Extracto
Antecedentes
diagnóstico y tratamiento del cáncer de vejiga urinaria (AC) actual ha demostrado un gran progreso con la utilización de microarrays .
Aplicaciones
Nuestro objetivo fue identificar los genes expresados diferencialmente comunes (dE) entre las subclases clínicamente relevantes de BC utilizando microarrays.
Metodología /Principales conclusiones
BC muestras y controles, conjuntos de datos experimentales y disponibles al público, se analizaron mediante microarrays de todo el genoma. Se agruparon las muestras de acuerdo con su histología y definido los genes DE en cada muestra individual, así como en cada grupo tumoral. Una estrategia doble análisis fue seguido. En primer lugar, se analizaron muestras experimentales y se formularon conclusiones; y en segundo lugar, los juegos de experimentos se combinaron con microarrays de datos disponibles al público y se analizaron adicionalmente en busca de genes comunes DE. El conjunto de datos experimentales identificado 831 genes que estaban DE en todas las muestras tumorales, de forma simultánea. Por otra parte, 33 fueron de genes regulados y 85 genes se redujeron reguladas en las 10 muestras de BC en comparación con los tejidos normales 5, de forma simultánea. La agrupación jerárquica repartió tumor grupos de acuerdo con su histología. K-significa la agrupación de todos los genes y todas las muestras, así como la agrupación de los grupos tumorales, presentado 49 clusters. K-means agrupación de los genes comunes en todas las muestras DE reveló 24 grupos. Los genes que manifiestan diversos patrones diferenciales de expresión, basado en PCA. YY1 y NFkB fueron algunos de los factores de transcripción más comunes que regulan la expresión de los genes identificados DE. Cromosoma 1 contenía 32 DE genes, seguidas de los cromosomas 2 y 11, que contenían 25 y 23 DE genes, respectivamente. Cromosoma 21 tuvo el menor número de genes DE. GO análisis reveló que la prevalencia del transporte y los genes de unión en los genes comunes DE-regulado; la prevalencia de metabolismo del RNA y de procesamiento de los genes en los genes regulados de; así como la prevalencia de los genes responsables de la comunicación celular y transducción de señales en los genes DE que se redujeron reguladas en T1-tumores de grado III y hasta reguladas en T2 /T3-tumores de grado III. Combinación de muestras de todas las plataformas de microarrays reveló 17 genes comunes DE, (BMP4, CRYGD, DBH, GJB1, KRT83, MPZ, NHLH1, TACR3, ACTC1, MFAP4, SPARCL1, TAGLN, TPM2, Cdc20, LHCGR, TM9SF1 y HCCS) 4 de que participan en numerosas vías.
Conclusiones /Importancia
la identificación de los genes dE comunes entre BC muestras de diferente histología puede proporcionar más información sobre el descubrimiento de nuevos marcadores putativos.
Visto: Zaravinos a, Lambrou GI, Boulalas I, Delakas D, Spandidos DA (2011) identificación de genes expresados diferencialmente común en urinaria cáncer de vejiga. PLoS ONE 6 (4): e18135. doi: 10.1371 /journal.pone.0018135
Editor: Michael Polymenis, Texas A & amp; M University, Estados Unidos de América
Recibido: 9 de septiembre de 2010; Aceptado: February 26, 2011; Publicado: 4 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Zaravinos et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El Departamento de Urología, hospital general Asklipieio, 16673 Voula, Atenas, Grecia financió el presente estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de la vejiga urinaria (BC) es el quinto cáncer más común en los hombres. El pico de prevalencia de la enfermedad se encuentra entre los pacientes de 60-70 años de edad. BC es curable si se diagnostica en las primeras etapas de la enfermedad. Los tumores de la vejiga urinaria se desarrollan a través de dos vías diferentes, pero algo superpuestos: el papilar y no papilar. Aproximadamente el 80% de los BC consisten en lesiones papilares exofíticos superficiales que se originan de la hiperplasia urotelial. Estos tumores papilares generalmente de bajo grado pueden reaparecer, pero rara vez invadir la pared de la vejiga o metástasis. El 15-20% restante de los tumores sólidos representan chalecos de alta calidad no papilares que surgen de la neoplasia intraurotelial de alto grado. Estos tumores invadir agresivamente la pared de la vejiga y tienen una alta propensión a la metástasis a distancia [1].
Control de la expresión de genes en paralelo es una poderosa herramienta para el análisis de las relaciones entre los tumores de vejiga, el descubrimiento de nuevos subgrupos de tumores, la asignación de los tumores de comprobar la validez clases -definida, la identificación de co-regulados o tumorales genes específicos de la etapa y la predicción del resultado de la enfermedad [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Hasta la fecha, mucho esfuerzo se ha gastado con el fin de identificar los genes que muestran expresión diferencial (DE) entre los diversos tipos de tumores en comparación con otros grupos de tejido, como el tejido fenotípicamente normal. Sin embargo, los genes DE reportados varían entre los diferentes grupos de estudio, dependiendo de la metodología basada en microarrays y el número de casos. Una cuestión intrigante que no ha sido contemplado hasta el momento implica posible de datos que se puede obtener con respecto a los genes que son expresados diferencialmente de forma simultánea en todos los casos de tumores estudio.
En el presente estudio, se realizó un análisis de microarrays de ADNc, que comprende in- experimental de casa, así como los datos disponibles públicamente, para analizar el perfil de expresión génica de aC y para determinar los genes dE entre el cáncer y el tejido sano. La detección de genes DE se realizó en cada muestra individual, así como en cada grupo de tumor, tal como se define por examen histológico y presentado datos. Los datos fueron agrupados con diferentes algoritmos y funciones de los genes DE conocidos se definen con más detalle por Gene Ontología. Además, no sólo se realizaron búsquedas en las diferencias entre los tipos de tumores, sino más bien en busca de similitudes. La razón de este enfoque es que, si bien se espera que los diferentes tipos de tumores que tienen diferencias en sus perfiles de expresión incluso entre individuos con el mismo subtipo de tumor, la hipótesis de que los tumores poseen características similares que eventualmente puede conducir al conocimiento de la etiología de la carcinogénesis. En un trabajo significativo por
Goldstein et al.
Un intento de detectar una célula común del origen de los cánceres de próstata se informó. Dieron a entender que, a pesar de las diferencias que las células tumorales comparten, existe la posibilidad de un origen común [9]. En el mismo sentido hemos intentado identificar perfiles de expresión génica común entre los diferentes tejidos tumorales. En este punto hay que destacar que la expresión génica, en particular a partir de biopsias de tumores, representa literalmente un "snap-shot" del espacio de estado del comportamiento de otro modo dinámico de la enfermedad. Sin embargo, este "snap-shot" podría ser adecuada con el fin de obtener información útil sobre la dinámica del sistema de estudio. Particularmente en el caso de los tumores, es la única herramienta que tenemos con el fin de extraer información en el
ex vivo
nivel.
Los datos actuales apoyan el valor de microarrays basada en la expresión génica firmas ya que estos identificar clínicamente importantes propiedades celulares.
Materiales y Métodos
Toma de muestras de tejido tumoral y el procedimiento quirúrgico
Diez especímenes de cáncer de vejiga urinaria de los pacientes con diagnóstico reciente de chalecos sometidos transuretral de la vejiga la resección en el Departamento de Urología, hospital "Asklipieio" general, Atenas, así como cinco muestras de tejido normal, fueron adquiridos después de la cantidad de tejido necesaria para un examen rutinario de patología había sido eliminado. Los pacientes estudiados eran de edad avanzada (73,9 ± 12,0 años). La mayoría (6/10, 60%) eran fumadores o ex-fumadores, mientras que cuatro (40%) se caracterizaban por un cierto nivel de exposición ocupacional a agentes asociados con BC (pinturas, productos químicos, etc.). Todas las muestras tumorales fueron clasificados y clasificados por el mismo patólogo. clasificación histológica se realizó utilizando tanto la Organización Mundial de la Salud 1973 (OMS) y la OMS Sociedad 2004 /Internacional de Patología Urológica (ISUP) las clasificaciones [1]. El estadio tumoral se evaluó de acuerdo con el Comité Conjunto sobre el Cáncer sistema de estadificación 2002 [10]. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes incluidos en este estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Creta. Los criterios de elegibilidad utilizados fueron disecados electiva chalecos primarios y la disponibilidad de ADN a partir de tejido normal y tumoral para el análisis biomoleculares. Los criterios de exclusión fueron los antecedentes de neoplasias previas y la quimioterapia o la radioterapia antes de la cirugía
Se obtuvieron muestras de tejido durante la cirugía del tumor y los siguientes tres sitios seleccionados macroscópicamente normal (biopsia con pinza fría):. pared posterior, trígono , y el área adyacente al tumor. Partes de las muestras normales disecados fueron enviados para su análisis histopatológico. Tejidos tumorales y normales se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido, transportados y almacenados a -80 ° C hasta la extracción de ADN.
Los pacientes con BC no músculo invasivo fueron seguidos con exámenes periódicos y cistoscópicas tratamiento intravesical como se indica. Los pacientes con BC invasivas se les ofreció la cistectomía radical con o sin quimioterapia sistémica.
La inmunohistoquímica
Secciones, 3 mm de espesor, de, tejido incluido en parafina y fijado en formalina se cortaron y se colocaron en portaobjetos recubiertos con 3-aminopropyltriethoxysilone. Los portaobjetos se seca a 56 ° C durante 1 h antes de la tinción inmunohistoquímica. Las secciones de tejido se desparafinaron en xileno antes de la rehidratación en alcoholes graduados, y la actividad de peroxidasa endógena se bloqueó por tratamiento con 3% de H
2O
2 a temperatura ambiente durante 15 min. desenmascaramiento de antígenos se realizó por 30 min de incubación a 80 ° C en 10 mM citrato trisódico (pH 6,1). La inmunotinción y la revelación se realizaron en un automatice Dako. Los portaobjetos se incubó a temperatura ambiente con anticuerpos de cabra policlonales primarios contra anti-ErbB2 (1:800; Dako), ciclina D1 (1:100; SP4; Epitomics), anticuerpo monoclonal contra anti-p53 (1:250; E26; Epitomics) y el anticuerpo monoclonal contra el anti-Ki-67 (1:100; SP6; Epitomics). Los epítopos del anticuerpo primario se localizaron por técnica de inmunoperoxidasa usando el kit de anticuerpo secundario complejo avidina-biotina y peroxidasa sustrato (kit 5001, Dako), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secciones fueron tratados con Chromagen tetrahidrocloruro 30-30 diaminobencideno para identificar los sitios de inmunoprecipitación con el microscopio óptico. Por último, las secciones se lavaron, por contraste con hematoxilina y se montaron bajo cubreobjetos. No se observó tinción específica cuando el anticuerpo primario se omitió el protocolo (control negativo). La especificidad de la inmunotinción fue controlado adicionalmente por tinción simultánea de muestras de cáncer de mama con ErbB2 conocida, ciclina D1, p53 y los patrones de expresión de Ki67. Un patólogo experimentado anotó la intensidad de la tinción en cuatro niveles (negativos, débiles, moderadas y fuertes), teniendo en cuenta tanto la intensidad del color y el número de células teñidas.
Microarray La experimentación y la inclusión de los microarrays de datos disponibles al público
chips de oligos de microarrays (~57 k genes) se obtuvieron de GE Healthcare (IL) y AppliedMicroarrays (MA) (ex Amersham Biosciences) (CodeLink 57 k del genoma humano completo) [11], [12], [13]. La hibridación se realizó con el kit de amplificación de RNA y Etiquetado CodeLink como se describe por el fabricante, utilizando el colorante fluorescente Cy5. Las láminas fueron escaneados con un escáner de microarrays (ScanArray 4000XL). Las imágenes fueron generadas con el software de adquisición de ScanArray microarrays (GSI Lumonics, EE.UU.). ARNc de tres montajes experimentales se utilizaron en los experimentos individuales con picos internos como controles. Los montajes experimentales consistieron en 10 BC muestras urinarias de diferente histología (véase el muestreo de tejidos y la sección Procedimiento quirúrgico) y 5 muestras de control. Las imágenes escaneadas se procesaron con el software v5.0 Análisis de Expresión CodeLink de Amersham Biosciences (actualmente GE Health Care Inc.). El montaje experimental se analizó basa en la referencia de diseño como se describe anteriormente [14], [15], [16] tal como se presenta en la Figura S1 A. Todas las muestras tumorales fueron comparados contra el valor medio de las muestras de control. se dispone de datos de microarrays en bruto en la base de datos de microarrays GEO. Todos los datos de microarrays MIAME cumplen
Con el fin de ampliar el número de muestras BC bajo investigación, se incluyeron los siguientes conjuntos de datos disponibles públicamente en nuestro análisis de microarrays:. 1) GSE89 conjunto de datos (GDS183) [17], que constan de 40 muestras BC; 2) GSE3167 conjunto de datos (GDS1479) [18], compuesto por 60 muestras (9 controles y 51 muestras antes de Cristo); 3) GSE7476 conjunto de datos [19], compuesto por 12 muestras (3 controles y 9 muestras BC) y 4) GSE12630 conjunto de datos [20], compuesto por 19 muestras antes de Cristo. En total, nuestro análisis de microarrays agrupado se compone de 17 muestras de control (n = 5, para la plataforma CodeLink; y n = 12, para las plataformas restantes de microarrays) y 129 muestras de BC (n = 10, para la plataforma CodeLink; y n = 119, para las restantes plataformas de microarrays). Los datos públicos se utilizaron en su forma normalizada disponible, ya que ya se habían realizado la corrección de fondo y la normalización.
procesamiento de datos de microarrays
microarrays de datos de filtrado y Corrección de fondo de la Plataforma CodeLink.
el filtrado se realiza en base a la intensidad de la señal y en el criterio de si esta señal está por encima de un cierto nivel. En nuestro análisis, el filtrado se llevó a cabo utilizando la ecuación:, donde S es la intensidad de la señal medida, B
L es el fondo local medida y σ
BL es la desviación estándar del fondo local. Las señales con una intensidad más baja que la anterior medida, obtienen una bandera. Corrección de fondo se realizó restando el fondo mundial mediano desde el fondo local de la mediana de la intensidad de la señal. Un umbral de 2 se establece como límite, lo que significa que la intensidad lugar para al menos un canal debe ser el doble que la del fondo.
Normalización de datos de microarrays de la Plataforma CodeLink.
Microarray datos se normalizaron por el procedimiento por defecto del software CodeLink, es decir, las intensidades de terreno fueron divididos por la mediana mundial (normalización mundial mediana) [13]. Se extrajeron los datos normalizados, pre-procesado y ordenadas con Microsoft Excel ®. Para más análisis de datos se utilizó el Matlab ® (The MathWorks Inc.) entorno informático. Los datos fueron examinados por su patrón de distribución para su posterior elección del método de prueba estadística.
microarrays de datos cruzada Normalización.
Microarray datos fueron cruzada normalizada, utilizando un algoritmo de cuantil, con el fin de cuenta el sesgo que se incluyó debido a la experimentación, y diferentes plataformas de muestreo diferente (Figura S2). La normalización de los datos de plataforma cruzada se ha descrito anteriormente [21], [22], [23] con muy buenas correlaciones y la coherencia entre las plataformas CodeLink y Affymetrix [24], [25].
Creación de un Común lista de genes y Grupos aC
con el fin de garantizar que los resultados de nuestro análisis fueron comparables, hemos creado una lista de genes comunes entre todas las plataformas de microarrays. Para este propósito, se utilizó el número NCBI Gene ID como referencia común. Después de la comparación de los genes DE entre todos los conjuntos de datos, sólo se seleccionaron los presentes en todas las plataformas para el análisis adicional. En total, este enfoque filtrado se obtuvo un conjunto de genes de 11.837 registros únicos, presentes simultáneamente en todas las plataformas de microarrays. Los conjuntos de datos se utilizaron como muestras individuales, así como en los grupos tumorales. La distribución de los grupos se presenta en la Tabla S1.
Estadísticas Los datos de microarrays para la plataforma CodeLink y la disponibilidad pública de datos de microarrays
En lo que respecta a la plataforma CodeLink, nuestro enfoque consistió en la siguiente metodología. Cada gen se ensayó para determinar su importancia en la expresión diferencial usando una prueba z. Los genes fueron considerados para ser significativamente expresados diferencialmente si obtuvieron un valor de p & lt; 0,05. Se hicieron comparaciones tanto entre los experimentos, así como en los experimentos. A continuación se utilizó la manipulación establecer con el fin de descubrir nuevos subconjuntos que caracterizarían, si es posible, todas las muestras tumorales. . Para más análisis se utilizaron los genes que son expresados diferencialmente entre las muestras tumorales
En cuanto a la comparación entre los genes de todos los microarrays de datos disponibles, se utilizó la siguiente metodología:
En primer lugar, se realizaron búsquedas las diferencias, la comparación de todas las muestras de control (considerados como un solo grupo), en contra de todas las muestras tumorales (considerados como otro grupo), usando una prueba T para dos muestras de dos colas. Dado que estos grupos contenían muestras que variaron en el origen étnico y el grado del tumor, controlamos todo sesgo mediante la comparación de ellos como grupos unificados.
En segundo lugar, nos separamos en grupos de muestras (11 grupos en total) (Tabla S1), y cada grupo se comparó contra todas las muestras de control, usando una prueba T para dos muestras de dos colas.
en tercer lugar, se compararon las muestras de forma individual para los genes significativas entre cada experimento, utilizando una prueba z de dos colas, que es se hace referencia como "intra-experimental". Este tipo de comparación tenía una particularidad. Dado que la expresión de los genes se comparó con la media de la expresión de genes dentro del mismo experimento, los genes DE significarían la diferencia de que cada muestra de tejido expuesto en comparación con los tejidos normales. Esto significa que los genes comunes entre ellos serían aquellos genes que son comunes en el tejido tumoral.
Se compararon las muestras de forma individual para genes importantes, es decir, las proporciones de genes, entre montajes experimentales, utilizando una prueba z de dos colas, la cual nos referimos como "inter-experimental". En otras palabras, se realizaron búsquedas de genes que exhiben una expresión diferente de una muestra a la siguiente, pero no en contra de las muestras de control. Curiosamente, los genes importantes derivan de estos genes incluidos que no estaban DE. En otras palabras, se identificaron estos genes entre aquellos cuya expresión sigue siendo el mismo en todas las muestras.
Con el fin de identificar los genes expresados diferencialmente, se utilizaron dos métodos. Los genes fueron considerados para ser significativamente expresados diferencialmente si obtuvieron un valor de p & lt; 0,05. Se hicieron comparaciones tanto entre los experimentos, así como en los experimentos. A continuación se utilizó la manipulación establecer con el fin de descubrir nuevos subconjuntos que caracterizarían, si es posible, todas las muestras tumorales. Para profundizar el análisis se utilizaron los genes que son expresados diferencialmente entre las muestras tumorales, en base a la necesidad de usar. En el caso en el que se compararon grupos de la muestra, la media de cada gen fue tomada en contra de la media de todas las muestras de control. En el caso de las comparaciones individuales de muestras, las proporciones de genes se calcularon en contra de la media de todas las muestras de control.
Tasa de Falso Descubrimiento (FDR)
La Tasa de Falso Descubrimiento se calculó como se describe anteriormente [26 ], [27], [28].
análisis de la agregación
la agrupación de análisis se realizó con el algoritmo de k-medias. En total, 81 grupos de la base de datos completa de la plataforma CodeLink y 100 grupos para todos los conjuntos de datos disponibles, se formaron y DE genes se clasifican además siguiendo dos vías (genes-contra-muestras)-vinculación media de la agrupación jerárquica con la distancia euclidiana [29 ]. La agrupación de análisis y cartografía de los cromosomas fueron en parte realizado con Génesis 1.7.2 (Universidad Técnica-Graz, Austria) mediante la correlación de Pearson (
r
) y la correlación de orden de rangos de Spearman (
ρ
) [30 ], [31], [32].
Análisis TFBM
con el fin de identificar los factores de transcripción que impulsan los cambios observados en la expresión génica, se determinó el factor de transcripción vinculante motivos (TFBMs) en el Transcripción de elemento de base de datos del sistema de escucha (Telis) (www.telis.ucla.edu) [33]. La base de datos TRANSFAC factor de transcripción se utilizó para la identificación de sitios de unión de factor de transcripción de genes [34].
mapeo de cromosomas
El mapeo cromosómico parece ser un método prometedor para la identificación de patrones entre los genes. La idea principal reportado inicialmente por
Cohen et al
. es mapear genes en regiones cromosómicas y de esta manera si existen correlaciones que aparecen a través de la localización de los genes en las regiones cromosómicas, ya que los genes consecutivos a menudo se expresan de manera similar [30]. Para el análisis de cartografía de los cromosomas, se utilizó la herramienta web de ontología de genes árbol de la máquina, WebGestalt (Universidad de Vanderbilt, Países Bajos, http://bioinfo.vanderbilt.edu/gotm/) [35] y el Matlab ® (The MathWorks Inc.) entorno informático.
gene Ontología (GO) análisis
gene Ontología (GO) el análisis se llevó a cabo inicialmente utilizando la herramienta en línea para Egon ontología de genes (la Universidad Noruega de Ciencia y Tecnología, Trondheim, Noruega , http://www.genetools.microarray.ntnu.no/egon/) a fin de encontrar que faltan los símbolos de genes [36]. WebGestalt web-herramienta (Universidad Vanderbilt, Países Bajos, http://bioinfo.vanderbilt.edu/gotm/) [35], [37] se utilizó para las clasificaciones de la función génica. Las relaciones de los genes expresados diferencialmente y los motivos de unión del factor de transcripción se investigaron adicionalmente utilizando la base de datos PubGene Ontología (www.pubgene.org). definiciones y funciones de los genes se basaron en el Instituto Nacional de Salud bases de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/).
GEO números de adhesión
Array los datos fueron depositados en el gene Expression Omnibus (Centro Nacional de Información Biotecnológica) con los números de acceso a través de GSM678186 GSM678385 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448).
Results
Immunohistochemistry
Tumor Las muestras fueron teñidas con anticuerpos para ErbB2, ciclina D1, p53 y Ki-67. Si está presente, la tinción anti-ErbB2 en muestras de tumores es una tinción de membrana, difusa en el urotelio (Figura 1). Todas las muestras de CTP (100%) mostraron inmunotinción moderada /fuerte (++, +++), mientras que no muestra TCC no mostró la inmunotinción /débil (0, +). Los umbrales para los altos índices de etiquetado se establecieron para Ki-67 en núcleos tumorales positivas ≥10% y para p53 en el 10 y el 20%. T1 /2-tumores de grado III exhibieron la inmunotinción más fuerte (+++, & gt; 70%). T1-grado I /II tumores mostró tinción débil para anti-Ki-67 (40% y 7,5%, respectivamente), mientras que los tumores T1 /2-Grade III exhibieron la inmunotinción más fuerte (54%). De manera similar, los tumores T1-grado I /II mostraron tinción débil para anti-p53 (10% y 35%, respectivamente), mientras que T1 /2-tumores de grado III exhibieron la inmunotinción más fuerte (53%). Por otra parte, los tumores T1-de grado I /II mostraron tinción intensa para anti-Ciclina D1 (80% y 80%, respectivamente), mientras que T1 /2-tumores de grado III mostraron inmunotinción débil (31,8%).
por otro lado, los tumores T1-Grado II mostró una intensa tinción de anti-ciclina D1 (80%), mientras que T1-tumores de grado III mostraron inmunotinción débil. Representante H & amp; E diapositivas denotan la histología de T1-Grado II, T1-T2 y Grado III-tumores de grado III
Distribución CodeLink Plataforma de Datos y Análisis
Se investigaron datos de microarrays. por su propiedad distribución normal. Los datos normalizados seguían una distribución normal como se presenta en la Figura S1B y S1C. estadísticas de la prueba Z se han aplicado sobre los datos, tanto en muestras individuales, así como en los grupos tumorales. En el caso de grupos de tumores, genes que obtuvieron un valor de p & lt; 0,05 se consideraron expresados diferencialmente. En la Figura S3 A-C se presenta la distribución de los valores de p. FDR se calculó como se informó anteriormente [27], [28]. FDR se calculó en un 9,3% para un valor de p & lt; 0,05 para los tumores de la T1-Grado del grupo II, el 8,6% de valor de p & lt; 0,05 para los tumores del grupo T1-Grado III y 11.03% para el valor de p & lt; 0,05 para los tumores del grupo T2 y T3-Grado III (Figura S3D-F). El mismo procedimiento se siguió para cada muestra individual. Los genes se representan en la caja de parcelas con el fin de examinar las distribuciones de expresión en más detalle. Caja de parcelas de grupos tumorales, así como los de las muestras individuales se representan en la figura S4A y la Figura S4B, respectivamente
Análisis de los genes expresados diferencialmente Común: Plataforma. CodeLink
Con el fin de identificar los genes patrones de expresión en BC urinaria, que además analiza nuestros datos de microarrays de tal manera que se identificaron patrones comunes de expresión entre las diferentes muestras. Nos hemos centrado nuestro análisis, no sólo en las diferencias entre las muestras de tumor, sino también en sus similitudes. No era sorprendente que existían tales similitudes. Las intersecciones de las muestras tumorales individuales reveló 831 genes que son expresados diferencialmente de forma simultánea en todas las muestras tumorales (ya sea arriba o abajo-regulados). De estos genes DE, hemos identificado 33 genes con una mayor expresión simultánea y 85 genes con simultánea disminución de la expresión en todas las muestras antes de Cristo, en comparación con el tejido normal.
Entre los genes regulados, los que presentan la más alta expresión de plegado ( media ± DE) fueron: proteína inducible por hipoxia 2 (HIG2; NM_013332.1) (2,70 ± 0,54); APC11 promotor de la anafase subunidad complejo 11 (ANAPC11; NM_001002245.1) (2,50 ± 0,60); zo54e12s1 Stratagene páncreas (# 937208) IMAGEN clon de ADNc: 590734 3 'similar a TR: G1022718 G1022718 RECEPTOR NUCLEAR co-represor (NCoR1; AA156336.1) (2,01 ± 1,13); IU-1-BB1p-ATP-e-01-0-UIs1 NCI_CGAP_Pl6 clon de ADNc de IU-1-BB1p-ATP-e-01-0-UI 3 ', (BU754189; BU754189.1) (1,89 ± 0,56). Del mismo modo, los genes que exhiben las tasas más bajas de expresión veces (media ± DE) fueron: tn52a12.x1 NCI_CGAP_Kid11 cDNA clon IMAGEN: 2171998 3 'similar a contiene PTR5.b2 MER22 elemento repetitivo (AI565993; AI565993.1) (-3,13 ± 0,66 ); zx51b02r1 Soares_testis_NHT clon de cDNA IMAGEN: 795723 5 '(AA461577; AA461577.1) (-2.75 ± 0.86); lactotransferrina (LTF) (ANKRD29; NM_173505.2) (-2,28 ± 1,17); HUMNK566 humano clon de cDNA de queratinocitos epidérmicos 566 (ODZ2; D29453.1) (-2,15 ± 1,02); de necrosis tumoral superfamilia del receptor del factor, miembro 17 (TNFRSF17) (TNFRSF17; NM_001192.2) (-2,07 ± 0,73); y el músculo esquelético en proteínas LIM FHL1 ARNm (FHL1; U60115.1). (-2.06 ± 0.87)
En cuanto a los tres grupos de tumores (T1-Grado II, T1-Grado III y T2 /T3-Grado III ), nuestro análisis no mostró un subconjunto de genes comunes a todos los grupos. Por lo tanto, hemos investigado los genes comunes DE entre pares de grupos tumorales (cuadros S2, S3, S4). DE genes comunes a todos los individuos independientemente del grupo de tumores, se agruparon adicionalmente utilizando la agrupación jerárquica con la distancia euclídea. Grupos de genes comunes en varias combinaciones se presentan en la Tabla S5
La agrupación jerárquica con la distancia euclídea:.. Plataforma CodeLink
Se realizó bidireccional-vinculación media de la agrupación jerárquica con la distancia euclidiana de ~57 k genes. Una vista detallada del dendrograma agrupación de la muestra se muestra en la Figura 2. Hemos dividido los tumores en dos grupos principales y varios subgrupos en base a la expresión diferencial de su genoma. La primera rama contenía un tumor T1-Grado II y el otro contenía tumores T1-3 de grado II /III, que fueron agrupados en subgrupos adicionales
K-means clustering:. Plataforma CodeLink.
K-means algoritmo de agrupamiento es otra forma de clasificar los datos con el fin de encontrar patrones de expresión. Nuestro análisis se organiza de la siguiente manera:
k-medias de todos los genes y de todas las muestras. El resultado de la agrupación de k-medias de todos los genes y todas las muestras se presenta en la Figura 3A. Hemos agrupado los datos en 49 grupos, junto con sus centroides (Figura 3B). Para cada grupo de clústeres había varios genes que caracterizan el cluster es decir, caracteriza la muestra que los genes pertenecían.
k-medias de genes comunes DE en todas las muestras. Se fomentó agruparon los genes DE comunes entre todas las muestras (Figura 4A y 4B).
k-medias de los grupos tumorales. Para concluir el análisis basado en k-means clustering los grupos tumorales se analizaron como se ha definido anteriormente. Los resultados se presentan en la Figura 5A y 5B para clúster y centroides, respectivamente. Las agrupaciones de grupos de tumores revelaron tanto las diferencias y similitudes entre los diferentes grupos. Por ejemplo, ciertas categorías de genes revelaron constitutiva regulación a la baja en un grupo de tumores frente al grupo de etapa superior /grado, mientras que otras categorías de genes mostraron constitutiva regulación entre los correspondientes grupos (grupos 11, 24, 27, 30, 33, 41, 46). Al mismo tiempo, varios grupos incluyen genes que permanecieron sin cambios entre los grupos tumorales (clusters 21, 26, 35, 37, 45, 47, 48).
K-means agrupación dio algunos patrones distintos entre las muestras , tal como en los grupos 1, 3, 4, 5, etc.
Clusters (a) y (B centroides) se presentan cuando hay distinción clara se puede hacer entre las muestras individuales.
Análisis de componentes Principales (PCA):. Plataforma CodeLink
PCA de todos los genes en todas las muestras. análisis de componentes principales de nuestros datos se llevó a cabo adicionalmente con el fin de buscar otros patrones potenciales entre los genes. El análisis inicial se realizó con los genes que son comúnmente De entre todas las muestras. componentes principales calculados se representaron frente a la otra en gráficos de dispersión tal como se presenta en la Figura 6. El análisis PCA de los genes se realizó con el fin de encontrar más patrones en los datos de expresión. Para llevar a cabo el presente análisis con todos los genes y en todas las muestras, el paso inicial era para trazar gráficos de dispersión de todas las combinaciones de los componentes principales (Figura 6A, B). Los genes manifiestan varios patrones como se indica en las áreas de círculos en la Figura 6B. A continuación, las muestras se examinaron para el porcentaje de varianza que atribuyeron a los principales componentes (Figura 6C, D). Finalmente, un biplot se construyó con el fin de examinar la muestra de clasificación con respecto a la expresión génica total (Figura 6E). Tal como se presenta en las áreas encerradas en círculo en la figura 6E, las muestras se agrupan en dos categorías principales: las muestras 22A (T2 /T3-Grado III), 27A (T1-Grado III) y 29A (T2 /T3-Grado III), por un lado, y el resto de las muestras se agruparon juntos. Con el fin de resolver más de las diferencias basadas en el análisis PCA se comparó la expresión de genes como sigue.
PCA de genes comunes DE en todas las muestras. análisis de componentes principales de los genes comunes DE se presenta en la Figura 7. Agrupación de las muestras basadas en componentes principales mostró diferentes clasificaciones. Las muestras tumorales 2A, 3A y 4A se agruparon distintivamente como por los tres primeros componentes principales (Figura 7E). Estas tres muestras se agrupan cuando el conjunto completo de datos se consideró. La resolución de este resultado con los genes comunes DE mostró una diferencia entre los grupos tumorales. Del mismo modo, varias agrupaciones diferentes se obtuvieron por análisis PCA de los genes DE comunes entre todas las muestras, tales como entre muestras de tumores 22A, 10A, muestras 2A, 4A, 16A que formaban una separada grupo y las muestras 3A, 17A, 26A, 27A, 29A que se formó otro (Figura 7F). Del mismo modo, el trazado de las muestras de componentes agrupados 3A y 16A, así como muestras 2A, 4A y 10A en un grupo separado.
PCA de los grupos tumorales.