Extracto
Antecedentes
cáncer de vejiga urinaria es a menudo un resultado de la exposición a carcinógenos químicos, tales como el hábito de fumar . Debido a la similitud histológica, modelo de cáncer de roedores inducidos químicamente se utiliza en gran medida para los estudios de cáncer de vejiga humana. Investigaciones anteriores han sugerido que la nicotinamida, soluble en agua, vitamina B3, puede jugar un papel clave en la prevención del cáncer a través de sus actividades en la reparación celular. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha proporcionado evidencia hacia la identificación de las alteraciones genéticas de nicotinamida en la prevención del cáncer. En este sentido, la búsqueda de las firmas moleculares de la prevención del cáncer por el uso de un nicotinamida N-butil-N- (4-hidroxibutil) -nitrosamine (BBN) inducida por el cáncer de vejiga urinaria modelo en ratones.
Metodología /Principales conclusiones
a través de microarrays de perfiles de expresión génica de 20 ratones y 233 muestras de vejiga humanos, hemos realizado varios análisis estadísticos y la tinción inmunohistoquímica para su validación. Los patrones de expresión de 893 genes asociados con la actividad de nicotinamida en la prevención del cáncer se identificaron por análisis de datos de microarrays. Gen analiza la red de estos 893 genes reveló que el
Myc
y sus genes asociados pueden ser el regulador más importante de la prevención del cáncer de vejiga, y la expresión de genes firma una buena correlación con los datos de expresión de proteínas. Comparación de la expresión de genes entre humanos y de ratón reveló que inducidos por BBN cánceres de vejiga de ratón exhiben perfiles de expresión génica que eran más similares a los de los cánceres de vejiga humanos invasivos que a los de los cánceres de vejiga humanos no invasivos.
Conclusiones /importancia
Este estudio demuestra que la nicotinamida juega un papel importante como agente quimio-preventivo y terapéutico en el cáncer de vejiga a través de la regulación de la
Myc
firma oncogénico. Nicotinamida puede representar una modalidad terapéutica prometedora en pacientes con cáncer vesical infiltrante
Visto:. Kim SK, Yun SJ, Kim J, Lee DO, Bae SC, Kim WJ (2011) Identificación de la Expresión Génica Firma Modulada por nicotinamida en un modelo de cáncer de vejiga del ratón. PLoS ONE 6 (10): e26131. doi: 10.1371 /journal.pone.0026131
Editor: Ilya Ulasov, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de Junio, 2011; Aceptado: September 20, 2011; Publicado: 10 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Programa básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2011 hasta 0001042 y R16-2003-002-01001-02006). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Muchos cánceres de vejiga se pueden vincular a los carcinógenos químicos, y en las poblaciones occidentales, aproximadamente un tercio a la mitad de los cánceres de vejiga se asocian con el tabaquismo [1], [2]. Aunque la sustancia causal en el humo del cigarrillo aún no ha sido identificado, α- y β-naftilamina se sospecha agentes. Como agentes carcinógenos putativo para el cáncer de vejiga, aminas aromáticas tales como β-naftilamina, 4-aminobifenil, bencidina, y 2-amino-1-naftol pueden representar hasta el 20-30% de los casos de cáncer de vejiga [3], [4]. Hay dos modelos químicamente inducida primarias de cáncer de vejiga urinaria en roedores, que son inducidas por la administración de N-butil-N- (4-hidroxibutil) -nitrosamine (BBN), ya sea en ratones o ratas [5], [6]. Los tumores resultantes son histológicamente similar a la enfermedad humana, y se manifiestan a través de dos vías diferentes cancerígenos; a saber, el cáncer no invasivo del músculo de la vejiga (CVNMI) en ratas y músculo-invasivo cáncer de vejiga (MIBC) en ratones [7], [8]. Dado que el cáncer de vejiga humana es a menudo un resultado de la exposición a carcinógenos químicos, estos modelos de roedores son útiles para entender el cáncer de vejiga humana. Williams et al ilustra los perfiles de expresión génica global de los tumores de roedores y proporciona una lista de genes que son candidatos probables para impulsar el desarrollo de cáncer de vejiga y la progresión [9].
El ácido nicotínico es una vitamina soluble en agua que pertenece a la familia de la vitamina B. Se encuentra en muchos tejidos animales y vegetales, y tiene actividad antihyperlipidemic. En el cuerpo, el ácido nicotínico se convierte en su forma activa nicotinamida, que es un componente del dinucleótido de nicotinamida adenina coenzimas (NAD) y su forma de fosfato, NADP. Estas coenzimas juegan un papel importante en la respiración de los tejidos y en glucógeno, lípidos, aminoácidos, proteínas y metabolismo de las purinas. La investigación actual sugiere que la nicotinamida o vitamina B3, pueden jugar un papel clave en la prevención del cáncer a través de sus actividades en la reparación celular. Los principales científicos que estudian la nutrición creen que la vitamina nicotinamida se muestra prometedor para el tratamiento e incluso la prevención del cáncer. Myron et al demostraron que las células agotadas de nicotinamida desarrollan cáncer de diez veces más rápido que los que recibieron cantidades suficientes de la vitamina [10]. La dieta es un factor importante en la incidencia de cáncer de vejiga, con ambos componentes beneficiosos y perjudiciales, y la nicotinamida es uno de los componentes beneficiosos. Aunque la dosis óptima de nicotinamida todavía no se ha determinado, la nicotinamida es también un complemento prometedor a la quimioterapia debido a su relación con la necrosis tumoral (matar) Factor, un relativamente nuevo factor que mata selectivamente las células de cáncer [11], [12], [13] . En el presente estudio, hemos tratado de identificar las firmas genéticas de nicotinamida en la prevención del cáncer utilizando un modelo de ratón de cáncer de vejiga inducida por BBN, y se investigó la eficacia potencial del tratamiento nicotinamida en pacientes con cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
muestras de tejido de ratón
los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado de Animales de la Universidad Nacional de Chungbuk (números de permisos: CBNUA-030-0901-02). ratones C3H /He femenino se obtuvieron de Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japón) a las 6 semanas de edad y se alojaron en jaulas (cinco por jaula). Los animales se mantuvieron en una habitación iluminada durante 12 horas cada día, mantenido a 23 ± 2 ° C y 55% ± 5% de humedad. BBN se obtuvo de Tokyo Kasei Kogyo Co. (Tokio, Japón), y nicotinamida se adquirió de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). BBN se diluyó con agua del grifo a una concentración final de 0,05%. Para el análisis de los efectos preventivos de la nicotinamida, el agua potable se complementó con 0,1%, 0,25%, 0,5%, o 1% de nicotinamida con o sin 0,05% BBN durante 20 semanas. Todos los ratones recibieron el primer tratamiento a las 7 semanas de edad, y fueron sacrificados a las 20 semanas después del primer tratamiento. En la necropsia, las vejigas urinarias de ratones fueron inflados con solución salina normal y luego se retira, y bajo una luz de alta intensidad se examinaron para las lesiones macroscópicas. Después de la inspección, todas las vejigas se congelaron para el examen histopatológico y ensayos moleculares posteriores. Una parte de cada tejido se fijaron y procesaron para la inclusión en parafina de rutina, cortado en secciones de 5 micras, y montado para hematoxilina y eosina para la histopatología. Los tumores de vejiga se clasifican en CVNMI y MIBC basado en la extensión de la invasión en el músculo.
La extracción de RNA, los experimentos de microarrays, y procesamiento de datos
El ARN total fue aislado utilizando el reactivo TRIzol (Life Technologies, NY), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La calidad y la integridad del ARN se confirmaron por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, seguido de un examen visual bajo luz ultravioleta. Quinientos nanogramos de ARN total se utilizaron para el etiquetado y la hibridación, de acuerdo con los protocolos del fabricante (Illumina Ratón-6 BeadChips, versión 1.0). Las matrices fueron escaneados con un escáner confocal matriz lector de Illumina Bead (BeadStation 500GXDW; Illumina, Inc., San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Después de la exploración, los datos de microarrays se filtraron por la detección
P
-valor (
P Hotel & lt; 0,05) que fue proporcionada por Genoma Estudio
TM software (Illumina, Inc., San Diego , CA) y se normalizaron utilizando cuantil normalización en el entorno de lenguaje R (versión 2.10.0, disponible en http://www.r-project.org/). la expresión génica valores medidos se transforman y la mediana log2 centrados través de los genes y las muestras. El conjunto de datos de microarrays completo está disponible en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) base de datos pública bajo el número de serie de datos GSE21636. Todos los datos de microarrays es mínima información sobre un experimento de microarrays (MIAME) compatible.
vejiga humana microarrays cáncer
Para el análisis comparativo de ratón y el cáncer humano, se utilizó un conjunto de datos previamente publicados de vejiga humana microarrays cáncer de cohortes (Corea), GSE13507, a partir de la base de datos pública NCBI GEO [14]. El conjunto de datos consistió en 165 muestras de cáncer de vejiga primaria (103 NMIBCs y 62 MIBCs), 58 muestras de los tejidos circundantes de aspecto histológicamente normal, y 10 normal de la mucosa de la vejiga de pacientes con enfermedades benignas. Estos datos de expresión génica se calcularon sobre Illumina HumanWG-6 BeadChips (versión 2). Para una validación adicional, que también se utiliza otro conjunto de datos de cáncer de vejiga humano (cohorte española, Affymetrix U133A GeneChip), que consistía en 24 NMIBCs, 66, y 38 MIBCs mucosas normales de la vejiga [15].
transcriptasa reversa de la polimerasa reacción en cadena (RT-PCR) análisis
RT-PCR se realizó con un sistema de PCR Rotor gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Australia). reacciones de RT-PCR en tubos de micro-reacción (Corbett Research) contenían cebadores y SYBR Premix EX Taq (Takara Bio Inc., Otsu, Japón). Los datos espectrales fueron capturados y analizados mediante el Rotor-Gene en tiempo real del software de análisis 6.0 Build 14 (Corbett Research). La expresión génica se normalizó a
Gapdh
expresión.
inmunohistoquímico análisis
La tinción inmunohistoquímica se realizó en muestras fijadas en formalina, embebidas en parafina de ratones normales y tumorales vejigas. Las secciones se incubaron con los anticuerpos primarios anti-Myc (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) y anti-PMP22 (Abcam, UK). Para la tinción automatizada, sistema de tinción automática XT Benchmark (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) se utilizó. Después de la tinción, se evaluaron tanto la intensidad de la tinción y el porcentaje de células epiteliales teñidas. intensidad de la tinción se clasificó como sigue: 1, débil; 2, moderado; y 3, fuerte. La proporción de células positivas se expresó como un porcentaje del número total de células epiteliales examinados, y se asigna a una de las cinco categorías: 0, & lt; 5%; 1, 5-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; y 4, & gt; 75%. Las puntuaciones para el porcentaje de células positivas y la intensidad de la tinción se multiplican entre sí para producir la puntuación inmunoreactividad (IS) para cada muestra. El IS de Myc y PMP22 se midió en el núcleo y el citoplasma, respectivamente. Cada muestra se examinó y anotó por separado por tres investigadores, y se discutieron las puntuaciones discrepantes hasta que se alcanzó un acuerdo.
Análisis de transferencia Western
Después de enjuagar en agua destilada, las muestras en tubo de vidrio que contiene 1 ml de tampón de lisis de células fueron mecánicamente se homogeneizaron con un homogeneizador de tejidos. El homogeneizado se transfiere a un tubo de 1,5 ml y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. La fase acuosa superior se descartó y se mezcla con 2 ul de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y 200 ul de tampón de análisis de proteínas. Después de la incubación durante 1 hora a 4 ° C, las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C. La fase acuosa superior se transfirió a un nuevo tubo y se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Cada muestra (70 ug) se cargó en 10% (peso por volumen) de sodio dodecil sulfato de gel y se transfiere a una membrana de fluoruro de polivinilideno (GE Healthcare, San Antonio, TX). Western blots se analizaron con anticuerpos contra PMP22 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y Myc (LifeSpan Biosciences, Seattle, WA).
El análisis estadístico
Para comparar las características moleculares entre los diferentes grupos de ratones, se realizó un análisis de agrupamiento jerárquico. Un algoritmo de agrupación jerárquica, utilizando el coeficiente de correlación de centrado como medida de la similitud y la agrupación promedio de ligamiento, se aplicó como se describe en Eisen et al [16]. Hemos identificado los genes que son expresados diferencialmente entre los dos grupos al azar utilizando una varianza de dos muestras t-test [17]. Los genes se considera que tienen diferencias estadísticamente significativas en la expresión si el valor de p era inferior a 0,001. También se realizó una prueba global de si los perfiles de expresión diferentes entre las clases mediante la realización de permutaciones. Para cada permutación, los
P-valores
fueron re-calculan y se anotó el número de genes importantes en el nivel de 0.001. La proporción de las permutaciones que dieron como resultado al menos tantos genes importantes como los datos reales se tomó como el nivel de significación de la prueba global. Si bien la obtención de genes diferencialmente expresión, se seleccionaron los genes que había un pliegue 1.2 o más la diferencia de los valores de expresión de dos grupos significar.
Para explorar las relaciones entre los genes tumorigénicas que respondieron a la nicotinamida, se examinaron las asociaciones funcionales entre los genes y las redes de genes generadas en función de si tenían más genes interconectados que cabría esperar que ocurra por casualidad. El significado de cada red se estimó utilizando el sistema de puntuación proporcionada por la herramienta de análisis Ingenuity Pathway (versión 7.5). Las puntuaciones fueron determinados por el número de genes expresados diferencialmente en cada una de las redes y la fuerza de las asociaciones entre los miembros de la red
.
Como medio de la comparación de los patrones de expresión de genes entre las muestras humanas y de ratón, los datos de microarrays de modelos de ratón se combinaron con el conjunto de datos de los cánceres de vejiga humanos utilizando HomoloGene (NCBI), un sistema para la detección de los genes homólogos en varios genomas eucariotas [18]. Antes de la integración de los dos conjuntos de datos, los niveles de expresión de cada gen en cada conjunto de datos se estandarizaron de forma independiente, a una media de cero y una desviación estándar de 1. Para predecir modelos de ratón contra los tejidos humanos, se aplicó cuatro modelos de predicción diferentes: compuesto predictoras de covarianza [19], análisis discriminador lineal [20], más cercana centroide de clasificación [20], y las máquinas de vectores soporte [21]. Los modelos incorporan genes que son expresados diferencialmente entre las dos clases usando una prueba t de dos muestras. Los genes se considera que tienen diferencias estadísticamente significativas en la expresión si el
P
-valor era inferior a 0,001. Se estimó el error de predicción de cada modelo usando la licencia-un-out validación cruzada (LOOCV), según lo descrito por Simon et al [22]. Para cada conjunto de entrenamiento LOOCV, se repitió todo el procedimiento de creación de modelos, incluyendo el proceso de selección de genes. procedimiento de predicción de especies cruzadas se realizó en BRB ArrayTools (versión 3.8.0).
Resultados
La eficacia de nicotinamida como un agente protector contra los cánceres de vejiga de ratón inducidos por BBN
para investigar el efecto de nicotinamida en la formación de tumores en el modelo de cáncer de vejiga inducida por BBN, los ratones recibieron 0,05% BBN solo o BBN más concentraciones crecientes de nicotinamida en el agua de bebida durante 20 semanas (Figura 1A). Notablemente, la suplementación nicotinamida inhibe la formación de tumores. La suplementación con 0,5% de nicotinamida reduce la relación de la formación de tumores a partir de 100% a 74%, y 1% de nicotinamida reduce la relación aún más, a 52% (Figura 1B). El análisis histológico de los tumores de vejiga de los diferentes grupos de tratamiento reveló que el desarrollo de MIBC fue marcadamente inhibida por nicotinamida. El tratamiento con 0,1% de nicotinamida redujo la incidencia de MIBC 88-42%, y 1% de nicotinamida redujo aún más, a 12% (Figura 1B), lo que indica que la nicotinamida inhibe fuertemente la progresión del tumor de vejiga. El volumen del tumor fue también notablemente reducido por la nicotinamida. La mayoría de los ratones tratados con BBN desarrollaron tumores grandes (tamaño medio, 129 mm
3). Aumentar el tratamiento de nicotinamida reducido significativamente el tamaño medio de tumor (99 a 18 mm
3 cuando 0,1 a 1% de nicotinamida fueron tratados, la Figura 1C). Estos resultados demostraron que la nicotinamida previene eficazmente la formación de tumores y suprime el crecimiento tumoral y la progresión de MIBC.
(A) Protocolo experimental para el análisis de los efectos preventivos de la NC. Los ratones se trataron con BBN solo o en combinación con las cantidades indicadas de NC de 20 semanas. "N" indica el número de ratones en cada grupo. Una dosis de 0,1% NC en el agua potable es aproximadamente equivalente a 100 mg /Kg /día. (B) Resumen de la incidencia de la formación de tumores, no músculo cáncer de vejiga invasivo (CVNMI), y el cáncer de vejiga invasivo muscular (MIBC) para cada grupo de tratamiento. El número encima de cada barra indica el número de ratones en cada categoría histológica. (C) El diagrama de caja comparando los volúmenes tumorales de los grupos de tratamiento. El
P
-valores se obtuvieron mediante dos pruebas t de muestras entre G1 grupo y otros grupos.
Patrones de expresión
génica diferencial entre los grupos experimentales
Para caracterizar la los patrones de expresión de genes de nicotinamida en la prevención del cáncer, seleccionamos aleatoriamente 20 vejigas de ratón y se realizó un perfil de expresión génica; cinco tumores de vejiga de ratón inducidos por BBN (MIBCs de Grupo G1, Figura 1 A), cinco vejigas no tumorales que portan tratados con BBN y nicotinamida (muestras normales del Grupo G5, la Figura 1A), cinco vejigas normales tratados con 1% de nicotinamida (Grupo G6 en la Figura 1A), y cinco vejigas normales sin tratamiento (G7 Group en la Figura 1A). Las 5 muestras en cada grupo fueron histológicamente idénticos entre sí. Se aplicaron primero el análisis de agrupamiento jerárquico de patrones de expresión génica para evaluar las características moleculares de los diferentes grupos experimentales. Como era de esperar, el análisis de agrupamiento jerárquico de los datos de expresión de genes a partir de todos los tejidos produjo tres grupos principales, uno que representa el grupo normal de la vejiga, un segundo que representa el grupo de tumores de vejiga de ratón inducido-BBN, y tercera representación de la BBN + nicotinamida-tratado no tumorigénicos grupo de la vejiga (Figura S1). Por lo tanto, los patrones de expresión génica que reflejan la configuración molecular son fácilmente distinguibles entre los tumores de vejiga y tejidos no tumorales.
A continuación tuvo como objetivo identificar conjuntos de genes que son expresados diferencialmente entre los tres grupos diferentes. Antes del análisis, se excluyeron vejigas normales tratadas con nicotinamida, ya que no había ningún histopatológico o diferencias moleculares entre normal de la vejiga y se trató nicotinamida-(Figura S1). Aplicamos Venn diagrama de comparación de dos listas de genes para seleccionar la expresión génica patrones comunes de la carcinogénesis y la prevención del cáncer. En primer lugar, hemos generado dos listas de genes diferentes mediante la aplicación de la prueba t de dos muestras (Figura 2 A,
P Hotel & lt; 0,001). Una lista de genes representa los genes que son expresados diferencialmente entre la vejiga normal y grupos de tumores inducidos-BBN, y la lista de genes B representa los genes que son expresados diferencialmente entre la BBN- y grupos de nicotinamida-BBN tratada +. Al comparar las dos listas de genes, se observaron tres patrones diferentes: A no B (3.344 genes), A y B (893 genes), y B no A (1.115 genes) (Figura 2B). Los genes en la categoría A no B mostraron patrones de expresión específicos de tumores inducidos-BBN, mientras que los genes en el B no es una categoría muestran los patrones de expresión de genes que respondieron a la nicotinamida. Los genes en la categoría A y B exhiben tanto BBN indujo tumorigénicos, así como los patrones de expresión de nicotinamida-sensible. Estos resultados significaron que 893 genes en la categoría A y B eran comunes a ambas carcinogénesis inducida por BBN y para la prevención del cáncer inducido por la nicotinamida
.
(A) Diagrama de Venn de los genes seleccionados por muestra de dos t-test en el modelo de ratón. El círculo de color púrpura (lista de genes A) representa los genes expresados diferencialmente entre los tejidos normales de la vejiga y N-butil-N- (4-hidroxibutil) -nitrosamine (BBN) inducida por los tumores de vejiga. El círculo azul (lista de genes B) representa los genes expresados diferencialmente entre los tumores de vejiga inducidos por BBN y tejidos no tumorales tratadas BBN + nicotinamida (Carolina del Norte). Se aplicó un punto de corte
P
-valor inferior a 0,001 para seleccionar los genes cuya expresión fue significativamente diferente entre los dos grupos. patrones (B) la expresión de genes seleccionados en el diagrama de Venn. Entre los genes en una categoría no B, 1.525 genes (45,6%) mostraron patrones de arriba-abajo y 1.819 genes (54,4%) mostraron patrones de abajo-arriba en el cáncer normal y inducida por BBN. En la categoría A y B, 290 genes (32,5%) y 603 genes (67,5%) representan los patrones de abajo-arriba-abajo y arriba-abajo-arriba patrones, respectivamente, en condiciones normales, el cáncer de BBN-inducidos, y BBN + NC- grupos de vejiga tratados. En el B no es una categoría, 606 genes (54,3%) que se muestran abajo-arriba patrones y 509 genes (45,7%) mostraron patrones de arriba-abajo en el cáncer inducido por BBN y grupos de vejiga tratados con NC + BBN. Los datos se presentan en formato de matriz en la que las filas representan genes individuales y las columnas representan cada tejido. Los colores rojos y verdes reflejan niveles altos y bajos de expresión, respectivamente.
visión biológica de los patrones de expresión génica para la prevención del cáncer
Para identificar las redes de señalización predominantes activos en la prevención de cáncer de vejiga por la nicotinamida, el análisis de redes de genes de los 893 genes en la firma prevención del cáncer (Figura 2) se realizó utilizando el software Ingenuity
TM Pathways Analysis. De los 893 genes, 477 fueron asignadas a las redes de genes definidos por esta herramienta. Este análisis reveló una serie de redes putativos y categorías funcionales asociadas. Las 10 redes putativos con las puntuaciones más altas se enumeran en la Tabla S1 y sus funciones asociadas se ilustran en la figura S2.
Como era de esperar, los genes implicados en las funciones relacionadas con la carcinogénesis, tales como el crecimiento celular y la proliferación, el cáncer, la muerte celular y la replicación de ADN y repare fueron enriquecidos, proporcionando confianza en nuestros resultados. También se encontró que los genes que participan en la respuesta inflamatoria, respuesta inmune mediada por células, enfermedad infecciosa, enfermedad inflamatoria y enfermedad inmunológica también estaban presentes en números significativos. Curiosamente, se observó una significativa abundancia de genes implicados en el desarrollo y trastornos del sistema esquelético /muscular, (Figura S2).
El examen de los genes enriquecido reveló varias redes importantes de señalización (Tabla S1), el más llamativo de los cuales mostró la activación predominante de la
Myc
, una de las firmas oncogénicos (Figura 3).
Myc
formado el eje principal de la red de genes, con la más alta conectividad con el resto de los genes en la red, lo que sugiere que
Myc
podría ser un factor crítico molecular tanto en la carcinogénesis inducida por BBN y la prevención del cáncer inducido por la nicotinamida. Muchos de los genes de satélite conectados a
Myc gratis (es decir,
MSH6
[
MSH6
],
METAP2
[
Metap2
] ,
LMNB1
[
LMNB1
],
hK2
[
hK2
],
PPAT
[
PPAT
],
PGK1
[
PGK1
],
CCT2
[
Cct2
], y
PMP22
[
PMP22
]) (Figura 3) participar en la tumorigénesis, la proliferación celular, el crecimiento celular, o apoptosis, que corresponden a las actividades más conocidas de
Myc
. Estos hallazgos indican fuertemente que la función oncogénica de la
Myc
y sus genes asociados puede regularse mediante tratamiento nicotinamida para prevenir la carcinogénesis de la vejiga.
arriba y hacia abajo de los genes regulados en los cánceres de vejiga del ratón son se indica en rojo y verde, respectivamente. La intensidad del color es indicativo del grado de expresión excesiva o insuficiente. Genes sin color resaltado no son parte de la firma progresión, pero están asociados con los genes regulados. Cada línea y la flecha representa las interacciones funcionales y físicas entre los genes y la dirección de la regulación descrita en la literatura.
Validación de la
Myc
firma para la prevención del cáncer de nicotinamida
para validar nuestra firma la expresión génica recientemente identificado para la prevención del cáncer mediante la nicotinamida, que, además, realizaron análisis de expresión de genes y proteínas expresión. Entre los genes de la
Myc
identificado por la firma de análisis de redes de genes (Figura 3),
Myc
como un oncogén concentrador primario y
PMP22
como un gen suprimido-tumor que ha elegido fueron la intensidad de señal más fuerte para la validación, y los resultados se presentan en la Tabla 1 y la Figura 4.
inversa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) se realizó un análisis de
Myc
(A) y
PMP22 gratis (B). Las diferencias (
P valores
) entre los grupos de ratones se obtuvieron mediante la muestra de dos t-test. El eje Y indica (ratio de expresión de cada gen /
Gapdh
) × 1000. El análisis inmunohistoquímico de Myc (C) y PMP22 (D) se llevó a cabo para confirmar los niveles de expresión de proteínas. La detección de Myc (E) y la expresión de la proteína PMP22 (F) también se determinó mediante análisis de transferencia Western. Análisis de la expresión génica
primer lugar, realizó por RT-PCR. Los niveles de expresión de
Hoteles en Myc grupo de cáncer de vejiga inducida por BBN fueron significativamente más altos que los grupos de nicotinamida + tratados normal o BBN (
P Hotel & lt; 0,001 y P = 0,02 por dos t- muestra prueba, respectivamente, la Figura 4, A). Por otro lado, los niveles de expresión de
PMP22
en el grupo de cáncer de vejiga inducida por BBN se redujo significativamente en comparación con + nicotinamida grupos tratados normal o BBN (
P
= 0,02 y P = 0.03 por muestra de dos t-test, respectivamente, Figura 4, B).
Para determinar si la expresión génica firma hemos identificado de acuerdo con los niveles de expresión de proteínas, el análisis inmunohistoquímico se llevó a cabo. Hemos observado que Myc fue altamente expresado en el citoplasma de las células normales urotelio ratón, pero no se expresó en el núcleo. Myc fue localizada principalmente en el núcleo de las células tumorales en el tumor de vejiga de ratón inducido-BBN. Ambos se observó una nuclear y una distribución citoplasmática de Myc; sin embargo, el número de núcleos Myc-positivas en el urotelio ratón tratado con BBN y nicotinamida fue significativamente menor que en el tumor de vejiga inducida por BBN, y la intensidad de la tinción citoplásmica de Myc en ninguno de los grupos BBN era más débil que en urotelio normal (figura 4, C y Tabla 1). También se encontró que PMP22 se distribuyó en el citoplasma de urotelio normal de ratón, mientras que no hubo evidencia de expresión ya sea citoplasmática o nuclear de PMP22 en el tumor de vejiga de ratón inducido-BBN. En la BBN + urotelio nicotinamida-tratada, se observó la expresión citoplasmática PMP22; Sin embargo, el nivel de expresión de PMP22 se redujo en relación a la de urotelio normal (Figura 4, D y Tabla 1).
También realizaron transferencias Western de Myc y PMP22 para verificar rigurosamente nuestro análisis de perfiles de expresión génica. En el análisis de transferencia de western, Myc fue altamente expresado en el grupo de tumores de vejiga de ratón inducido-BBN en comparación a la normalidad y el grupo de la vejiga BBN + nicotinamida-tratado no tumorigénicos, pero Myc expresión no mostró ninguna diferencia entre normal y el BBN + nicotinamide- grupo tratado con la vejiga no tumorigénicos. Por otro lado, el nivel de expresión de PMP22 en el grupo normal de la vejiga fue significativamente mayor que en el grupo de tumores de vejiga de ratón inducido-BBN. Aunque se observó la expresión de PMP22 en el grupo de vejiga BBN + nicotinamida-tratado no tumorigénicos, el nivel de expresión de PMP22 se redujo en relación a la de la normal. Estos resultados indican que los cambios en los niveles de expresión de proteínas de la
Myc
y sus genes asociados de acuerdo bien con los cambios en los niveles de expresión de genes revelados por el análisis de microarrays. Los resultados también proporcionan una fuerte evidencia de la fiabilidad de la identificación de genes de expresión firma.
Comparación de la expresión génica entre los cánceres de vejiga humano y el ratón
Teniendo en cuenta los tres subgrupos distintos del modelo de ratón experimental, se examinaron la efectividad de estos modelos recapitulan fenotipos de cáncer de vejiga humanos definidos por patrones de expresión génica. Debido a que dos diferentes plataformas de microarrays se utilizaron para estudiar el ratón y el cáncer de vejiga humana (cohorte de Corea), se seleccionaron los genes homólogos que estaban presentes en ambos utilizando microarrays HomoloGene, que proporcionó información sobre el ratón homóloga y los genes humanos. Un total de 11.565 genes homólogos estaban presentes en ambas microarrays. En el análisis de agrupamiento jerárquico de los datos integrados, los tres subgrupos estaban bien separados unos de otros (Figura 5). A excepción de una sola muestra de ratón, los patrones de expresión génica de la vejiga en ratones normales y + ratones nicotinamida tratados BBN fueron muy similares a los de la mucosa o los cánceres de la mucosa circundante (adyacente a) normal en el humano (grupo I en la Figura 5). En contraste, los patrones de expresión de los cánceres de vejiga del ratón del grupo de tumor inducida por BBN fueron muy similares a los de MIBCs en humanos (Grupo III de la Figura 5).
Los genes con valores de expresión que tenían una desviación estándar de al menos 0,9 fueron seleccionados para el análisis jerárquico (1,059 características de genes). Los colores rojos y verdes reflejan niveles altos y bajos de expresión, respectivamente. BBN, Carolina del Norte, CVNMI, y MIBC indican N-butil-N- (4-hidroxibutil) -nitrosamine, nicotinamida, no músculo invasivo cáncer de vejiga y cáncer de vejiga invasivo muscular, respectivamente.
junto aplicado métodos de aprendizaje supervisado para validar el análisis de agrupamiento no supervisado. Se aplicaron cuatro métodos de predicción independientes para determinar cuál de los modelos de ratón podría imitar mejor los fenotipos humanos. Se utilizaron los conjuntos de datos de expresión génica de las dos subclases de vejigas humanas para formar a los métodos de predicción (Normal vs. MIBC, CVNMI vs. MIBC y Normal vs. CVNMI). Todos los métodos de predicción predice que la nicotinamida tratados con vejigas más normales y BBN + de ratón son relativamente similares a la mucosa o mucosa circundante (adyacente a) cánceres en humano normal, mientras que inducidos por BBN cánceres de vejiga del ratón son relativamente similares a MIBC en humanos (Tabla 2) . Además, cuando se aplicó métodos de predicción entrenados con NMIBCs y MIBCs, se observó que todos los cánceres de vejiga de ratón inducidos por BBN se predijo como MIBC (Tabla 2). Además, cuando la aplicación de métodos de predicción entrenados con normal y NMIBCs, la mayoría de nicotinamida + tratados con vejigas de ratón BBN eran relativamente similar a la mucosa o mucosa circundante (adyacente a) casos de cáncer en humanos (Tabla 2) normal.