Extracto
Aproximadamente 500.000 personas diagnosticadas con cáncer de vejiga en los EE.UU. requiere cistoscopia rutinaria de seguimiento para supervisar recidivas de la enfermedad o progresión, lo que resulta en más de $ 2 millones de dólares en gastos anuales. La identificación de nuevas estrategias diagnósticas y de seguimiento están claramente necesario, y marcadores relacionados con alteraciones de metilación del ADN, son muy apropiados debido a su estabilidad, la medición objetiva, y las asociaciones notoriamente con la enfermedad y con sus características clínicas. Para identificar nuevos marcadores epigenéticos de cáncer de vejiga agresivo, que utilizó un alto rendimiento de la metilación del ADN del grano-array en dos distintos serie basada en la población de la incidencia de cáncer de vejiga (n = 73 yn = 264, respectivamente). a continuación, se validó la asociación entre la metilación de estos locus candidato con el grado del tumor en una tercera población (n = 245) a través de pirosecuenciación bisulfito de loci candidatos. análisis basados matriz identificaron 5 loci para su posterior confirmación con bisulfito de pirosecuenciación. Se identificaron y confirmaron que el aumento de la metilación del promotor de
HOXB2
es significativa e independientemente asociada con el cáncer invasivo de la vejiga y la metilación de
HOXB2
,
KRT13
y
FRZB
juntos predecir significativamente la enfermedad no invasivo de alto grado. La metilación de estos genes puede ser útil como marcadores clínicos de la enfermedad y puede apuntar a los genes y las vías que requerían un examen adicional como nuevos objetivos para el tratamiento terapéutico
Visto:. Marsit CJ, Houseman EA, Christensen AC, L Gagne , Wrensch MR, Nelson HH, et al. (2010) Identificación de genes metilados asociado con el cáncer de vejiga agresivo. PLoS ONE 5 (8): e12334. doi: 10.1371 /journal.pone.0012334
Editor: Michael Freitag, Universidad Estatal de Oregón, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de mayo de 2010; Aceptado: July 29, 2010; Publicado: 23 Agosto 2010
Derechos de Autor © 2010 Marsit et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el asistente de vuelo Instituto de Investigación médica [052341 YCSA a CJM]; y los Institutos Nacionales de Salud [R01CA121147, K07CA102327, y P42ES007373]. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en los Estados Unidos en 2009, se estima que 71.000 cánceres de la vejiga urinaria fueron diagnosticados y más de 14.000 muertes fueron atribuidas a esta enfermedad [1]. La gran mayoría de las muertes se producen en pacientes con accidente etapa alta, de alto grado, los tumores invasivos que se infiltran en las capas musculares de la vejiga. De bajo grado, la enfermedad no invasiva, por el contrario, puede ser tratada con éxito, a pesar de este éxito se produce en gran carga económica para el sistema sanitario. Aproximadamente 500.000 pacientes requieren un seguimiento en los EE.UU. conduce a un diagnóstico estimado hasta la muerte por costos de los pacientes que van desde $ 96.000 $ 187.000, lo que resulta en $ 2.2 mil millones en gastos anuales, por lo que el cáncer de vejiga el más caro de todos los cánceres [2], [3]. Por lo tanto, las estrategias de pronóstico rentables para la evaluación de incidentes y la enfermedad recurrente serían de utilidad clínica significativa.
Control epigenético de la expresión del ADN es bien conocido para conducir la diferenciación del desarrollo fetal. En forma paralela, en concierto con los eventos genéticos (mutación, deleción y amplificación de genes) se cree que las alteraciones epigenéticas pueden precipitar importantes características patológicas de la degeneración maligna [4]. El cáncer de vejiga, con sus fenotipos clínicos (y patológicas) divergentes, presenta un modelo de tumor que pueden surgir por la inactivación de los loci que controlan de forma independiente la propensión a la invasión y, por lo tanto, dictar etapa y el grado, y que esta inactivación puede ocurrir a través de una variedad de procesos epigenéticos que incluyen alteraciones de microARN [5], alteraciones a la cromatina [6], [7], y las alteraciones de la metilación del ADN [8]. En este caso, existe un potencial para el uso de las alteraciones epigenéticas y particularmente ADN metilación CpG como biomarcadores para los cánceres de vejiga, así como, potencialmente, para una variedad de otros tipos de cáncer humanos [8], [9], [10], [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. enfoques basados en microarrays también han tratado de identificar nuevos genes asociados con la enfermedad invasiva pero con tamaños de muestra limitados debido a la estrategia empleada matriz [15]. La evolución reciente de los enfoques de la matriz permite ahora la aplicación de estas tecnologías a los estudios epidemiológicos poblacionales de cáncer que utiliza un gran número de muestras [16], [17], [18]. Hay numerosas ventajas a utilizar un enfoque basado en la población, incluida la reducción de sesgo, una mayor generalización de los resultados, y el acceso a las muestras que abarcan todas las fases y grados del tumor. Por lo tanto, hemos utilizado este enfoque basado en la matriz para identificar clínica y biológicamente patrones informativos y nuevas dianas génicas de ADN CpG metilación en una serie basada en la población de carcinoma transicional de vejiga.
Resultados
identificación de loci candidatos
Hemos utilizado un enfoque de 2 pasos a la identificación y validación de los loci que se asocia con el desarrollo de cáncer de vejiga invasivo (Figura S1). En el paso 1, dos series independientes de los tumores (Tabla 1) se analizaron por matriz de metilación del ADN para identificar el potencial candidato loci tener metilación diferencial, y en la etapa 2, estos candidatos se han confirmado en una serie adicional de los tumores no perfiladas en la matriz.
en general, hubo un aumento general de metilación en tumores invasivos (Figura 1A), lo que sugiere que este enfoque tiene utilidad para la demarcación de biomarcadores eficaces. modelos lineales generalizados que comparan los niveles de metilación de invasivas versus tumores no invasivos en cada locus confirmaron esta impresión visual. En la serie 1, 445 CpG loci había aumentado significativamente en la metilación invasiva en comparación con los tumores no invasivos (
Q Hotel & lt; 0,05), mientras que sólo el 68 loci había disminuido significativamente la metilación. Del mismo modo, en la serie 2, 606 loci habían aumentado significativamente la metilación y sólo 41 habían disminuido significativamente metilación (Tabla S1). Modelado de cada serie, de forma independiente, con modelos de mezcla de forma recursiva con particiones cedido cuatro perfiles de metilación (Figura 1B). En particular, los tumores significativamente más invasivas estaban en clase metilación 4 (P & lt; 0,00001, permutación de chi-cuadrado)
(A) Diagrama de dispersión de los valores medios metilación beta en tumores no invasivos de la vejiga (eje x) y media. valores beta de metilación en tumores invasivos (eje y) en la serie 1 (n = 73) y la serie 2 (n = 264) muestras. (B) modelos de mezcla partición recursiva de cada serie resultan en 4 clases separadas por líneas verticales rojas, con el ancho de las clases correspondientes al número de muestras en cada clase. Loci se representan como filas con la metilación media de la clase representada. Por encima de cada clase es la prevalencia de los tumores invasivos (n invasiva /n total) dentro de la clase. los perfiles de metilación distinguen significativamente tumor de vejiga del epitelio de la vejiga no enferma (P & lt; 0,00001) guía empresas
Para identificar los loci más robustamente asociados con la enfermedad invasiva, se utilizó 3, los enfoques estadísticos comúnmente aplicados para identificar los distintos. loci de genes (de cada uno de los tres enfoques estadísticos y en toda la serie 2) que se superponen en la diferenciación de la enfermedad invasiva y no invasiva. Cinco loci (
FRZB
_E186,
HOXB2
_P99,
KRT13
_P676,
RIPK1
_P868,
STAT5A
_P704) fueron encontrados que se asocia con la enfermedad invasiva en los tres enfoques estadísticos.
en cuatro de estos loci (
FRZB
,
STAT5A
,
KRT13
, y
HOXB2
), ensayos de pirosecuenciación bisulfito eran capaces de diseñar, y fueron utilizados para confirmar los resultados de la matriz en un subconjunto de tumores de vejiga examinados en la matriz. Un ensayo de pirosecuenciación para
RIPK1
no pudo ser diseñado con éxito. Para todos los sitios CpG examinados, así como el Medio en todos los sitios de
FRZB
,
KRT13
, y
HOXB2
, se observó significativamente mayor metilación en comparación con la no invasiva tumores invasivos, en consonancia con los resultados de la matriz (Figura S2A, S2C, S2D). Para
STAT5A
, que confirmó la significativamente mayor grado de metilación en el sitio CpG específica medida por la matriz, pero no observó esta asociación en los sitios CpG vecinos (figura S2 B), por lo que este no era más loci investigado.
el tratamiento de una línea celular de cáncer de vejiga con inhibidor de la metilación conduce a la re-expresión de HOXB2
la pirosecuenciación se realizó para determinar el estado de metilación de
HOXB2
,
FRZB
, y
KRT13 Hoteles en líneas celulares de cáncer de vejiga HTB-9 y UM-UC3. HTB-9 tenía un grado de metilación HOXB2 68.9, similar a lo que se había observado entre las muestras de tumor vesical primario, y por lo tanto se eligió un examen más detenido. El tratamiento de HTB-9 células con 1 o 2 M 5-aza-2 'desoxicitidina condujo a un aumento de más de 100 veces de la expresión HOXB2 comparación con las células tratadas de forma simulada (Figura 2).
Quantitative RT se utilizó el análisis-PCR para determinar la expresión génica de
HOXB2
en la línea celular de carcinoma de vejiga humana HTB-9, después de un tratamiento de 5 días con 1 o 2 M 5-aza-2'- desoxicitidina o tratamiento simulacro . Las barras representan la media veces el cambio en la expresión en comparación con el tratamiento simulacro para 4 o 6 replicar los experimentos y las barras de error indican los errores estándar.
La metilación HOXB2 se asoció independientemente con cáncer de vejiga invasivo
pirosecuenciación de las regiones promotoras de los
FRZB
,
KRT13
, y
HOXB2
se llevó a cabo en una serie independiente de los pacientes con tumor de vejiga 263 no han sido examinados en la matriz, así como en 4 muestras de tumor no enfermas obtenido de la NDRI. El grado de metilación en las regiones pyrosequenced en el epitelio de la vejiga no enferma, los tumores no invasivos a los tumores invasivos se representa en la figura 3, y revela importantes diferencias en la metilación a través de las 3 categorías para cada uno de los genes (
HOXB2
P & lt; 0,00001,
KRT13
P & lt; 0,05,
FRZB
P & lt; 0,003, prueba de Kruskal-Wallis). La metilación de
HOXB2
y
¿Cuáles son KRT13 cada significativamente mayor en comparación con los tumores invasivos no invasivos (protegida de Wilcoxon sumas de rangos de prueba, P & lt; 0,00001 y P & lt; 0,02, respectivamente). TP53 inmunohistoquímica (IHC) intensidad de la tinción se ha asociado previamente con una enfermedad más agresiva [19], [20], y que se incluye esta variable cuando se realizó la regresión logística la predicción de la enfermedad invasiva, para cada uno de los loci de forma individual, la dicotomización de la medida de la metilación en la mediana y el control de otros posibles factores de confusión. En los modelos controlados por edad, sexo y TP53 intensidad de la tinción inmunohistoquímica del tumor, solamente
HOXB2
la metilación del promotor demostraron una asociación independiente con tumores invasivos (Tabla 2). Los tumores con
HOXB2
metilación tuvieron un OR de 7,7 (IC del 95%: 3,3, 18,2) por ser un tumor invasivo. Este resultado llevó a cabo en un modelo de controlar por los 3 loci, así como TP53 IHC intensidad de la tinción y la edad del paciente y de género, donde
HOXB2
metilación se asoció con un mayor riesgo 8,6 veces mayor de ser un tumor invasivo (95% CI 3.4, 21.7).
la media (círculo relleno) y los intervalos de confianza del 95% de la extensión de la metilación de las regiones promotoras de (A)
FRZB
, (B)
KRT13
, y (C)
¿Cuáles son HOXB2 representado (eje y) la comparación de epitelio de la vejiga no enferma, los tumores no invasivos y tumores invasivos (eje x). Las diferencias en el grado de metilación a través de estos grupos es significativamente diferente (prueba de Kruskal-Wallis), para
HOXB2 gratis (P & lt; 0,00001) y
KRT13 gratis (P & lt; 0,04), y
FRZB
(P & lt; 0,003). Las comparaciones específicamente de no invasiva en comparación con la enfermedad invasiva también revelaron diferencias significativas para
HOXB2
* P & lt; 0,00001 y
KRT13
** P & lt;. 0,02
la metilación de HOXB2, FRZB, y KRT13 están asociados con agresivo no invasiva del cáncer de vejiga
Como estamos interesados en determinar cómo la metilación contribuye a la progresión y la agresividad de los tumores, que examinó la asociación entre la extensión y el grado tumoral metilación dentro de los tumores no invasivos. La Figura 4 demuestra que no es significativamente mayor grado de metilación de
HOXB2 gratis (P & lt; 0,01),
KRT13 gratis (P & lt; 0,01) y
KRT13 gratis (P = 0,0001) en alto grado (3) en comparación con bajo grado (1,2) tumores no invasivos. Para controlar los posibles factores de confusión, se realizó un análisis de regresión logística multivariable para examinar la asociación entre el promotor del gen de metilación medida y el grado tumoral. Inicialmente, modelamos cada promotor del gen de forma individual, y observamos asociaciones significativas entre los
FRZB gratis (OR 2,9; IC del 95%: 1,1, 7,9), y
KRT13 gratis (o CI 3.3, 95% 1.1, 10.1), pero sólo una asociación significativa límite entre el
HOXB2
metilación y alto grado tumoral (OR 2,6, IC 95%: 0,9, 6,9, el cuadro S2). A continuación, examinó los efectos aditivos de metilación de estos 3 loci mediante el modelado de la asociación entre la metilación de los tres loci en comparación con tener ninguno, 1, o 2 metilado y la enfermedad no invasivo de alto grado (Tabla 3). Controlada por edad, género, y la intensidad de tinción IHC TP53, la metilación de los 3 loci se asoció con una 7,4 veces mayor riesgo significativo de ser un tumor de alto grado (IC 95% 2,5, 22,1).
La media ( círculo relleno) y el 95% intervalo de confianza del grado de metilación de las regiones promotoras de (A)
FRZB
, (B)
KRT13
, y (C)
HOXB2
se representan (eje y) comparar baja (1,2) a alto (3+) tumores de grado (eje x). P-valores resultantes de las sumas de rangos de Wilcoxon demuestran que estas diferencias son significativas para
HOXB2 gratis (P & lt; 0,01),
KRT13 gratis (P & lt; 0,01) y
FRZB gratis ( P = 0,0001).
Discusión
En comparación con marcadores basados en la expresión de genes, los patrones de metilación del ADN son más estables y pueden detectarse utilizando diversos enfoques que requieren cantidades relativamente pequeñas de materiales de pacientes. Además, estos marcadores se pueden identificar objetivamente y cuantificados, proporcionando mejora potencial de la fiabilidad de los diagnósticos histológicos subjetivos tales como los grados de tumor o en comparación con los patrones de tinción inmunohistoquímica que se basan en la interpretación individual de la intensidad y la localización de la tinción. Por ejemplo, los marcadores identificados e independientemente validado en este estudio son prometedores como biomarcadores útiles en la detección del cáncer de vejiga y el seguimiento de recurrencia y progresión y podrían ser aplicados y probados para la utilidad clínica de fácil recoger los sedimentos de orina [9], [10 ], [11], [13], [21]. Además, el descubrimiento de genes y vías alteradas en los tumores de vejiga epigenetically sugieren nuevas dianas para la intervención terapéutica, especialmente cuando se considera el mal pronóstico asociado con cánceres de vejiga invasivo. Identificación de marcadores basados en la metilación del ADN importantes y útiles no está exenta de desafío, especialmente en lo que a menudo existe un alto grado de correlación entre estas alteraciones [22]. Por lo tanto, los métodos estadísticos apropiados deben ser utilizados para examinar estas alteraciones y para identificar aquellas alteraciones de mayor utilidad clínica. Creemos que nuestro enfoque de 2 etapas prevé la más robusta y generalizable identificación de alteraciones de metilación del ADN que puede ser examinada de nuevo en los estudios prospectivos. El uso de varios métodos estadísticos diferentes, nuestra estrategia de selección de marcadores informativos nos permitió identificar un número manejable de biomarcadores potencialmente útiles y robustos para la validación de laboratorio, así como la replicación en muestras independientes. Lo más importante, nuestra validación de estos marcadores en un grupo independiente de pacientes proporciona evidencia convincente de su potencial utilidad e importancia biológica.
Los estudios previos que examinan los paneles de genes candidatos han identificado los genes y los paneles de loci específicos que son predictivos de tanto la presencia de tumor cuando se examina en la orina sedimento [23] y la progresión de la no invasiva para la enfermedad invasiva [15], [24], [25], [26] cuando se examina en el tejido tumoral. Los genes específicos, tales como
RASSF1A
,
RARB
,
BAMBI
y el
SFRP
familia se han asociado con un mayor grado y el cáncer de vejiga superior etapa [8 ], [27], [28]. Nuestra estrategia no identificó estos genes específicos, y esta discrepancia puede deberse a una serie de diferencias entre nuestro enfoque y los utilizados anteriormente. Hemos hecho uso de una muestra de series de casos basados en la población, mientras que muchos estudios previos han utilizado series conveniencia de base hospitalaria, y por lo tanto puede haber tenido algún sesgo introducido en las muestras examinadas. La gama plataforma utilizada en este estudio se limita a que se examina sólo un subconjunto de todos los genes y sólo 1 o 2 sitios CpG específicos para esos genes, y por lo tanto puede pasar por alto los genes específicos de loci descritos anteriormente. Finalmente, nuestro enfoque analítico, ya que se basa en la identificación de paneles de genes puede identificar diferentes loci que los utilizados en los análisis de candidato, pero la hipermetilación de los descritos anteriormente candidatos, puede, de hecho, ser altamente correlacionado con los patrones de metilación identificadas en este documento . Se necesitan más estudios que combina loci previamente identificados con nuestros propios nuevos objetivos y de carácter prospectivo para determinar con más precisión los loci con la mayor utilidad clínica.
Las bases biológicas de la enfermedad recurrente todavía no invasiva frente a la enfermedad invasiva quedan se han dilucidado plenamente [29]. Nuestros resultados indican que hay grandes diferencias en la metilación entre los tumores invasivos y no invasivos, con tumores invasivos que muestran un aumento general de metilación en comparación con los tumores no invasivos. Como la metilación del ADN en cualquier CpG es una medida binaria (ya sea la citosina es metilado o no) la diferencia en el grado de metilación puede reflejar potencialmente mayor homogeneidad en la selección de células epigenetically alterados en el desarrollo de la enfermedad invasiva, un resultado consistente con nuestro trabajo previo examinar únicamente un panel limitado de promotores de genes en una sola serie de tumores de vejiga [14]. Este mayor grado de metilación puede ser la conducción de las características del fenotipo invasivo, o alternativamente puede ser una consecuencia de las presiones selectivas relacionadas con este fenotipo. Aunque nuestro enfoque en el examen de aparición de una enfermedad no puede distinguir plenamente estas posibilidades, que proporciona datos ilustrativos de la urgente necesidad de un examen más detenido de este fenómeno epigenético.
Identificación de genes específicos cuyo patrón de metilación del ADN se asocia con fenotipos tumorales, incluyendo etapa y el grado también ilumina los procesos biológicos de especial importancia y las vías necesarias para la génesis de estos estados de tejido histológicamente definidas. La
FRZB
gen (también conocido como
sFRP3
) es un miembro de la familia de receptores Frizzled secretada de proteínas solubles que se une a y antagoniza el receptor de Wnt. Nosotros y otros han demostrado previamente que la hipermetilación de
SFRP
genes se asocia fuerte y significativamente con el cáncer de vejiga invasivo, lo que confirma la importancia de esta vía en este fenotipo [8], [12]. De los
SFRP
genes, sólo el
SFRP1
, (además de
FRZB
) se perfila en la matriz, y en un lugar diferente CpG de los cebadores utilizados en nuestra y los informes anteriores de la metilación [8], [30]. Esto puede explicar por qué este loci no fue identificado en nuestro enfoque de detección. genómicamente más densa adicional investigación de la vía Wnt, se justifica, ya que esto puede sugerir una nueva vía para la intervención terapéutica para esta enfermedad.
HOXB2
es un miembro de la familia homeobox de factores de transcripción , y se codifica en el cromosoma 17 como parte de un grupo de genes con otros miembros de la familia HOX. Curiosamente, se observa que epitelio de la vejiga no enferma exhibe un grado similar de metilación en
HOXB2
y
KRT13
medida que la enfermedad no invasiva, mientras que al
FRZB of the non tejido -diseased tiene una extensión significativamente menor de metilación que cualquiera de los tipos de tumores 2. Observamos también, en la línea celular de carcinoma de vejiga humana HTB-9, lo que demuestra un grado de metilación similar a la observada en los tumores invasivos, que el tratamiento con el inhibidor de la metilación 5-aza-2 'desoxicitidina conduce a una mayor expresión de
HOXB2
, lo que sugiere que la metilación de este gen puede ser funcionalmente que conduce a la inactivación de este gen. Los resultados en
HOXB2
son consistentes con la literatura que se ha descrito una estructura de dominio bivalente de la cromatina de los genes homeobox, en el que tanto pluripotentes y marcas exhiben tejido terminalmente diferenciadas tanto de cromatina activa y represivo de la misma región [31 ], [32], y por lo tanto un grado intermedio de la metilación del ADN. los cánceres de vejiga invasivo aparecen dirigidos por hipermetilación de esta región, un fenómeno se informó anteriormente través de los genes controlados del grupo Polycomb en células de cáncer de colon [33]. Tal alteración diferencial de un gen de desarrollo clave puede ser crítica en la definición de los fenotipos de estos tumores y explicar el comportamiento y el resultado de estas formas dispares de esta enfermedad.
KRT13
codifica citoqueratina-13 que se ha demostrado que tienen una expresión específica en tumores escamosos de cuello uterino y en adenocarcinomas de cuello uterino de tipo mucinoso [34]; a nuestro conocimiento, no se han reportado alteraciones epigenéticas a este gen. alteración epigenética de este gen puede afectar a su patrón de expresión, y tales cambios pueden ser signos de una manera más diferenciada de-fenotipo, considerado característico de los tumores de grado alto, agresivos.
Hemos demostrado en una serie confirmación independiente de los tumores que se el grado de metilación de
HOXB2
y
FRZB
está asociada con el grado del tumor, independientes unos de otros y de la proteína TP53 tinción inmunohistoquímica. TP53 tinción previamente ha sido examinado y se ha promocionado como un marcador molecular de diagnóstico precoz de esta enfermedad [35], [36], [37], aunque hay datos contradictorios sobre su utilidad [36], [38], [39], [40]. Un reciente meta-análisis examinando su utilidad sugiere que no hay pruebas apropiado sugerir la utilización de este marcador clínicamente [20], ya que puede no proporcionar además información pronóstica que no sea una fuerte asociación con el fenotipo invasivo de la enfermedad [41], [ ,,,0],42]. Todavía no podemos sugerir que los marcadores descubiertos utilizando nuestro enfoque tienen utilidad clínica más que la clasificación patológica y estadificación de los tumores, pero creemos que nuestros datos sugieren vías celulares específicos que se encuentran alteradas en esta enfermedad. Por lo tanto, estas vías se podrían estudiar intensamente como nuevos objetivos para estrategias terapéuticas. Además, se sugiere que es necesario un trabajo futuro, el examen de la utilidad de estos marcadores en forma prospectiva, ya que pueden ser útiles para determinar qué tumores pueden progresar. De hecho, estos marcadores también podrían contribuir a los esfuerzos clínicos para el seguimiento de pacientes con métodos menos invasivos, para determinar si el tumor se ha recurrido o progresado, lo que requiere enfoques de tratamiento más agresivo.
Métodos
Población de estudio Comprobación de la muestra y
Todos los participantes del estudio escrito el consentimiento informado con la aprobación de las juntas de revisión institucional de la Escuela de Medicina de Dartmouth y la Universidad de Brown. Hemos utilizado dos, serie basada en la población independiente, no consecutivo de los casos de cáncer de vejiga. La primera, que consiste en tumores de 344 personas que participan en un estudio de casos y controles de cáncer vesical incidente en New Hampshire, diagnosticados entre julio de 1994 y junio de 1998 [43], y la segunda consiste en tumores de 264 individuos diagnosticados entre enero 1 de 2002 al 30 de julio de 2004 [44]. Aunque separados en tiempo y alcance, estos dos estudios utilizaron idénticos procedimientos de contratación y el personal del estudio, así como protocolos idénticos para la determinación de los materiales para los exámenes de patología molecular. Los tumores de vejiga de ambas series fueron revisados por el estudio forense (A.R.S.) y se clasifican de acuerdo a las 1973 y 2004 directrices de la Organización Mundial de la Salud para los tumores de vejiga. El patólogo estudio identificó el bloque apropiado del que se obtuvieron las muestras tumorales utilizados en estos análisis, y se estimó la proporción de células malignas en cada muestra. Todas las muestras utilizadas en el examen contenían & gt; 75% de la muestra de tumor. Carcinoma in situ se excluyó del análisis debido al tamaño limitado de la muestra. Tabla 1 se describen las características de los sujetos incluidos en el análisis final. Además, cuatro muestras de epitelio de la vejiga no enfermas se obtuvieron del Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades (ISRND) todo a partir de muestras de autopsias de individuos que no tenían un diagnóstico de cáncer.
Extracción de ADN y análisis de metilación
Tumor secciones con mayor proporción de tejido maligno fueron seleccionados por el estudio forense para su uso en nuestros análisis moleculares. Se extrajo el ADN y bisulfito de sodio modificado siguiendo los procedimientos estándar como se describe en Marsit, et al. [18]. Un total de 82 tumores de la primera serie y los 264 tumores de la segunda serie se perfila para el estado de metilación de CpG en 1505 loci utilizando las matrices de metilación del grano Illumina GoldenGate®. matrices de perlas se llevaron a cabo en el Instituto de Genética Humana de la UCSF, Genómica de acuerdo con el protocolo del fabricante y como se describe en Bibikova, et al. [45].
El análisis estadístico
Hemos reunido datos con el software BeadStudio La metilación del fabricante array (Illumina, San Diego, CA) y evaluación de la calidad se realiza como en Christensen et al. [16] resulta en siete muestras (9%), en los que & gt; 75% de loci tenía una detección de valor de p & gt; que se cayó 1 * 10
-5, a partir del análisis. Un control de calidad similar para CpG loci elimina los loci con mediana de detección valor de p & gt; 0,05 (n = 8, 0,5%): perfil
Los análisis posteriores se llevaron a cabo en el paquete R.. Para los propósitos /visualización de exploración, se realizó la agrupación jerárquica utilizando la métrica Manhattan y el promedio de vinculación. Para locus mediante análisis de locus, asociaciones en loci individuales CpG se pusieron a prueba con un modelo lineal generalizado (GLM). Bajo el supuesto de que los valores promedio beta siguen una distribución beta [46], un modelo cuasi-binomial (enlace logit, varianza binomial, y parámetro de escala no unidad) fue utilizado; en cuenta que la función de enlace logit impone una restricción correspondiente en la beta promedio media. Para ajustar para comparaciones múltiples en la exploración del 1413 autosómica loci CpG, los valores de p para las asociaciones entre la beta promedio y la enfermedad invasiva utilizan falsos descubrimiento tasa de corrección y q-valores calculados por el
qvalue
paquete en R. Un FDR q -valor de. & lt; 0,05 fue considerado significativo para este examen
Al azar Bosques
[47] (http://www.math.usu.edu/~adele/forests/), se utilizó para construir clasificadores de fase invasiva (no invasiva frente) por medio de valores beta CpG. El análisis se llevó a cabo en I utilizando el
randomForest paquete gratis (versión 4,5 a 18) por Liaw y Wiener. En cada nodo del árbol, una muestra aleatoria de
m
del total de
M
las variables fue elegido y la mejor división se encuentra entre los
m variables de
. El valor predeterminado de
m Hoteles en el paquete Random Bosque R es. En este análisis hemos probado una serie de
m
de la mitad de a dos veces y se utiliza
m Windows que dio el error de predicción más bajo; en este caso la tasa de error
m
= 38. El OOB es el porcentaje de tiempo que la predicción de RF es incorrecta. Una prueba de asociación entre la metilación (predictores) y el tipo de muestra se llevó a cabo mediante la comparación de la FPO obtenida en el conjunto de datos con la distribución nula de errores fuera de banda obtenidos por permutación de etiquetas de tipo de muestra y ejecutar el procedimiento de RF 100 veces. También usamos la segunda serie de 264 tumores como un conjunto de validación, el cálculo de la tasa de error como se construye cada árbol, para obtener un porcentaje de error estimado independiente de la primera serie. Finalmente, se utilizaron las puntuaciones de importancia variable, porcentaje de cambio en el error cuadrático medio (MSE), para identificar loci que tuvo la mayor influencia en la clasificación, por la elección de los loci cuyo porcentaje de cambio en MSE fue superior al 5%.
por inferencia, los datos se agruparon mediante un modelo de mezcla [48] con una mezcla de distribuciones beta [49], y se determinó el número de clases por el criterio de información bayesiano (BIC) [50], [51]. El modelo de mezcla se ajusta mediante la partición recursiva los datos utilizando un modelo de mezcla de clase 2, con una variante de BIC se utiliza como criterio para la división, como se describe en [46]. pertenencia a una clase se obtuvo a partir del modelo de mezcla usando un procedimiento empírico de Bayes, y asociaciones posteriores con la etapa invasiva se pusieron a prueba a través de la prueba de permutación con 10.000 permutaciones de cada una con la prueba estándar de bondad de ajuste chi-cuadrado. La salida de los modelos de mezcla incluye una distribución beta específica de clase
F
jk Opiniones de cada locus
j
y la clase
k
. Estas distribuciones implican una curva de funcionamiento del receptor (ROC) para distinguir dos clases
k
y
l fotos: por la relación o, lo que la curva está por encima de la línea de identidad. En cualquier caso, el área bajo la ROC (AUC), calculada como, que se puede utilizar para determinar la influencia de locus
j
en la distinción entre las clases
k
y
l
. Un procedimiento similar se puede utilizar para distinguir la clase
k
de los otros: se utiliza una aproximación normal
G
jk
para la distribución de las clases combinadas distintos de
k
y de cómputo. Luego clasificamos cada locus j por su computarizada AUC
jk, y se seleccionaron aquellos con AUC & gt;.
0,90
Para identificar loci para la validación posterior como predictores de enfermedad invasiva en comparación con no invasivo, que computa la intersección de los loci que eran más significativo (Q & lt; 0,05) en el análisis locus por locus, los loci graduación superior a partir del análisis de RF (% de cambio en MSE & gt; 6%), y los loci que tiene AUC & gt; 0,75 para distinguir la clase de interés en comparación con otros en cada serie de tumores, y luego identificado los lugares geométricos superpuestos en ambas series.
bisulfito de pirosecuenciación
la cuantificación de citosina metilación por ciento se realizó mediante pirosecuenciación ADN con bisulfito convertido mediante el PyroMark sistema de pirosecuenciación MD (Qiagen, Valencia, CA).