Extracto
El cáncer de próstata (CaP) es el tipo más común de cáncer en los hombres y entre las principales causas de muerte por cáncer en el mundo occidental. En el presente estudio, se compararon los patrones de expresión de proteínas individuales de histológicamente caracterizado CaP y el tejido benigno circundante obtenido por disección manual de micro usando electroforesis en gel diferencial bidimensional de alta sensibilidad (2D-DIGE) acoplada con espectrometría de masas. datos proteómicos revelaron 118 puntos de proteínas que se expresan diferencialmente en el cáncer (n = 24) en comparación con benigna (n = 21) tejido de la próstata. Estas manchas se analizaron por MALDI-TOF-MS /MS y se identificaron 79 proteínas diferentes. Utilizando el análisis de componentes principales podríamos claramente tumor separado y el tejido normal y dos grupos de tumores distintos basados en el patrón de expresión de la proteína. Mediante el uso de un enfoque de biología de sistemas, podríamos trazar muchas de estas proteínas tanto en las principales vías implicadas en la progresión del CaP, así como en un grupo de marcadores de diagnóstico y /o pronóstico potenciales. Debido a la complejidad de la red vía más corta altamente interconectado, las subredes funcionales revelaron algunos de los posibles candidatos proteínas biomarcadores para su posterior validación. Mediante el uso de un enfoque de biología de sistemas, nuestro estudio revela nuevas proteínas y redes moleculares con expresión alterada en el CaP. Además de validación funcional de las proteínas individuales está en curso y podría proporcionar nuevos conocimientos en la progresión del CaP con posibilidad de conducir al diseño de estrategias diagnósticas y terapéuticas novedosas
Visto:. Ummanni R, Mundt F, H Pospisil, Venz S, C Scharf , Barett C, et al. (2011) Identificación de dianas proteicas clínicamente relevantes de la del cáncer de próstata a espectrometría de masas 2D-DIGE acoplado y la Plataforma Red de Biología de Sistemas. PLoS ONE 6 (2): e16833. doi: 10.1371 /journal.pone.0016833
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: 30 Agosto, 2010; Aceptado 16 de enero de 2011; Publicado: 11 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Ummanni et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal alemán de Educación e Investigación en el marco del Programa de Médico de Investigación del Genoma (Subvenciones: 01GS0890, 01GS0892, 01GS0189). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es actualmente el principal cáncer entre los hombres en los países occidentales [1]. Los estudios de autopsia han revelado que aproximadamente el 30% de los hombres mayores de 50 años y el 80% de los hombres de 70 años tienen evidencia microscópica de cáncer de próstata [2], [3]. En el año 2007 en los Estados Unidos, se estima que 218.890 nuevos casos diagnosticados y 27.050 hombres murieron de CaP [4]. El (temprano) tasa de detección y por lo tanto la incidencia de la ACP ha aumentado dramáticamente debido a la introducción de la prueba de PSA. No obstante, la determinación de la exposición de PSA sérico algunas limitaciones importantes, como los niveles elevados de cerca correlaciona tanto con hiperplasia y cáncer.
bidimensional en gel de electroforesis (2DE), una poderosa herramienta que se utiliza para la separación de proteínas y perfiles de expresión es uno de las tecnologías básicas en la proteómica [5], [6]. análisis de la expresión de proteínas de los materiales de los pacientes son informativos llevado a los marcadores específicos de cáncer de identificación para el diagnóstico, objetivos terapéuticos y es la base para revelar diversos eventos celulares asociados con la progresión del cáncer [7]. Hasta la fecha, varios grupos de investigación ya han realizado expresión de la proteína y el gen de perfiles de estudios en muestras de biopsia quirúrgica y CaP [8] - [12], pero la mayor parte del potencial informó marcadores no están en uso clínico para el diagnóstico definitivo de CaP. Sin embargo, los estudios anteriores se centraron en comparaciones interindividuales de análisis proteómico de prostatectomías radicales de pacientes con cáncer a los de pacientes no oncológicos con Eco-2D convencional. análisis intraindividual de muestras de tejidos benignos (adyacentes al tumor) de los mismos pacientes de cáncer pueden reducir la variabilidad técnica y por lo tanto proporcionar un medio para aumentar la especificidad de los resultados y para aumentar las posibilidades del tumor y para identificar alteraciones específicas de proteínas asociadas a la enfermedad.
en el presente estudio, se investigó el proteoma comparativo de cáncer de próstata y su adyacente tejido benigno histológica de pacientes con cáncer con la caracterización patológica definitiva en nuestra 2-D diferencial electroforesis en gel sistema (DIGE) para la proteína electroforesis en 2-D [13 ] y MALDI-TOF-MS /MS para la identificación de proteínas. Las proteínas expresadas diferencialmente fueron analizados por MetaCore programa Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems) ™ (Gen GO) y. Los principales centros de las redes sub significativos fueron validados por análisis de PCR en tiempo real. El análisis de sistemas de red biología podría proporcionar el posible papel de las proteínas en diferentes vías de regulación que controlan la progresión del CaP y predecir nuevos biomarcadores, que se pueden validar aún más el uso de Western Blot e inmunohistoquímica (IHC) se acerca.
Materiales y Métodos
muestras clínicas y Ética Declaración
Las muestras de tejido y datos de los pacientes se obtuvieron con consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Hamburgo Eppendorf y se llevó a cabo de acuerdo con la declaración de Helsinki. Para el análisis de la expresión de proteínas se recogieron próstatas enteros después de la prostatectomía radical con respecto a los pacientes con valores elevados de PSA y el examen patológico preoperatorio en el Martini Clínicas, Hamburgo, Alemania. Los pacientes recibieron ninguna terapia preoperatoria. 24 pacientes fueron seleccionados y los datos clínicos y patológicos correspondiente se suministra se encuentran en la Tabla 1. Se determinaron los niveles de PSA en suero de estos pacientes, y todos los pacientes tenían un rango entre 3,9 y 30,4 ng /ml (valor de PSA media = 10,93 ng /ml) y una puntuación de Gleason entre 3 + 3 y 4 + 5 [14], [15].
Después de muestras de prostatectomía radical se congelaron en nitrógeno líquido hasta su uso. áreas tumorales benignas y se marcan en las secciones. Se empleó el método de micro disección manual para obtener materiales patológicamente caracteriza por nuestro enfoque de la proteómica. Las áreas correspondientes en los bloques restantes se cortaron con un cuchillo afilado, incrustado en el tejido-Tek y se almacena a -80 ° C hasta su uso.
aislamiento de proteínas y etiquetado con CyDyes
El tejido se se enjuagaron con solución salina fisiológica (0,9% NaCl) para eliminar los materiales residuales de montaje, el marcado tinte y sangre. Los tejidos se homogeneizaron en rodajas directamente en tampón de lisis DIGE (mM Tris 30, 2 M Thio urea, 7 M de urea, 4% de CHAPS; aproximadamente 0,5 tejidos ml /200 mg). El homogeneizado resultante se aclaró para eliminar todos los restos por centrifugación a 12.000 g durante 15 min a 4 ° C, se recogió el sobrenadante de proteínas y su concentración de proteína se determinó mediante un ensayo de Bradford modificado [16]. La calidad de las muestras para DIGE se evaluó por el mini 2DE (7 cm tiras IPG, pH 4-7). Los lisados de proteínas se marcaron con tintes Cy acuerdo con el protocolo del fabricante para un mínimo de etiquetado (colorantes mínimos CyDye DIGE Fluor, GE Healthcare). Con el fin de minimizar los artefactos de etiquetado de tinte específico, Cy3 y Cy5 patrones de etiquetado fueron intercambiados entre el mismo grupo de muestras. Una piscina estándar interno con cantidades iguales de cada muestra de proteína (25 mg) se utilizó para reducir la variación inter-gel. Las normas internas combinadas fueron marcadas con Cy2. 50 g de proteína de cada muestra se marcó con 400
p
mol de colorante correspondiente en hielo en la oscuridad durante 30 min. La reacción se inactivó /detuvo con 10 mM de L-lisina de 10 min en las mismas condiciones.
DIGE-Two-dimensional electroforesis en gel (DIGE-2-DE)
La primera dimensión enfoque isoeléctrico se llevó a cabo mediante el uso de 24 cm inmovilizado gradiente de pH tiras secas (IPG) con un gradiente de pH 4-7 lineal. Para geles analíticos, un par de Cy3 y Cy5 etiquetados muestras (cada 50 g de proteína) y 50 g de Cy2 etiquetados estándar interno se agruparon y se llena hasta 150 ml con 2 x tampón de muestra (7 M urea, tiourea 2 M, 4 % de CHAPS, 2% de DTT), suplementado con 2% (v /v) de tampón IPG pH 4-7). Para la rehidratación, diluir las muestras con 2 x tampón de rehidratación (8 M urea, 4% de CHAPS, DTT 13 mM) suplementado con 1% (v /v) IPG tampón de pH 4-7 y unos granos de azul de bromofenol) a volumen final de 450 l. tiras IPG (24 cm, pH 4-7, GE Health Care) se rehidrata de forma pasiva durante la noche a 20 ° C en casetes IPGphor. Para geles preparativos, se usó 750 g de proteína no marcada agrupado de cantidades iguales de muestras. Las proteínas fueron separadas por el sistema IEF PROTEAN (Bio-Rad) utilizando un gradiente de tensión programado a 20 ° C con un límite de corriente de 50 mu por tira en la oscuridad bajo las siguientes condiciones: 4 h a 250 V, gradiente lineal 8000 V a 15000 V hrs, rápida V 8000 a 75000 V hrs, para un total de 90 kVh. Después de IEF, las tiras de IPG se equilibraron en tampón 1 (50 mM Tris-HCl pH 8,8, 8 M urea, 30% de glicerol, 2% SDS y 0,5% de DTT) y tampón 2 que contiene 4,5% de yodoacetamida en lugar de la TDT en cada caso para 15 minutos.
segunda dimensión se realizó en el sistema celular PROTEAN® Plus ™ Dodeca. Las tiras equilibradas se aplicaron a la parte superior de 12,5% en geles de SDS-PAGE y se sellan con 1% de agarosa en tampón SDS-Tris-glicina con trazas de azul de bromofenol como un colorante de seguimiento para supervisar la electroforesis. Los geles de poliacrilamida (12,5%) fueron fundidas en placas de vidrio de fluorescencia bajos. La electroforesis se realizó con una tensión constante (80 V) a 20 ° C hasta que el frente de colorante alcanzó el fondo del gel. El aparato completo está protegido de la luz. Después de la electroforesis, los cassettes de gel de análisis se lavaron con ddH
2O y se limpió con un pañuelo de papel libre de polvo. El Cy2 (patrón interno), Cy3 y Cy5 etiquetados proteínas en cada gel se visualizaron mediante el uso de un Typhoon 9400 ™ escáner láser (GE Healthcare) a una densidad de 100 micras mediante el uso de diferentes longitudes de onda de excitación y emisión directamente a partir de geles entre placas de vidrio. longitudes de onda de excitación /emisión óptimas para la detección de fluorescencia son 488/520 nm para Cy2, 532/580 nm para Cy3 y 633/680 nm para Cy5. geles preparativos fueron teñidas con Roti®-Blue, un coloidal Coomassie brillante mancha azul G250. Brevemente, los geles se fijaron en 40% de metanol, ácido acético 15% durante al menos 4 horas y después se sumergen en solución de tinción coloidal durante la noche. Para eliminar la tinción de fondo geles se lavaron en metanol al 20%.
Imagen análisis
Delta 2D análisis diferencial de software versión 4.0 (Decodon GmbH, Alemania) se utilizó en este estudio. Para el análisis de gel individual, se detectaron manchas, cuantifican y se normalizaron de acuerdo con la relación de volumen de manchas detectadas la imagen Cy2 del patrón interno agrupado-muestra en correspondiente usando el módulo estándar interno. Todas las cantidades punto normalizados de los geles fueron analizados colectivamente como dos grupos independientes "tumor" y "benigno", que permite el uso de múltiples imágenes de gel de diferentes pacientes para proporcionar datos estadísticos sobre la abundancia promedio para cada mancha de proteína entre los geles DIGE incluidos en el análisis . Tres geles de grupo benigna se excluyeron del análisis debido al problema en el etiquetado DIGE. Estudiante de
t-test
se realizó para evaluar la significación estadística de las proteínas expresadas diferencialmente. Sobre la base de la relación de volumen medio punto, puntos cuya expresión relativa se cambia al menos 1,5 veces (aumento o disminución) entre tumores benignos y en el nivel de confianza del 95% (t-test; p & lt; 0,05) fue considerado significativo. Para el análisis de espectrometría de masas posterior coordenadas del punto significativo se transfirieron a Coomassie preparativa en gel teñido para la recolección de punto.
La espectrometría de masas
Preparación de mezclas de péptidos de MALDI-TOF-MS /MS.
identificación de proteínas se realizó como se ha descrito recientemente [11]. Brevemente, las proteínas fueron extirpados de azul brillante de Coomassie coloidal manchada 2-DE geles usando un cortador de punto. La digestión con tripsina y posterior manchado de soluciones de péptidos sobre la MALDI-objetivos se llevaron a cabo de forma automática en la estación de trabajo de manipulación Ettan Spot. piezas de gel se lavaron 50 mM ammoniumbicarbonate /50% (v /v) de metanol y con 75% (v /v) ACN. Después de secar solución de tripsina que contenía 20 ng /l de tripsina en ammoniumbicarbonate 20 mM y se incubó a 37 ° C durante 120 min. Para la extracción de péptidos, piezas de gel se cubrieron con 50% (v /v) ACN /0,1% (w /v) de TFA y se incubaron durante 30 min a 37 ° C. El sobrenadante que contiene péptido se transfirió a una nueva placa de micro y se repitió la extracción. Los sobrenadantes se combinaron y se secaron completamente a 40 ° C durante 220 min. Los péptidos se disolvieron en 0,5% (w /v) de TFA /50% (v /v) de ACN y manchas en la MALDI-objetivo. Entonces, ((w /50% (v /v) ACN /0,5% v) TFA) se añadió solución de matriz saturada con CHCA y se mezcla con la solución de muestra aspirando la mezcla cinco veces. Antes de la medición en el instrumento MALDI-TOF, las muestras se dejaron secar en el objetivo de 10 a 15 min.
MALDI-TOF-MS.
La medición MALDI-TOF de manchado soluciones de péptidos se llevó a cabo en un MALDI TOF /TOF ™ Analizador 4800. Los espectros se registraron en el modo de reflector en un intervalo de masas 800-4000 Da con un un punto de calibración interna en el fragmento autolítico de tripsina (mono-isotópica (M + H)
+ m /z en 2,211.104, señal /ruido ≥10). Adicionalmente se realizó un análisis MALDI-TOF-MS /MS para los 5 picos más fuertes de la TOF de espectro después de la sustracción de los picos correspondientes a fondo o fragmentos de tripsina. La calibración interna se realiza automáticamente como uno de punto de calibración si el arginina mono-isotópica (M + H)
+ m /z a 175.119 o lisina (M + H)
+ m /z en 147.107 alcanzó una relación señal a ruido (S /N) de al menos 5. Después de la calibración de una búsqueda de base de datos combinada de la EM y mediciones de MS /MS se realizó utilizando el software v3.6 GPS Explorer (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). las listas de pico se compararon con el rel.49 SwissProt restringido a la taxonomía humana o base de datos v3.12 humana IPI utilizando el motor de búsqueda de la mascota 1,9 (Matrix Science Ltd, Londres, Reino Unido). mezclas de péptidos que produjeron al menos dos veces a la puntuación de MOWSE de al menos 56 para SwissProt o al menos 59 para resultados de base de datos del IPI se consideraban como identificaciones positivas.
Bioinformática análisis de los datos proteómicos
El significativa diferencialmente expresado proteínas y su función o relaciones biológicas se determinaron utilizando la base de datos KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) y la proteína base de datos Entrez (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites /Entrez? db = proteína) de NCBI. redes de proteínas para el análisis de las vías más cortas entre las proteínas identificadas fueron construidos por MetaCore ™ software (Gen GO) y el programa de Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Ingenuity Systems) para la identificación de socios moleculares implicados en la enfermedad en particular. Una red global maestro de todas las proteínas expresadas diferencialmente (objetos de entrada) fue creado de acuerdo a las anotaciones basados en la literatura publicada, y luego las subredes adicionales se construyeron desde la red principal para centrarse en los experimentos y /o vías activadas. hubs principales se identificaron sobre la base de las conexiones y los bordes con la red. Los datos de expresión de la proteína se analizó mediante análisis de agrupamiento jerárquico y partición con R-lenguaje para encontrar marcadores potenciales que se pueden clasificar como todas las muestras de tumores benignos y con alta certeza. El agrupamiento no supervisado se realizó mediante medida de la distancia euclidiana y el método de aglomeración "promedio" de los valores transformados logarítmicamente de todas las proteínas expresadas diferencialmente significativos de 45 muestras incluidas en el conjunto de análisis.
Lukk et al. mostró que la expresión diferencial de todo el genoma entre tumores y tejido de control se puede caracterizar mediante análisis de componentes principales (PCA) por medio de un parámetro que caracteriza malignidad coherentes patrones de expresión diferencial que están asociadas con la formación de tumores. Con el fin de analizar el impacto de co-regulación de la expresión de la proteína en la identificación de biomarcadores, sin supervisión PCA se ha aplicado en los datos de expresión de proteínas (normalizado en escala logarítmica), tanto a partir de muestras de tejido normal y tumoral. El PCA se realizó en Matlab [The MathWorks Inc, versión 14]. Los componentes principales resultantes de la PCA están través de las expresiones de proteínas individuales, donde los pesos son identificados automáticamente de tal manera que la variación principal de la expresión de la proteína en el conjunto de datos puede ser explicada por los primeros componentes principales ponderados.
para evitar resultados falsos de los valores extremos, se aplicó un enfoque de dos etapas, donde en una primera etapa de PCA se aplicó sobre los datos originales. La detección de valores atípicos se aplicó en las expresiones de los componentes principales. En el segundo paso, el PCA se realizó sin los valores atípicos. Los valores de expresión resultantes para los componentes principales estabilizados, cuando se utilicen para su posterior análisis. Con el fin de analizar la proporción de la información con respecto a la expresión diferencial que se representa mediante los tres primeros componentes principales y el espacio residual, para cada proteína los valores de expresión en todos los tejidos, cuantificados por el vector x
i, donde se dividió en dos componentes: donde x
p, i es el componente de x
i que está representado por los tres primeros componentes principales de la PCA (S3) y x
r, i cuantifica las expresiones de proteínas residuales en el CS3 espacio complementario que no puede ser representada por los tres primeros componentes principales de PCA. Con el fin de verificar la distribución de la expresión diferencial entre ambos componentes, para los datos originales dadas por x
i, los componentes basados en PCA x
p, i, y los componentes residuales x
r, ia dos -sided t-test para la expresión diferencial entre las muestras normales y tumorales se ha realizado.
El aislamiento de ARN y las mediciones de la transcripción de genes de interés por PCR cuantitativa en tiempo real
PCR cuantitativa en tiempo real para el análisis de los niveles de transcripción de las proteínas de interés, se realizó utilizando SYBR Green como se ha descrito anteriormente. Brevemente RNA fue aislado de las mismas biopsias utilizadas para el análisis del proteoma mediante TRIzol® reactivo (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) según el protocolo de los fabricantes. El ADNc se preparó por transcripción inversa del ARN total 1 g usando oligo dTprimer (15mer) y M-MLV transcriptasa inversa (Fermentas Life Sciences GmbH, Alemania). cebadores Quanti Tect de genes de interés GAPDH (gen de mantenimiento) fueron adquiridos directamente de Qiagen, Alemania. Los conjuntos de cebadores se muestran para generar un único amplicón del tamaño deseado evaluadas por RT PCR seguida de electroforesis en gel de agarosa. cuantitativa en tiempo real PCR se realizó en el termociclador (Stratagene, Alemania) usando Dynamo flash SYBR Green qPCR kit (Finnzymes, Finlandia). PCR para los genes diana y de limpieza se realizaron por triplicado y se informaron los niveles de expresión relativa media. Condiciones para la reacción PCR en tiempo real fueron las siguientes: 1 ciclo de 94 ° C durante 3 min y 40 ciclos de 94 ° C durante 20 s, 60 ° C durante 30 s y 68 ° C durante 30 s. Al final de la PCR, las muestras se sometieron a un análisis de fusión para confirmar la especificidad de la amplificación. Para obtener datos estadísticos de significación obtenidos fueron analizados por el estudiante no apareado
t-test realizados
y el valor de p & lt; 0,05 fue considerado significativo
Western Blot
Los extractos de proteínas fueron separadas por. 12% SDS-PAGE y se transfirió electroforéticamente a una membrana de PVDF. El bloqueo se llevó a cabo en 1 x solución Rotiblock (Roth Chemicals) seguido por la incubación de la membrana con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. anticuerpos en exceso se eliminan por lavado con NaCl-Tris-Tween 20. La incubación con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante [anti- (IgG de ratón) o anti- (IgG de conejo), diluido en 1:5000 1 × Rotiblock] se realizó para 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados, la reacción se desarrolló mediante la adición de sustrato LumiGLO (Thermo). La luz emitida fue capturado en la película de rayos X (GE Healthcare).
Resultados
2D-DIGE Análisis y espectrometría de masas
En este estudio, hemos sido capaces de establecer un procedimiento estándar para la disección micro manual de las muestras de prostatectomía radical para la obtención del tumor patológicamente evaluado y tejidos benignos para el análisis del proteoma. Por otra parte, hemos analizado el proteoma de próstatas de 24 pacientes con cáncer y su correspondiente tejido benigno en 21 casos (Tabla 1) por 2D-DIGE con la gama pI de 4,0-7,0 y rango de peso molecular entre 10 kDa y 120 kDa. En estas condiciones, un total de 1324 puntos se detecta claramente y posteriormente analizado utilizando software Delta2D para la expresión diferencial de proteínas. 118 puntos fueron significativamente alteradas en su abundancia entre todas las muestras incluidas en el conjunto de análisis y se seleccionaron para su posterior identificación. Las abundancias medio de manchas se cuantificaron y aquellos con los cambios relativos en la abundancia de más de 1,5 veces entre benignos y tumores (arriba o abajo) a nivel de confianza del 95% (
p Hotel & lt; 0,05) fueron considerados como significativos. puntos de interés fueron extirpados de geles preparativos para la identificación de proteínas (ID) por tríptico digestión en gel y el análisis de MALDI-TOF MS /MS. Después de una búsqueda de base de datos de la mascota del uso de los datos adquiridos MS 96 puntos de 79 proteínas fueron identificados como diferencialmente expresado en el cáncer en comparación con el tejido benigno. Las manchas con el ID de proteína se representan en la Figura 1. Las proteínas individuales se reflejaron por múltiples puntos más probablemente debido a la modificación postraduccional que conduce a cambios en la 2-DE. Las proteínas identificadas se agrupan en diferentes clases basadas en la información funcional disponible. La mayoría de las proteínas identificadas fueron las proteínas del citoesqueleto, o bien enzimas de metabolismo intermediario, la transducción de señales, proteínas de choque térmico, las proteínas relacionadas con el tumor, proteínas o proteínas de función desconocida (Figura 2B) relacionadas con el estrés oxidativo. Los detalles de las identificaciones de proteínas, proteínas de puntuación, la cobertura de secuencia, de valor pI teórico y peso molecular, así como el cambio relativo promedio se muestran en la Tabla S1.
Las proteínas se resolvieron por IEF sobre el rango de pI 4-7, seguidos un 12,5% de SDS-PAGE y se sobrepuso por Delta2D. Después de la extracción de los tejidos, las proteínas fueron marcadas con Cy3 y Cy5. Un patrón interno compuesto por la misma cantidad de proteínas a partir de todas las muestras (grupos benignos y PCA) se marcó con Cy2 y se incluye en todos los geles. Los puntos verdes indican las proteínas de regulación a la baja, mientras que los puntos rojos indican upregulated proteínas en el CP en relación con el tejido benigno correspondiente. Las proteínas identificadas que mostraron significativamente alterado expresión en el CaP se indican con flechas y se marcaron con los ID de proteínas respectives.
(A) el agrupamiento no supervisado (medida de la distancia euclidiana y el método de aglomeración "medio") se realizado utilizando los valores de proteína de expresión transformados logarítmicamente de 45 muestras. Las muestras se muestran horizontalmente, las proteínas verticalmente. Los dendrogramas representan las distancias entre los grupos. En la barra de color superior, las muestras tumorales están marcados en rojo, los tejidos normales se muestran en verde. (B) Los procesos biológicos regulados por las significativas toda proteínas expresadas diferencialmente evaluados por la búsqueda de ontología de genes y que se resumen de acuerdo a sus funciones.
La agrupación jerárquica y análisis de muestras partición
La figura 2A muestra el resultado del agrupamiento. expresiones más altas son de color rojo, los inferiores en verde. Las muestras se muestran en las columnas y las filas indican proteínas. Los dendrogramas representan las distancias entre los grupos. Las muestras de tumores benignos y no se forman dos grupos separados y distintos. Sin embargo, la agrupación jerárquica reveló un grupo de muestras de tumores muy similares (10 muestras) formar un clúster. Estas muestras se consideraron como un subgrupo de tumores en un análisis adicional. análisis de partición de los valores de expresión dio lugar a la conclusión de que una sola proteína, PPA2 puede clasificar las muestras con significación estadística (prueba de Fisher con p-valor 6.682e-09). El subgrupo tumor fue clasificado correctamente, uno (de 14) de los tumores restantes se mal clasificados como benignos y tres (de 21) de las muestras benignas fueron mal clasificados como tumores (datos no mostrados). los resultados del análisis de reparto han demostrado también que muchas proteínas pueden clasificar todas las muestras correctamente (datos no mostrados). En un intento de asignar una firma proteína PSA específico, no se observó correlación directa entre PSA y proteínas expresadas diferencialmente (datos no mostrados). Tomados en conjunto, más de una proteína puede distinguir todas las muestras, ya que fueron asignados en los grupos.
Análisis de componentes principales (PCA)
Un diagrama de dispersión de 3 dimensiones de los tres primeros componentes principales de la muestras de tejido muestra una buena separación entre tumores y tejidos normales (Figura 3A). Por otra parte, la Figura 3B, que representa los valores de p logarítmica de los originales x de datos
i para cada proteína en el eje x y las componentes x
p, i y x
r, i en la y- eje, muestra que casi todos la expresión diferencial puede ser reflejada por el componente basado en PCA (estrellas rojas).
(A) Diagrama de dispersión de los tres primeros componentes principales de PCA de los datos de expresión de proteínas. Las estrellas azules representan los tejidos normales, mientras que las estrellas rojas muestran tumores. (B) Distribución de información con respecto a la expresión diferencial entre el tumor y los tejidos normales. Cada cruz representa una proteína. Los valores de p en t-test de dos caras están representados por el eje x, mientras que las proyecciones (rojo: proyección sobre S3, azul: la proyección sobre el espacio complementario) se representan por los valores en el eje y. Al parecer, para todas las proteínas con expresión significativa diferencia en los datos originales (log10 (p) & lt; -2) la expresión diferencial de la componente residual (estrellas azules) no es significativa (log 10 (p) & lt; -1), mientras que el p -valores de los componentes basados en PCA (estrellas rojas) son similares a los p-valores originales (eje x). (C-D) Relación de precisión mediana y las probabilidades de clasificación tumoral predictivo /normal. Las curvas azules muestran el aumento de la calidad del modelo por el aumento de tamaño de la muestra utilizada para el modelo de biomarcadores. Las estrellas rojas muestran las cualidades del modelo logit basado en los tres primeros componentes principales. (E) La salida del modelo de regresión (eje y) indica la existencia de dos clases de tumores que difieren significativamente de acuerdo a su separabilidad. Los tejidos normales (azul y verde cajas) utilizando la expresión de proteínas.
Al parecer, la expresión diferencial de proteínas entre tumores y tejidos normales no se puede asignar a una proteína individual, pero parece depender de los patrones de expresión de proteínas globales que son representada por sólo tres componentes de la PCA, de acuerdo con los resultados descritos por Lukk et al. [17]. Por lo tanto todos (no redundantes genéricos,) combinaciones de al menos tres proteínas que se pueden medir con alta precisión deben ser suficientes para establecer biomarcadores con el rendimiento predictivo igual, si las proteínas muestran una contribución significativa a los tres primeros componentes principales de la PCA. El conjunto de la proteína respectiva se puede seleccionar de acuerdo a criterios experimentales, no redundancia y la importancia de la correlación con los respectivos componentes de PCA. Debido a la construcción de los componentes principales de PCA como medias ponderadas de las expresiones de casi todas las proteínas, los componentes principales pueden desempeñar el papel de un "filtro de ruido intrínseco". Por lo tanto es apropiado para expresar cada componente principal por la expresión promedio de un grupo (pequeño) de las proteínas con el fin de beneficiarse de la supresión de ruido intrínseco de promedio también. Figuras 3C-D muestra el efecto de promediación. La expresión de cada componente principal se ha representado por la expresión media de 1-25 proteínas, que han sido seleccionados al azar de un conjunto de 38 proteínas con mayor correlación con cada componente principal. Al parecer, la relación de precisión y las probabilidades depende del tamaño de la muestra de las proteínas utilizadas para la representación de los componentes principales. La mediana de las cualidades modelo está en el mismo tamaño de las cualidades de los marcadores que se basan en un fundamento biológico, lo que indica que la expresión diferencial puede estar dominado por gran escala, la expresión de proteínas fuertemente co-regulado se desplaza debido a la formación de tumores.
con el fin de comprobar el rendimiento predictivo de esperar, un logit-modelo ha sido identificada usando sólo los tres primeros componentes principales del PCA. En la validación cruzada (leave-uno) la exactitud de la predicción del tumor y los tejidos normales en la prueba de conjunto fue del 86%. Tres (de 21) tejidos normales y 3 (de 24) tejidos tumorales han sido clasificados erróneamente. El modelo muestra que los tumores se pueden dividir en dos grupos diferentes de manera significativa con respecto a su separabilidad de los tejidos normales (Figura 3E y la Tabla 2). Las pruebas estadísticas mostraron ninguna relación directa de los grupos tumorales a las caracterizaciones tumorales anotados (puntuación de Gleason, marcador PSA etc.). Por lo tanto, ya sea factores de impacto, aparte de la expresión de proteínas pueden contribuir a las características del tumor de próstata o procesos cooperativos de gran complejidad, no monótonas entre las proteínas tienen un impacto en el estado del tumor que no está cubierta por los principales componentes del PCA utilizados en el modelo de regresión logística. Clasificación funcional de las 26 proteínas identificadas expresa de forma diferente entre ambos grupos tumorales se resumen en la Figura 4A-C. Un total de 70% de las proteínas a partir de este conjunto de datos se clasificaron a los procesos metabólicos y más del 60% se clasificó a las funciones catalíticas o de unión.
(A) Los procesos biológicos, (B) y funciones moleculares (C ) compartimentos celulares reguladas por las proteínas expresadas diferencialmente entre los dos grupos de tumores evaluados por la búsqueda de ontología de genes.
análisis
Redes de proteínas identificadas en el cáncer frente a las muestras benignas
Rutas y redes que participan proteínas derivadas de 2-D DIGE experimentaciones expresados diferencialmente en el CaP se analizaron mediante MetaCore ™, el software de integración basado en la web. La arquitectura de red representa las conexiones entre las proteínas individuales (nodos).
En esta se proponen ejes de análisis (proteínas clave) de las redes de proteínas que las proteínas reguladoras clave que intervienen en los procesos multicelulares. La red más corta construido (Figura 5A) revela que c-Myc, p53, receptor de andrógenos, 14-3-3-epsilon, vimentina, PSA y receptor de estrógeno 1 como concentradores de red.