 5'-inicio de pre-miRNAs.
Para evaluar la fiabilidad de discriminador de tiempo
τ
, se determinó el perfil de expresión diferencial de miRNAs ' y analizados se diferencia de enriquecimiento entre principios y finales de los miRNAs de respuesta. El perfil de la expresión diferencial miRNAs sensibles a andrógenos 'se observa utilizando como criterio no conservadora para ilustrar la expresión diferencial. En la Fig. 2B, el discriminador de tiempo "8 h 'distingue claramente las fases de respuesta temprana y tarde-. De acuerdo con ello, que agrupan miRNAs en 4 grupos: a principios de hasta reguladas, tarde hasta reguladas, temprano el regulado y finales de las reguladas (figura 2B como una demostración.). Algunos miRNAs sensibles a los andrógenos tienen expresiones diferenciales, tanto en las etapas tempranas y tardías, y otros sólo tienen expresiones diferenciales, ya sea en la fase temprana o tardía solo. Higo. 2C muestra la distribución de los primeros que responden 83 miRNAs (11 miRNAs en rojo únicamente tienen la respuesta temprana), que responden a finales de 126 miRNAs (54 miRNAs en azul únicamente tienen respuesta tardía), así como 72 miRNAs son la intersección (en púrpura). La figura es en forma de diagrama de Venn [22]. A continuación, se analizan son enriquecimientos para los miRNAs temprana y tardía respuesta. Es natural esperar que los genes regulados directamente por la AR (por ejemplo, los genes de respuesta temprana) tendrán más altos son el enriquecimiento. Las aguas arriba 10 kb y el río abajo 10 kb de 5'-sitio de inicio de la pre-miARN se examinaron para buscar sitios de unión a AR-(ARBSs). base de datos de Genomatix [23] se utilizó para detectar áreas, incluyendo receptor-putativo y validado de andrógenos (AR) y receptor- de glucocorticoides (GR) elementos de respuesta, como se muestra en la Tabla S1 S1 de Archivo. Putativa son números de miRNAs sensibles a andrógenos se ilustran en la Fig. 2D. Es evidente que son enriquecimientos para miRNAs principios que responden son significativamente más grandes que los de finales de respuesta (
p Hotel & lt; 0,01, suppl.1), lo que corrobora la racionalidad del discriminador de tiempo
τ
.
la identificación de candidatos miRNAs que la RA enfocamos principalmente en los
Para identificar miRNAs que son, probablemente, directamente regulados por AR, además de jugar un papel fundamental en la mediación de la red AR, hemos propuesto y se calculó una nueva estadística , la respuesta Score (RS) para cada miARN sensible a los andrógenos. La figura 3A muestra la distribución de miRNAs RS sensibles a andrógenos. miRNAs con valores de RS en el 10% se identifican como blancos primarios teóricamente AR. El umbral para la RS miARN es 22, por lo tanto, 15 miRNAs (8 y 7 reprimidos inducida) se identificaron teóricamente como candidato.
Figura 3A. RS distribución de miRNAs sensibles a andrógenos. números de miARN de acuerdo con diferentes RS se presentan los valores, la línea de puntos marca el umbral para la identificación de candidatos AR miRNAs objetivo primario. La Figura 3B. análisis de RT-PCR para AR identificado miRNAs candidatos objetivo. Doble cambio de las células LNCaP DHT-tratado a más de las muestras de control se presentan con la evaluación de la significación (en este estudio, *: p & lt; 0,05; **: p & lt; 0,01; ***: p & lt; 0,001). factor de cambio en las muestras de control se consideró como 1 para todos los análisis de RT-PCR en este estudio. Esta cifra es el análisis RT-PCR de miRNAs en 40 min de estimulación DHT. La Figura 3C. Diagrama esquemático de miR-133b, miR-19a, y la ubicación son de miR-27a en las regiones 5 'y 3'. Las flechas horizontales indican la aproximación es en los alrededores. Figura 3D. chip de ensayo de AR vinculante sobre el candidato objetivos de miR133b, miR19a, miR27a. 'IgG' sirve como control negativo para chip de ensayo.
Para seleccionar novela miRNAs con importancia biológica para la siguiente investigación profunda en curso, se utilizó GenMAPP para analizar las vías de influencia para cada candidato, en función de el enriquecimiento vía para los ARNm objetivo previsto, que eran también sensible a los andrógenos. En este estudio, los objetivos previsto miRNAs 'fueron proporcionados por la base de datos miRDB [24], cuyo genoma de toda predicción de genes miARN objetivo se llevó a cabo con una herramienta bioinformática desarrollada recientemente, MirTarget2 [25]. MirTarget2 algoritmo basado en máquinas de vectores soporte (SVMs) y formación de datos de microarrays, que mostró una mayor selectividad en la identificación de genes regulados negativamente en comparación con otros algoritmos. Al realizar GenMAPP, las vías con z≥1.96 fueron considerados como significativos. Entre los candidatos AR objetivo principal miRNAs identificados, miR-19a, miR-27a y miR-133b, se encontraron con enriquecimientos vía importante en los procesos celulares críticos (Tabla S2 S1 en el archivo). Estos 3 miRNAs sostenidos importantes sobre regulación a través de todo el curso del tiempo de acuerdo a los datos de microarrays, y validaron sus datos de expresión con el análisis de RT-PCR. Elegimos la muestra de microarrays a 40 min para el análisis de miARN RT-PCR desde los 3 miRNAs mostraron expresión cambio tan pronto como 40 min en el experimento de microarrays. El resultado de RT-PCR fue concordante con los datos de microarrays (Fig. 3B). En lo que sigue, se estudiaron los mecanismos de miR-19a, miR-27a y miR-133b en la mediación de AR señalización de CaP carcinogénesis.
Verificación de AR La unión a miR-19a, miR-27a y miR-133b
la inmunoprecipitación de cromatina (chIP) ensayos se llevó a cabo para verificar que el ARES predichas de los 3 seleccionados miRNAs unión a AR. Se utilizó la base de datos Genomatix [23] para detectar ARE en las aguas arriba y aguas abajo 15 kb de 5'-sitio de inicio de pre-miARN. ARE con 'Core Similitud = 1' se eligieron para la validación del chip de ensayo, que representan la mayor coincidencia entre la secuencia de ADN diana y las bases conservadas de ARE. ARE detectadas en las regiones aguas arriba y aguas abajo de miR-19a, miR-27a y miR-133b, respectivamente, se ilustran en la Fig. 3C. Sobre la base de los resultados del ensayo chip, se encontró que el tratamiento de 10 nM de DHT en células LNCaP durante 4 horas, dio lugar a una significativa AR-unión a la cromatina de ARE previstos en el miR-19a, miR-27a y miR-133b, en comparación con los controles (Fig. 3D). El análisis qPCR de promotor KLK3 (sirve como control positivo para la AR vinculante), y XBP-1 promotor (sirve como el control negativo para AR-unión) se muestra en la Figura S2 en S1 Archivo. Higo. 4A. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.