Extracto
técnicas de fenotipado universales basados en imágenes de fluorescencia que pueden discriminar entre los distintos estados de los sistemas biológicos tienen un gran potencial. Se aplicaron 557 compuestos de la biblioteca fluorescente de 60 líneas de células cancerosas humanas (NCI-60) del NCI para generar un fenotípica de fluorescencia sistemática de datos de perfiles. Por el análisis de la intensidad de fluorescencia cinética, que discriminados con éxito el origen órgano de todas las 60 líneas celulares
Visto:. Lee J-S, Kim YK, Kim HJ, Hajar S, Tan YL, Kang N-Y, et al. (2012) Identificación de la línea celular de cáncer Orígenes Usando la selección de Phenomic basado en imágenes de fluorescencia. PLoS ONE 7 (2): e32096. doi: 10.1371 /journal.pone.0032096
Editor: Nikos K. Karamanos, Universidad de Patras, Grecia
Recibido: 5 de Octubre, 2011; Aceptado: January 19, 2012; Publicado: 23 Febrero 2012
Copyright: © 2012 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una financiación habitual de la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación (a * STAR), Singapur Biomedical Research Council y a * STAR SSCC Grant (SSCC10 /024). Este trabajo también fue apoyado por el Programa de Convergencia Centro de Investigación a través del Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2010K001410). JSL es un receptor de T. J. Parque de las Ciencias de becas. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
un reto principal para la genómica funcional es identificar genotipos que están asociados con un fenotipo específico. Los recientes avances en la tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS) de perfiles de expresión génica y han impulsado mejoras significativas en el genotipado de alto rendimiento. [1], [2] Sin embargo, a diferencia de las plataformas de genotipado bien establecidos, no hay métodos cuantitativos estándar para fenotipificación todavía. [3] Los fenotipos se pueden definir a muchos niveles diferentes; por ejemplo, o las características bioquímicas, fisiológicas que se pueden medir a nivel celular, o el comportamiento o la historia clínica a un nivel organismo. [4] Cada medición fenotípica se ha utilizado para el estudio adicional sobre una base caso por caso. Por ejemplo, el comportamiento y el patrón de imagen cerebral han sido frecuentemente utilizado para el personaje phenomic en la neurociencia, [5] - [8] y CD (grupo de designación) fenotipos bioquímicos basados -marker son ampliamente utilizados para discriminar entre tipos de células en diversos campos. [9], [10] Sin embargo, todavía no hay parámetro phenomic universal que se puede aplicar a diversos formatos de detección. [11]
imaginado que una biblioteca sonda fluorescente podría tener un gran potencial para identificar un conjunto de parámetros phenomic universales debido a su lectura uniforme fenotípica (señal de fluorescencia), controles fáciles de dosis, alta sensibilidad a micro-ambientes, y la diversidad estructural a nivel molecular. Nuestro grupo ha desarrollado recientemente bibliotecas fluorescentes e informó de una serie de sondas de imagen en las células secretoras de glucagón, [12] las células de miotubos diferenciados, [13] y las células madre pluripotentes. [14] Incluso en caso de que las dianas intracelulares no están claramente definidos, la firma fenotípica podría ser utilizado para una variedad de aplicaciones. [15] que es más importante, dependiendo de las propiedades de la sonda fluorescente, alto contenido de información se puede extrae una única imagen de fluorescencia de. [16], [17] De acuerdo con ello, el perfil fenotipo fluorescente usando sondas sintéticas podría revelar diferencias sutiles en las características bioquímicas. En este trabajo, se presenta el estudio de perfiles phenomic celular basada en la intensidad de fluorescencia utilizando primero una biblioteca orientada a la diversidad de fluorescencia (Dofl) y líneas celulares de cáncer del NCI-60.
Para demostrar la escala phenomic de fluorescencia de imagen basada en metodología de detección, se eligieron 60 líneas celulares de cáncer humano (NCI-60) del Programa de Desarrollo Terapéutica del Instituto Nacional del cáncer. Se seleccionaron estas células basándose en la siguiente las dos razones. (I) es la más grande colección estándar de tipos de células cancerosas amplios. El conjunto NCI-60 contiene los cánceres de 9 orígenes diferentes, incluyendo leucemia, melanomas, renal, de mama, colon, pulmón, SNC, próstata y carcinomas de ovario. (Ii) rica información de antecedentes bioquímica de la colección está disponible para el público. Las características del conjunto NCI-60 se han perfilado en la genómica, [18], [19] proteómicos, [20] y el efecto del fármaco nivel, [21] - [23] y esos datos se pueden aplicar fácilmente a promover "ómicas "estudios. Mientras que los diversos enfoques de perfiles se han explorado ampliamente para caracterizar los NCI-60 líneas celulares, un fluorescente de perfiles sistemática basada en la sonda no se ha perseguido todavía.
Resultados y Discusión
Las sondas fluorescentes y de fluorescencia fenotipificación
Combinación de rosamine (RS) y las bibliotecas de fluoróforos BODIPY (BD) (240 rosamine [24] y 317 BODIPY [12] compuestos, compuestos 557 en total) se usaron para generar los datos de fenotipado de fluorescencia. Como se informó anteriormente, estos compuestos mostraron una buena permeabilidad celular, y la amplia absorbancia (λ
= abs 480~616 nm) y la emisión de fluorescencia (λ
em = 530~656 nm) oscila con una amplia diversidad estructural. Para maximizar la información de los ensayos basados en células, se utilizó una plataforma de cribado basado en la imagen de fluorescencia de células enteras, que proporcionaría características celulares integrados, denominados de selección de alto contenido. El perfilado a gran escala se realizó utilizando un sistema automatizado microscopio de fluorescencia (ImageXpress Micro, Molecular Devices, Inc.). NCI-60 células se sembraron en placas de 384 pocillos delgada de fondo en 70% de confluencia, y se añadieron 557 compuestos fluorescentes a diferentes pocillos a dos concentraciones finales de 250 nM y 500 nM. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron tanto en el FITC y TRITC los canales para cubrir la amplia gama de los espectros de las sondas. Fluorescente imágenes fueron tomadas a partir de dos sitios independientes de cada pocillo para 3 puntos de tiempo (1 hora, 24 horas y 48 horas), y se duplicaron todos los experimentos. En total, se recogieron 1,604,160 imágenes (557 sondas × 60 × 2 células cancerosas concentraciones × 2 × 2 canales sitios × 3 × 2 puntos de tiempo duplicados). A los datos de imagen de fluorescencia representativas de BD-46 se presenta en la Figura 1 y los detalles del diseño de la placa se describe en la Figura S1. A partir de estas imágenes de fluorescencia, muchos tipos diferentes de características, tales como la morfología, textura, o la intensidad podrían ser extraídos y utilizados como una firma fenotípica. [25] En particular, las intensidades de tinción y el patrón de localizaciones variaron en líneas de células individuales, a pesar de que todas las células se tiñeron con una cantidad idéntica de BD-46.
cuantitativa intensidad de fluorescencia de perfiles de NCI -60 líneas celulares
Entre los diversos parámetros posibles, nos centramos en la intensidad de fluorescencia de las células, ya que el método de procesamiento de imágenes era sencillo y los datos procesados era menos dependiente del algoritmo de análisis que otros. Para suprimir aún más el artefacto a partir de las variaciones de un lote a otro (esto es especialmente importante en este estudio debido al tiempo de adquisición de datos a largo más de 2 años), se decidió utilizar la fluorescencia cambio de intensidad veces sobre el tiempo (intensidad perfil cinético), en lugar del valor absoluto de la intensidad. En primer lugar, hemos medido los valores medios de la intensidad de fluorescencia de las células, y el patrón de intensidad para diferentes líneas de células se analizaron por su perfil cinético intensidad (doble cambio de los valores de intensidad en 48 h sobre 1 h, y los protocolos de tratamiento de datos sean se describe en los métodos experimentales). A continuación, se analizó la intensidad de fluorescencia cambio en el patrón general del NCI-60 conjunto de líneas celulares mediante análisis de mapa de calor y la agrupación jerárquica (Fig. 2). En general, pulmón, colon, y las células de cáncer de ovario fueron bien clasificados por la sencilla agrupamiento. Por otro lado, desde el punto de vista de la estructura química, compuestos fluorescentes que las acciones mismas clases de xantonas estructura de derivados (por ejemplo, RS-A, RS-E y RS-K de la serie) exhibieron patrón de respuesta similar en las líneas de células de un mismo origen del cáncer (Fig. S2).
la intensidad de fluorescencia se pliegan los cambios se agruparon para los 557 sondas fluorescentes (eje x) a través de las líneas celulares de cáncer de 60 (eje y). Pliegue = (intensidad de fluorescencia a 48 h de incubación) /(intensidad de fluorescencia a 1 h de incubación).
Curiosamente, se observó una notable firma para la serie RS-K de compuestos. Estos compuestos mostraron inicialmente baja intensidad de fluorescencia, pero después de 24 h, su fluorescencia se incrementó dramáticamente sólo en conjunto específico de líneas celulares (HCT-116, HT29, COLO205, HCC-2998, EKVX, HOP-62, NCI-H460, NCI -H322M, y NCI-H23). Por otra parte, los perfiles de respuesta de fluorescencia fueron altamente correlacionados con el tipo de estructura de la sonda y el cáncer de células (Fig. S2). Por ejemplo, una serie de RS-K compuestos (K1, K3, K4, K14, K15, K16, y K17) mostró fluorescencia de encendido efectos en pulmón y colon células cancerosas (Fig. S3), y compuestos RS-E ( E1, E3, E7 y E29) mostró el encendido respuestas en las células de cáncer de pulmón (fig. S4). Aunque la respuesta de fluorescencia de RS-K y RS-E series aumentó para aquellas células cancerosas específicas, cada uno de los compuestos mostraron sutil pero distinto firma. En particular, compuestos de la serie RS-K mostraron encendido efectos hacia amplias gamas de células de cáncer de pulmón, pero difiere patrón de respuesta en función de la estructura del anillo 9-fenilo de rosamine (Fig. S3). También es destacable señalar algunas de estas sondas distinguen las líneas celulares específicas de origen del cáncer idénticos. RS-E1, E3 y RS-RS-E7 compuestos que se volvieron selectivamente en sólo en células ACHN entre las células de cáncer renal (Fig. S5). Por otra parte, exhibieron respuesta específica a las células SW60, pero no para el resto de 6 células de cáncer de colon.
Otra línea celular se observó perfil específico con el compuesto RS-C3. RS-C3 indujo una fuerte fluorescencia de encendido efecto sólo en las células KM12, una línea celular humana de cáncer de colon, entre 60 líneas de células (Fig. 3). En comparación con la intensidad de fluorescencia medio en otras células NCI-60, RS-C3 exhibió una excepcional intensidad 5,64 veces mayor en las células KM12. Para explorar la característica funcional de las células KM122 que inducen fenotipo fluorescencia selectiva, se analizaron los datos de expresión de ARNm de las líneas celulares NCI-60. fueron seleccionados, y se analizaron sus datos de anotación de genes, sobre la base de los datos de expresión de ARNm de GSE5846, genes expresados diferencialmente (DEGs) que hasta reguladas en las células KM12 (1,5 log
2 (doble) & gt). Los análisis de KEGG vía y la ontología de genes identificados cinco vías que presentan diferencias significativas (
P
valor & lt; 0,001) entre las células KM12 y todas las otras células NCI60, como la comunicación celular, el linaje de células hematopoyéticas, ciclo de la urea y el metabolismo de grupos amino y vía de señalización de p53 (Tabla S3, S4). Con estas combinaciones de expresión DEGs, es posible discriminar las células KM12 de otras líneas celulares NCI60, y regulada up-perfil de estos genes son la firma funcional única de las células KM12. Desde fenotipo de fluorescencia de RS-C3 muestra la información recogida de este tipo de perfil DEGs una única imagen de fluorescencia dentro como cambios de intensidad, esta sonda tiene potencial para detectar la firma funcional similar de otras líneas celulares. Si bien no está claro en este momento qué tipo de biomolécula endógena están interactuando directamente con esta sonda, que podría ser utilizado para identificar visualmente una línea celular de cáncer de colon (KM12) entre las líneas celulares de cáncer de 60 después de 24 h de preincubación.
(a) gráfico de barras de cambio veces cinética (b) las imágenes de fluorescencia de líneas celulares de cáncer 60.
Discriminación de cáncer de origen celular
Para el análisis cuantitativo patrón, la intensidad perfiles cinéticos se examinaron adicionalmente utilizando análisis discriminante lineal (LDA) para clasificar los tipos de células de cáncer. LDA es un método de clasificación de uso común, especialmente para datos de alta dimensión para la reducción de la dimensionalidad. Mediante la aplicación de LDA a los perfiles cinéticos, fue posible para evaluar las respuestas de cambio veces de cada sonda química para la identificación óptima de células de cáncer, y generar la función de puntuación para predecir la identidad de las células incluso cada sonda no muestra respuesta específica a la línea de células individuales. El conjunto de sonda fluorescente mínimo que podría discriminar 9 tipos de células de cáncer fue elegido por un algoritmo de selección de variables paso a paso hacia adelante, y 37 respondieron diferencialmente sondas fluorescentes fueron seleccionados (Fig. S6). Sorprendentemente, las 60 células cancerosas se agruparon con éxito en un gráfico de las puntuaciones LDA (Fig. 4), y el 98% fueron correctamente asignados a cada uno de los grupos originales utilizando
jackknifed
validación cruzada (Tabla S1). LDA puntajes son valores unitarios arbitrarias que representan la identidad de predicción máximo, y nuestro resultado mostró la primera y la segunda más altas puntuaciones LDA fueron suficientes para discriminar las líneas 60 celulares en términos de origen del cáncer (Tabla S2). Vale la pena señalar que la clasificación usando una combinación de ambas sondas BD y RS fue mucho más éxito como se determina por validación cruzada que cualquier combinación de cualquiera de RS o sondas BD solo (Tabla 1). Este resultado implica que la diversidad química de las sondas fluorescentes utilizados para generar el perfil de intensidad afectó significativamente los resultados de la clasificación de tipos de cáncer. Otro aspecto interesante de 37 seleccionados sondas establecidas es que ninguna de estas sondas son selectivos a tipos de células cancerosas o individuales. Ellos mostraron patrones de respuesta únicos para múltiples líneas celulares, y la célula diana no siempre fue limitado dentro de los tipos de cáncer idénticos. Creemos que este tipo de respuestas selectivas originados por la firma bioquímica específica o entornos integrados intactas de los tipos de células diana.
x, y el eje Y representa el más alto y 2
ª más altos puntajes por LDA función de puntuación de células (Tabla S2). Las líneas celulares de cáncer de 60 fueron etiquetados de acuerdo con el origen del tipo de cáncer; SNC: rojo, de colon: púrpura, leucemia: naranja, pulmón verde, el melanoma: rosa, pecho: verde oscuro, de próstata: rosa pálido, de ovario: gris, y renal:. Oliva
Conclusión
En resumen, se presenta la primera fenotipo de perfiles basados en la intensidad de fluorescencia de 60 líneas celulares de cáncer humano (NCI-60) utilizando sondas fluorescentes sintéticas. La diversidad estructural de las sondas fluorescentes parece ser un factor crítico para la generación de fenotipos distintos, y nuestros resultados mostraron que 60 de cáncer de líneas celulares están discriminados con éxito en términos de orígenes de células 9 de cáncer. El más énfasis en la investigación del cáncer se ha centrado en la patogénesis y la metástasis, y la investigación metástasis se ha estancado debido a la falta de la técnica de seguimiento fiable que podría visualizar un origen específico de células cancerosas. compuestos de fluorescencia que prueban origen específico de células de cáncer no sólo podría proporcionar una nueva ventana para la investigación de metástasis, sino también ser utilizado para el diagnóstico de cáncer y la supervisión progresión. Aunque este estudio tiene limitaciones en que se realiza la identificación del origen de las células cancerosas usando solamente
in vitro
líneas celulares de cáncer, nuestros resultados proporcionan un indicio de que las combinaciones de sondas fluorescentes podrían distinguir las diferencias complejas y sutiles de las células cancerosas. Basado en el patrón de respuesta, se logró la mejor resultado de identificación cuando se utilizaron más andamios fluoróforo, y los perfiles de intensidad de fluorescencia se altamente correlacionado con la estructura química de las sondas fluorescentes y tipos de cáncer. Estos resultados demuestran la utilidad práctica del enfoque de fluorescencia biblioteca orientada a la diversidad en el fenotipo celular universal.
Métodos
Preparación de la biblioteca de fluorescencia orientada a la diversidad
Los compuestos de la biblioteca rosamine y BODIPY fueron preparados de acuerdo con protocolos previamente reportados, y se ha informado de las estructuras compuestas y datos de caracterización. [12], [24], [26] Todos los compuestos fueron almacenadas a -20 ° C en placas microtilter en forma sólida, y se realizaron soluciones madre disolviendo los compuestos en DMSO antes de la selección.
NCI 60 cáncer de cultivo celular
los NCI-60 líneas celulares se obtuvieron del Instituto Nacional del cáncer. Todas las líneas celulares NCI-60 se cultivaron como se describe en el manual del distribuidor. Brevemente, las células fueron cultivadas en un alto de glucosa de Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) suplementado con 10% de FBS y 1% de antibióticos.
intensidad de fluorescencia cuantitativa análisis
Los valores medios de las intensidades de fluorescencia eran calculado utilizando Matlab 7.9.0 (R2009b). En nuestra base de datos, 4 imágenes representadas cada condición experimental (2 × 2 imágenes duplicadas /pocillo). Se combinaron las 4 imágenes con el
Función de gato Hoteles en Matlab para optimizar el procesamiento de IO. Para minimizar el efecto de fondo, sólo se utilizaron los valores de intensidad de fluorescencia para el área que fueron positivos para el umbral de Otsu para calcular el valor medio. El
graythresh
y
im2bw
funciones en el módulo de procesamiento de imágenes Matlab se utilizaron para calcular el umbral de Otsu y la selección área de la celda. Todos los trabajos por lotes de procesamiento de imágenes cuantitativas se calcularon utilizando un cluster de 16 nodos de PC durante 3 días.
El análisis discriminante
análisis discriminante lineal (LDA) se realizó utilizando los valores de cambio veces de la intensidad de fluorescencia entre 48 horas y 1 hora de incubación puntos. selección de la sonda fue procesado por el delantero-escalonado algorithum selección de variables en SYSTAT (versión 13).
NCI-60 la expresión génica y análisis de vías
Los patrones de expresión de ARNm para el NCI-60 conjunto de células líneas fueron descargados de la base de datos NCBI Gene Expression omnibus (GEO). Los datos fueron analizados utilizando GSE5846 GenePlex v3.0 DEG hallazgo y los módulos de análisis de vías (ISTECH, Inc.).
Información de apoyo
Figura S1.
Esquemas de formato de ensayo NCI-60. Utilizamos placa de 384 pocillos de imágenes fluorescentes de alto rendimiento. 60 células se dividieron en 13 subconjuntos (cada conjunto contiene menos de 5 líneas celulares), y 2 sondas fluorescentes se ponen a prueba con cada uno de los subconjuntos en una placa de pocillos individuales. Desde los medios de cultivo se evaporan rápidamente en los pozos de borde, primeras y las dos últimas columnas no fueron utilizados para el ensayo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0032096.s001 gratis (TIF)
figura S2.
SAR de sondas fluorescentes en el perfil fenotipo. agrupamiento jerárquico de fenotipo respuesta fluorescente revela relación estructural de la sonda fluorescente. La intensidad de fluorescencia cambia el patrón de 557 sondas fluorescentes (eje x) frente a 60 células cancerosas (eje y) fueron agrupados. Doblar = (intensidad de fluorescencia después de 48 h de incubación) /(intensidad de fluorescencia después de 1 h de incubación)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0032096.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
fluorescencia perfil de intensidad de serie RS-K. (A) el perfil de respuesta de fluorescencia de RS-K15 en las células NCI60 y las imágenes de fluorescencia de líneas celulares de cáncer de pulmón. imágenes primera y segunda fila fueron tomadas después de 1 hy 24 h después del tratamiento de la sonda, respectivamente. Se muestran los 4 imágenes para cada condición experimental. (B) Patrón de gráfico de barras de intensidad de fluorescencia RS-K serie hacia la línea celular de cáncer de 60
doi:. 10.1371 /journal.pone.0032096.s003 gratis (TIF)
figura S4.
fluorescencia perfil de intensidad de serie RS-E.
doi: 10.1371 /journal.pone.0032096.s004 gratis (TIF)
Figura S5.
línea celular respuesta específica de RS-E compuestos de la serie entre el origen del cáncer renal y de colon. La intensidad de fluorescencia gráfico de barras de RS-E1, E3-RS y RS-E7 compuestos para las células del cáncer de (a) colon y (b) origen renal
doi: 10.1371. /Journal.pone.0032096.s005
(TIF)
Figura S6.
Estructuras de 37 sondas de fluorescencia seleccionados de LDA. Las sondas se choosen basado en el algoritmo de selección de variables hacia adelante automática paso a paso con alfa-a-escriba: 0.150 y alfa-to-remove:. 0.150 criterios utilizando SYSTAT v13
doi: 10.1371 /journal.pone.0032096.s006
(TIF)
Tabla S1.
jackknifed validación cruzada
matriz para tres conjuntos de sondas fluorescentes.
doi: 10.1371 /journal.pone.0032096.s007 gratis (XLS)
Tabla S2.
función de puntuación de LDA y el coeficiente de sondas fluorescentes seleccionados.
doi: 10.1371 /journal.pone.0032096.s008 gratis (XLS) sobre Table S3.
KEGG vías seleccionadas sobre la base de DEGs de KM12.
P
-valores se calcularon por
prueba exacta de Fisher
doi:. 10.1371 /journal.pone.0032096.s009 gratis (XLS) sobre Table S4.
Top 20 procesos biológicos de los genes ontología anotación de DEGs en células KM12
doi: 10.1371. /journal.pone.0032096.s010 gratis (XLS)
Reconocimientos
nos gustaría dar las gracias al Instituto Coreano de Ciencia y Tecnología para el análisis cuantitativo de imágenes usando clúster PC.