Resumen
Los perros con cáncer de origen natural representan un importante modelo animal grande para el desarrollo de fármacos y pruebas de nuevas inmunoterapias. Sin embargo, inmunofenotipos mal definidos de leucocitos caninos han limitado el estudio de la inmunología tumoral en los perros. La acumulación de células supresoras mieloides derivados (MDSCs) es conocido por ser un mecanismo clave de la supresión inmune en ratones portadores de tumor y en pacientes humanos. Hemos tratado de identificar MDSCs en la sangre de perros con cáncer. células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) a partir de perros con cáncer en estadio avanzado o temprano y de controles sanos de la misma edad se analizaron por citometría de flujo y microscopía. función supresora se puso a prueba en la proliferación celular y la elaboración de citoquinas T ensayos. Semi-cuantitativos de RT-PCR se utilizó para identificar los posibles mecanismos responsables de la inmunosupresión. PBMCs de perros con cáncer avanzado o metastásico mostraron un porcentaje significativamente mayor de CD11b
+ CD14
-MHCII
- células en comparación con los perros diagnosticados con tumores en etapa temprana no metastásicos y perros sanos. Estos CD11b
+ CD14
-MHCII
- células constituyen una subpoblación de granulocitos activados que co-purificar con PBMC, la morfología de granulocitos polimorfonucleares pantalla, y demuestran una potente capacidad para suprimir la proliferación e IFN-γ producción en T células de donantes normales y portadores de tumor. Además, estas células expresan factores supresores distintivos de MDSC humano incluyendo ARG1, iNOS2, TGF-β y IL-10. En resumen nuestros datos demuestran que MDSCs se acumulan en la sangre de los perros con cáncer avanzado y se pueden medir utilizando este inmunofenotipo marcador de tres, lo que permite estudios prospectivos que pueden monitorear MDSC carga
Visto:. Goulart MR, Pluhar GE , Ohlfest JR (2012) identificación de células supresoras mieloide derivados en perros con cáncer de origen natural. PLoS ONE 7 (3): e33274. doi: 10.1371 /journal.pone.0033274
Editor: Sophia N. Karagiannis, el Kings College de Londres, Reino Unido
Recibido: 28 Octubre, 2011; Aceptado: 10 Febrero 2012; Publicado: 13 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Goulart et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas al Dr. Ohlfest de los Institutos nacionales de Salud (NIH R21-NS055738), y la Sociedad Americana del cáncer (RSG-09-189-01-LIB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es la principal causa de muerte en los perros adultos en los Estados Unidos, Australia, Japón y Europa y es considerada la principal preocupación de atención médica de los dueños de mascotas. Aproximadamente cuatro millones de perros son diagnosticados con cáncer cada año en los Estados Unidos [1]. Naturalmente se producen lesiones malignas en los perros comparten muchas características con los cánceres humanos, incluyendo la biología tumoral similares, la genética, las tasas de incidencia, el aspecto histológico, y la respuesta a los tratamientos convencionales (revisado en [2]). Los tumores en perros progresan relativamente más rápido que la misma enfermedad en los seres humanos, permitiendo que las cuestiones relacionadas con la eficacia del tratamiento (progresión y la supervivencia) se aborden con mayor rapidez en los perros. Una ventaja importante del modelo de perro es la capacidad de probar terapias experimentales en dosis escala humanos en el contexto de la enfermedad mínima residual, que es difícil de hacer de una manera significativa en pequeños roedores que tienen relativamente rápida cinética de crecimiento del tumor. Además, debido a que el estándar de tratamiento para la mayoría de los tumores caninos se estableció muy poco, hay mucha más flexibilidad en el diseño del estudio en comparación con los ensayos clínicos en humanos. En conjunto, estas características hacen que el perro una excelente plataforma para la medicina traslacional.
Los perros con cáncer están convirtiendo rápidamente en una importante herramienta utilizada en el desarrollo de fármacos. Uno de los mejores ejemplos de esto es el reciente desarrollo paralelo de SU11654, un inhibidor de objetivos múltiples tirosina quinasa, y malato de sunitinib (SU11248). Ambos fármacos son potentes inhibidores de la PDGFR, VEGFR, KIT, y FLT3. Los estudios en perros con varios tumores sólidos revelaron que la concentración plasmática de SU11654, el estado mutacional de KIT, y la inhibición de la fosforilación de KIT eran fuertemente predictivo de eficacia clínica. parámetros óptimos de dosificación y toxicidad se establecieron en los perros también. Estos estudios pioneros facilitaron en gran medida el desarrollo de toda esta clase de medicamentos, particularmente con la aprobación del malato de sunitinib por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos para el tratamiento del carcinoma de células renales (RCC) y los tumores de células estromales gastrointestinales, que a menudo contienen KIT similares mutaciones [3]. Más tarde se reconoció que sunitinib reduce notablemente MDSCs y restaura la función de las células T en pacientes con CCR humanos [4], una observación que no se podría haber hecho en los perros en el momento debido a los reactivos limitados caninos y los marcadores de mal definidos para los leucocitos caninos. Nosotros, y otros, probando nuevas terapias basadas en la inmunidad en perros con diversos tumores malignos, pero la vigilancia inmune en estos estudios ha sido confundida por el mismo problema. Para poner el campo en perspectiva, un inmunofenotipo superficie de las células asesinas naturales caninos no se ha definido, los alelos MHC son poco conocidos, y muchos de los marcadores utilizados se basan en anticuerpos de reacción cruzada con lo que la especificidad debe ser probado empíricamente. Es crucial que los nuevos reactivos se desarrollan y que se determinan los inmunofenotipos de los principales subconjuntos de leucocitos caninos. Por el que este fundamento básico que permitirá una visión única a obtener como nuevos fármacos de moléculas pequeñas e inmunoterapias se ponen a prueba en perros como un preludio a los ensayos en humanos.
La acumulación de MDSCs en ratones y seres humanos portadores de tumores de cáncer que se conoce ser un mecanismo clave de escape de tumor de la vigilancia inmune [5], [6], [7]. MDSCs comprenden una población fenotípicamente heterogénea de células mieloides en las primeras etapas de diferenciación que se expanden en el cáncer y muchas otras condiciones patológicas, y tienen una potente capacidad para suprimir la función de las células T, especialmente la proliferación celular y de citoquinas efectoras de producción T [6], [8] . MDSCs puede dividirse en subtipos monocíticas y granulocítica. Una fuente de controversia en este campo es que la heterogeneidad MDSC ha hecho comparaciones entre pacientes con cáncer y modelos de tumores murinos desafiante (véase la referencia [9] para una excelente perspectiva). Los mecanismos moleculares por los cuales MDSCs inhiben la función de las células T están bajo investigación. Los estudios han implicado a la sobre regulación de la arginasa 1 (ARG1), inducible de la óxido nítrico sintasa (iNOS2) y especies reactivas de oxígeno (ROS) como factores importantes para la supresión inmune mediada por MDSC [8], [10], [11]. ARG1 puede afectar profundamente la función de células T en el sitio del tumor por el agotamiento de L-arginina, la activación de la respuesta del hambre de aminoácidos y la apoptosis en los linfocitos [7]. Otro mecanismo de la supresión inmune es la nitración de quimioquinas, que embota efector infiltración de células T en el sitio del tumor [12]. Por otra parte, la expansión MDSC se asocia con la regulación a la baja de la L-selectina en las células
+ T CD4 [13]
+ y CD8. Esto reduce el tráfico de células T en los órganos linfoides secundarios donde las células T reactivas al tumor pueden ser cebados [13]. Debido a la capacidad de MDSCs regular a la baja la respuesta inmune contra los tumores en ratones y en seres humanos, la hipótesis de que estas células también jugar un papel importante en la supresión inmune inducida por tumor en perros con cáncer. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue identificar marcadores de superficie que caracterizan la existencia de MDSCs en perros.
Materiales y Métodos
Población de estudio y recogida de muestras
La descripción de todos los perros en este estudio se resumen en las Tablas 1 y 2, con más detalle suministrado en las Tablas S1 y S2.
Tabla S3 es un resumen de las muestras analizadas en cada figura. Los datos clínicos se obtuvieron de los registros médicos. los perros de control se determinó que eran sana basada en el examen físico, exámenes y observaciones propietario de conteo sanguíneo completo. Para los perros con cáncer, el diagnóstico y estadificación del tumor se basa en exámenes físicos completos, histopatología de la biopsia del tumor, análisis de sangre y pruebas de imagen especializados, tales como las pruebas CT, ultrasonido o radiografías, para evaluar la localización y tamaño del tumor, así como la presencia de la enfermedad metastásica. Los perros con masas grandes, necróticas o múltiples, destrucción ósea lítica o grave (osteosarcoma) o presencia de metástasis, se colocaron en el grupo de avanzada de la etapa /metastásico. Animales que presentan pequeñas masas o sin nódulos metastásicos se colocaron en el grupo no metastásico etapa temprana. Tablas S1 y S2 también enumeran específicamente acerca de cualquier tratamiento que los perros con cáncer habían recibido antes o en el momento de la extracción de sangre para este estudio.
Las muestras de sangre tanto de cáncer y los perros de control sanos fueron obtenidos específicamente para este estudio . Las muestras se recogieron en tubos heparinizados por la práctica de la oncología y Servicios comunitarios del Centro Médico Veterinaria de la Universidad de Minnesota según las directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo. Las muestras fueron extraídas después de que los propietarios firmaron el formulario de consentimiento del cliente. El Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) revisó y aprobó el estudio titulado como "El inmunofenotipo por citometría de flujo de células de sangre periférica en perros" a través de revisión miembro designado con el número de código 0912A75493. A menos que se indique expresamente lo contrario, las células se analizaron para este manuscrito co-purificadas con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de perros con cáncer o controles sanos de la misma edad que fueron aislados utilizando Ficoll (Sigma) centrifugación en gradiente como sigue. sangre periférica heparinizada se diluyó 1:03 con PBS estéril (Invitrogen) y en capas sobre Ficoll-Histopaque (Sigma). Las muestras se centrifugaron a 400 x g durante 30 min. Las PBMCs recogidas en la interfaz se transfirieron a un tubo nuevo, se lavaron dos veces con PBS, y se resuspendieron con una solución de congelación que consiste en 90% de suero bovino fetal (Invitrogen) 10% dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma) y después se congelaron a -80 ° DO. Por último, las PBMC se descongelaron durante 2 minutos en un baño de agua a 37 ° antes de la tinción y análisis. Para el análisis de muestras frescas, PBMCs se aislaron como anteriormente, se resuspendieron en tampón FACS, se tiñeron con anticuerpos y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo o FACS como se indica.
análisis citométrico de flujo
muestras de PBMC fueron aislados a partir de sangre fresco o descongelado y resuspendido en tampón FACS. La unión de anticuerpo no específica fue bloqueada por el tratamiento previo de las células con 10 mg /ml canino gamma-globulina (Jackson Immunoresearch) durante 20 min a temperatura ambiente. Las células se marcaron primero usando tinción indirecta con 0,1 g de conjugado anti-ratón perro anticuerpo CD11b (CA16.3E10 clon, AbD Serotec) o control de isotipo IgG1 (ABD Serotec) y 0,5 g de PE de cabra conjugado con F (ab ') 2 contra -mouse IgG (Abcam) anticuerpo secundario a 4 ° C durante 30 min en una habitación oscura. Después de la tinción indirecta, las células se lavaron dos veces y se tiñeron con 0,3 mg de FITC-conjugado de rata anti-perro MHCII (YKIX334.2 clon, AbD Serotec) y 0,15 g de la reacción cruzada, Alexa Fluor 647 de ratón conjugado con CD14 anti-humano anticuerpo (clon TÜK4, AbD Serotec) o isotipos controles en 4 ° C durante 30 min en una habitación oscura según el protocolo del fabricante. células de anticuerpo marcado se lavaron dos veces y se resuspendieron en tampón FACS. Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con 7-amino-actinomicina D (7AAD, concentración final de 1 mg /ml; Calbiochem) y luego se analizaron en un Becton Dickinson Canto tres láser citómetro de flujo. Los datos fueron analizados con el software FlowJo (Árbol de la estrella). puertas de análisis se establecen en función de la población negativa 7AAD. El porcentaje de MDSCs se calculó basándose en el porcentaje de CD11b
+ CD14
-MHCII
- células dentro de la población total en vivo PBMC. En un experimento (Figura S1), anti-ratón conjugado con PE CD11b (clon M1 /70 eBioscience) y anti-ratón conjugado con APC-Gr-1 (clon RB6-8C5 eBioscience) anticuerpos también se utilizaron para verificar la reactividad cruzada con el perro células.
aislamiento de MDSCs, PMNs y células T
para los ensayos funcionales, RT-PCR y análisis de la morfología celular, muestras de sangre fresca de un perro portador de un tumor se utilizaron para el aislamiento de CD11b
+ CD14
-MHCII
- o CD11b
+ CD14
+ MHCII
- células, tal como se indica, utilizando un clasificador celular BD FACSAria. Para el aislamiento de las células T, las PBMC se aislaron como se ha descrito anteriormente a partir de muestras de sangre fresca de perros sanos y se tiñó con 0,3 g de conjugado con FITC de ratón anti-CD3 perro (CA17.2A12 clon, AbD Serotec), 0,15 g de azul del Pacífico ratón conjugado anti-perro CD4 (clon YKIX302.9, AbD Serotec) y 0,15 g de Alexa700-ratón conjugado con anti-CD8 perro (YCATE55.9 clon, AbD Serotec) anticuerpos. Los leucocitos polimorfonucleares (PMN) se purificaron a partir del sedimento celular de un gradiente de Ficoll de muestras de sangre de perros sanos, después de la eliminación de la PBMCs (en la parte superior de gradiente) y los eritrocitos por tampón de lisis RBC (eBioscience).
Ex Vivo
proliferación
Análisis de la actividad inhibidora de MDSC sobre la proliferación de células T se midió por
3H-timidina en el ADN. Brevemente, PBMCs de los perros indicados se sembraron en placas de fondo en U de 96 pocillos (5 x 10
4cells /pocillo) en medio que consistía en RPMI 1640 que contiene L-arginina (150 mM) (Invitrogen) suplementado con penicilina /estreptomicina (Invitrogen) y 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (Invitrogen) a 37 ° C, en una CO 5%
2 incubadora. CD11b
+ CD14
-MHCII
- o CD11b
+ CD14
+ MHCII
- células de un perro con cáncer se clasifican y se añaden al cáncer (autólogo) o de PBMC de respuesta sanos como se indica. Concanavalina A (5 g /ml) (Sigma) y recombinante humano IL-2 (10 UI /ml) (R & amp; D Systems) se usa para estimular la proliferación de células T. PBMCs no estimuladas se utilizaron como control negativo. PBMCs o PMN se co-cultivaron con PBMC saludables para controlar el efecto de la simple adición de células adicionales para el ensayo de supresión como se indica. Las placas se cultivaron durante 72 h, luego pulsadas con 1 Ci de
3H-timidina (Amersham Pharmacia Biotech) durante 18 horas a 37 ° C. Las células se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio (Perkin Elmer), se lavaron, se secaron, y se contaron. Las respuestas proliferativas se midieron por
3H-timidina en el ADN utilizando una matriz de 96 directa Beta contador (Packard). Todos los experimentos se realizaron por triplicado
análisis
IFN-
aisladas en FACS
CD11b
+ CD14
-MHCII
-. Células de un cáncer de perro fueron co-cultivadas con PBMCs aisladas de un perro sano usando el mismo método que el ensayo de proliferación. Después de 72 horas de incubación se recogieron los sobrenadantes de cultivo de células y se midieron utilizando un canino IFN-gamma kit Quantikine ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R & amp; D Systems). Las muestras fueron analizadas por colorimetría, por triplicado, utilizando un lector de microplacas Synergy2 (Biotek) y se analizaron con la colección de microplacas de datos y software de análisis de Gen5 (Biotek).
Cytospin
FACS aislada-CD11b
+ CD14
-MHCII
- células fueron teñidas utilizando una tinción de Giemsa modificada (diff-Quick, Astral Diagnóstico Inc) para la evaluación de la morfología celular y observó usando un microscopio DME (Leica) a 63 × ampliación de potencia. Imágenes fueron adquiridas con una cámara EC3 (Leica).
La extracción de RNA y RT-PCR
ARN fue extraído de aislados FACS-CD11b
+ CD14
-MHCII
- células o PMNs perro sano, utilizando un RNAeasy más Mini kit (QIAGEN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. las concentraciones de ARN se evaluaron usando un espectrofotómetro ND (100) (Nanodrop). Para detectar la expresión de las enzimas ARG1 y iNOS2, cebadores específicos del gen se diseñaron basándose en la secuencia de ARG1 canina y iNOS2; primer secuencias de limpieza de genes fueron diseñados a partir de genes β-actina canino utilizando Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Para la detección de las citocinas IL-10 y TGF-β, secuencias de cebadores de IL-10 y TGF-β se obtuvieron de fuentes publicadas [14]. Se utilizó el algoritmo BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para asegurar la especificidad de cebadores para el gen diana. La primera hebra de síntesis de ADNc se realizó utilizando un kit QuantiTect transcripción inversa (QIAGEN). La reacción de PCR de dos etapas se llevó a cabo en un volumen de 12,5 l que contiene 2 × SYBR mezcla maestra verde (Quanta Biosciences), 0.675U GoTaq polimerasa, 2 nM MgCl
2 (Promega), mM dNTPs 0,2 (Stratagene), 0,2 mM de cada par de cebadores y 50 ng de molde de ADNc. Las condiciones de reacción consistieron en desnaturalización inicial a 94 ° C durante 2 min, y luego ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, hibridación a 60 ° C durante 45 s, alargamiento a 72 ° C durante 45 s y elongación final a 72 ° C durante 5 minutos en un termociclador (Bio-rad) DNA Engine. La temperatura de hibridación óptima para cada par de cebadores se estableció antes del estudio (ver secuencias de los cebadores de la Tabla S4). Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa al 2% que contiene bromuro de 0,5 l /ml de etidio y la imagen debajo de 590 nm de luz ultravioleta en una estación de la imagen de Eagle Eye II (Stratagene). reacciones de control negativo se realizaron utilizando ARN que no fue sometido a transcripción inversa PCR.
Análisis estadístico
Las diferencias entre los dos grupos fueron analizados utilizando no pareada, dos colas de Student
prueba de la t
. Todas las pruebas se realizaron con el software Prisma 4 (GraphPad Software, Inc). los valores & lt P; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Los perros con cáncer avanzado tienen niveles elevados de granulocítica CD11b
+ CD14
-MHCII
- células. que co-purificar con PBMCs
periféricos muestras de sangre de 45 perros diagnosticados con cáncer y 18 perros control sanos se recogieron (Tablas 1 y 2). Todos los perros con cáncer sometidos a la clasificación clínica de la enfermedad mediante la realización de exámenes físicos completos, análisis de sangre, tratamiento de imágenes para evaluar la localización del tumor y el tamaño y la metástasis, y el diagnóstico histopatológico hecho de aspirado de diagnóstico o biopsia del tumor. Entre los 45 perros diagnosticados con cáncer, 30 perros fueron clasificados como de haber avanzado o enfermedad metastásica y 15 perros fueron clasificados como enfermedad de grado etapa temprana /no metastásico o baja basado en la estadificación clínica. Cada grupo se subdividió adicionalmente de acuerdo con el diagnóstico histológico en sarcomas, carcinomas o tumores de mastocitos (que se detallan en las Tablas S1 y S2). Los porcentajes de MDSCs putativos en perros con cáncer y perros sanos se evaluaron por citometría de flujo. PBMCs de perros con cáncer avanzado o metastásico mostraron un marcado aumento en el CD11b
+ CD14
-MHCII
- fracción de las células, lo que representó la mayor parte de las células en la puerta de células vivas, en comparación con los perros diagnosticado con las primeras etapas de los tumores no metastásicos o controles de perros sanos (fig. 1A). Este subconjunto de células mostraron una morfología granulocítica polimorfonucleares en las fases heterogéneas de desarrollo (Fig. 1B), que se asemeja a un subconjunto de granulocítica MDSCs identificados en ratones [15] y los seres humanos [16].
PBMCs de perros sanos y perros con cáncer se tiñeron para el marcador mieloide CD11b, CD14 marcador de monocitos y MHC II. (A) Análisis de citometría de flujo Representante de dispersión frontal y lateral y cerrada CD11b
+ CD14
-MHCII
- las células de los perros con tumores avanzados o metastáticos en comparación con los perros con tumores en etapa temprana no metastásicos y control sano perros. Las parcelas son representativas de perro con hemangiosarcoma avanzado metastásico (arriba), vejiga en estado inicial carcinoma de células transicionales (medio) y un perro sano. (B) FACS CD11b
+ CD14
-MHCII
- las células se tiñeron con Diff-Quick para la evaluación de la morfología celular. Un ejemplo representativo de la morfología de granulocitos polimorfonucleares de CD11b
+ CD14
-MHCII
- células se muestra en el 63 × magnificación
Los perros con cáncer avanzado o metastásico tenían un significativamente mayor. fracción de MDSCs putativos (36.04 ± 2.542, con una media ± SEM) en comparación con los perros con las primeras etapas de tumores no metastásicos (9,40 ± 0,953, con una media ± SEM) y los perros de control sanos (10,24 ± 1.412, con una media ± SEM) (Fig. 2A). Por otra parte, esta elevación en el CD11b
+ CD14
-MHCII
- no apareció fracción estar restringida a un tipo específico de tumor. Las diferencias fueron estadísticamente significativas en los perros con sarcomas, carcinomas, y los tumores de mastocitos en comparación con los controles sanos (Fig. 2B). Por el contrario, el porcentaje de CD11b
+ MHCII
- células CD14 que hicieron expreso no fue significativamente diferente entre cualquier grupo. Por lo tanto, la frecuencia de CD11b
+ CD14
-MHCII
- células que co-purifican PBMC se correlaciona con la carga tumoral. Esta conclusión está de acuerdo con los datos publicados anteriormente en relación con los niveles de MDSC y la carga tumoral en ratones y seres humanos [17], [18].
(A) Análisis de la media CD11
+ CD14
-MHCII
- frecuencia de la población de perros en estadio avanzado o tumores metastásicos (n = 30) en comparación con las primeras etapas de los tumores no metastásicos (n = 15) y los perros de control (n = 18). Hubo un porcentaje significativamente mayor de CD11b
+ CD14
-MHCII
- células en perros con cáncer avanzado en comparación con las primeras etapas de los tumores no metastásicos y perros sanos (36,04% frente a 9,40% and10.24%, ., respectivamente B) Promedio de CD11b
+ CD14
-MHCII
- frecuencia de la población en los principales subtipos de cáncer: estadio avanzado o metastásico sarcomas (n = 18), etapa temprana sarcomas no metastásico (n = 6) , etapa o metastásicos carcinomas avanzados (n = 7) en etapa temprana carcinomas no metastásico (n = 7), estadio avanzado o tumores de mastocitos metastásico (n = 5) y tumores de mastocitos no metastásico de etapa temprana (n = 2) comparados con los perros de control (n = 18). Es significativo que se detectaron porcentajes elevados en todos los tumores avanzados con respecto a los subtipos de tumores en fase inicial y perros sanos. Los porcentajes de CD11b
+ CD14
+ MHCII
- células no fueron significativas entre los grupos (* indica P & lt; 0,001). La media ± SEM se muestran
CD11b
+ CD14
-MHCII
-. Las células se definen funcionalmente como MDSCs
Para probar si el CD11b
+ CD14
-MHCII
- subconjunto fue capaz de inhibir la función de las células T, se realizó una serie de experimentos de co-cultivo. Purificada CD11b
+ CD14
-MHCII
- células de tres diferentes subtipos de cáncer fueron co-cultivadas con PBMC autólogas o respondedor sanos. En todos los casos, CD11b
+ CD14
-MHCII
- células mostraron una potente capacidad de suprimir las respuestas de proliferación en una forma dependiente de la dosis. Los ejemplos representativos de la supresión de proliferación se muestran utilizando muestras de un perro con carcinoma de células escamosas de amígdalas (Fig. 3A) y el adenocarcinoma de próstata (Fig. 3B). Con el fin de determinar si la supresión era un artefacto de la utilización de los respondedores de los perros portadores de tumores, se ensayaron en cuanto a la supresión de proliferación usando respondedores normales. La adición de CD11b
+ CD14
-MHCII
- células, pero no en los PMN normales, el deterioro de la proliferación de PBMCs de perros sanos (Figura 3C.). Por otra parte, la cantidad de secreción de IFN-γ se evaluó en el medio acondicionado a partir de estos co-cultivos, revelando que CD11b
+ CD14
-MHCII
- células, pero no los PMNs normales, suprimen la secreción de IFN -γ (figura 3D).
CD11b
+ CD14
-MHCII
-. Las células fueron ordenados a partir de muestras de sangre periférica de perros con cáncer y luego co-cultivaron con PBMC autólogas (A , B) o perro sano PBMCs (C) en presencia de mitógeno durante 72 hs. se muestran ejemplos representativos de un total de ocho perros. Los gráficos representan las respuestas de proliferación después de la adición de CD11b
+ CD14
-MHCII
- aislado de un solo perro con carcinoma de células escamosas (3A), adenocarcinoma de próstata (3B) y osteosarcoma (3C). -no estimuladas PBMCs se utilizaron como control negativo y las PBMC estimuladas en ausencia de CD11b
+ CD14
-MHCII
- células se utilizaron como control positivo para la proliferación. PBMCs fueron también co-incubaron con PMN, para controlar la presencia de células adicionales (3C, 3D). Las respuestas proliferativas se midieron por
3H-timidina. CPM, recuentos por minuto. Cantidad de secreción de IFN-γ en el co-cultivo se determinó utilizando canino específico IFN-gamma ensayo ELISA (3D). Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. La media ± SEM se muestran.
MDSCs suprimir tanto CD4
+ y CD8
+ células T
Para interrogar aún más el efecto directo sobre los linfocitos T, purificada CD11b
+ CD14
-MHCII
- células de un perro con osteosarcoma fueron co-cultivadas con células CD4 purificado
+ y CD8> + T de un perro sano durante 72 h. Las células no estimuladas y CD4
+ y CD8
+ células co-incubaron con PBMC sanos se utilizaron como controles. Como era de esperar, CD11b
+ CD14
-MHCII
- células inhiben la proliferación de las células CD8
+ (Fig. 4A) y CD4
+ células T (Fig. 4B), mientras que PBMCs de una perro normal no lo hizo. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que CD11b
+ CD14
-MHCII
-. Células son de hecho definen funcionalmente como MDSCs caninos
FACS CD11b
+ CD14
-MHCII
- células aisladas de un perro con osteosarcoma o PBMCs sanos se co-incubaron con estimulada por mitógenos CD4
+
+ y CD8 T aisladas de un perro sano durante 72 hs. No se utilizaron las células estimuladas como control negativo. Las respuestas proliferativas se midieron por
3H-timidina a partir de experimentos realizados por triplicado. CPM, recuentos por minuto. La media ± SEM se muestran
CD11b
+ CD14
-MHCII
-. Células expresan sello MDSC derivados de factores inmunosupresores
Se ha demostrado que MDSCs puede inhibir la función de las células T por la producción de factores solubles, tales como la arginasa-1, las especies reactivas de oxígeno, óxido nítrico y TGF-β (8-10). Con el fin de evaluar si CD11b
+ CD14
-MHCII
- las células de los perros con cáncer podría utilizar estos mecanismos para mediar la supresión de células T, se evaluó la expresión de ARG1 y iNOS2, así como el inmunosupresor citoquinas TGF-β y IL-10, dentro de esta población de células y de PMNs aislados a partir de sangre periférica de perros sanos. análisis de PCR de ARN extraído de FACS aislado CD11b
+ CD14
-MHCII
-Cells confirmó la expresión de ARG-1, enzimas iNOS2 y citoquinas inmunosupresoras TGF-β y IL-10 mRNA (Fig. 5A) . En contraste, los PMN normales del perro no expresaron ARG1, aunque iNOS, TGF-β y IL-10 mRNA fueron detectables (Fig. 5B). Debido a ARNm para ARG-1, iNOS2, β TGF-e IL-10 fueron encontrados, concluimos que estos factores podrían desempeñar un papel en la inhibición de la proliferación de células T y la función efectora. Sin embargo, desde PMNs aislados de perros sanos no expresaban ARNm detectable ARG-1 o poner en peligro la función de células T, lo que sugiere que ARG-1 puede ser un mecanismo inducida por tumor que MDSCs podrían emplear para la supresión de células T. . Este hallazgo no fue inesperado y ha sido previamente documentada en estudios humanos MDSC [19]
RT-PCR análisis de FACS purifica CD11b
+ CD14
-MHCII
- células detectado expresión de ARG1 y iNOS2, así TGF-beta y IL-10 inmunosupresores citoquinas. ARG-1 de expresión no se detectó en PMNs normales. CD11b
+ CD14
-MHCII
- Se aislaron células fueron aisladas de la sangre periférica de un perro con el osteosarcoma y el PMN de un perro sano. NRT, plantilla de ARN en ausencia de transcriptasa inversa. Los resultados son representativos de tres experimentos.
Discusión
El campo de la oncología comparativa muestra una gran promesa para avanzar en el desarrollo de nuevas terapias para los perros y los pacientes humanos por igual. Sin embargo, la escasez de reactivos e inmunofenotipo mal definida de los leucocitos caninos ha impedido nuestra capacidad para comprender la inmunología tumoral en perros con cáncer de origen natural. Nuestros datos demuestran la existencia de MDSCs en la sangre periférica de perros, que son elevados en todos los tipos de cáncer avanzado o metastásico analizados en comparación con el cáncer no metastásico etapa temprana y los controles sanos. Con este fundamento básico de conocimiento en su lugar, ahora será posible controlar de forma prospectiva carga MDSC en perros tratados con fármacos experimentales y la inmunoterapia. El CD11b
+ CD14
-MHCII
- población de células que se define como MDSC co-purificado con PBMCs, tenía la morfología granulocítica polimorfonucleares, suprimió la proliferación de células T y la función efectora, expresado sello factores supresores de MDSC humana, y positivamente correlacionada con la carga tumoral. Ensayos de proliferación revelaron proliferación relativamente débil en PBMCs de los perros portadores de tumores (Fig. 3A, B) en comparación con los respondedores normales (Fig. 3C) en ausencia de exógenos MDSC. Esto probablemente refleja los niveles elevados de endógena (no se añade de forma experimental) MDSCs y las células T reguladoras en los PBMCs de perros con cáncer. Además, es crucial tener en cuenta que un segundo subconjunto de MDSC que es más monocítica en la naturaleza es muy apreciado en murino y la inmunología tumoral humano. No se encontraron pruebas para la expansión selectiva de a + células tipo monocito CD14
en la sangre de perros con cáncer. Sin embargo, CD11b
+ MHCII
- células que se purificaron a partir de perros con cáncer avanzado que también eran CD14
+ proliferación de células T inhibe potentemente (Figura S2), lo que revela que a pesar de monocítica MDSC no son una población dominante en perros con cáncer, son de hecho presente. Este descubrimiento de la expansión preferente de granulocítica MDSC no es sorprendente y está de acuerdo con estudios similares llevados a cabo en modelos de tumores murinos [15]. En general, nuestros datos son consistentes con un estado global de la supresión inmune en perros con cáncer avanzado que es probablemente atribuible a varios mecanismos.
El entregable práctica de este estudio es un simple inmunofenotipo superficie tres marcador que puede ser usado para supervisar de forma prospectiva carga MDSC en perros. Hemos llevado a cabo estudios experimentales para buscar marcadores adicionales. los resultados preliminares específicos que vale la pena destacar son los siguientes. No hemos sido capaces de demostrar la tinción con éxito utilizando anticuerpos anti-CD66b humanos. CD66b es un marcador de activación expresado en algunas MDSC humana [19]. El marcador más ampliamente utilizado para MDSC en el ratón es Gr-1, y un anticuerpo contra el ratón Gr-1 cruzada reacciona muy bien con células caninas, al igual que anti-ratón CD11b (Figura S1). Se requieren estudios adicionales para determinar si las células caninas que se identifican mediante anticuerpos GR-1 y CD11b anti-ratón son de hecho MDSCs.
Una potencial limitación de este estudio que muchas de las muestras que analizamos fueron congelados, la descongelado antes del análisis, lo que podría haber influido en la viabilidad celular.