Extracto
El bortezomib /PS-341 /Velcade, un inhibidor del proteasoma, se utiliza ampliamente para tratar el mieloma múltiple. Si bien se han propuesto varios mecanismos de la citotoxicidad del fármaco, el mecanismo real sigue siendo difícil de alcanzar. El objetivo fue identificar los genes que afectan la citotoxicidad de bortezomib en la levadura de fisión
S.pombe
como el fármaco inhibe ciclo de división celular de este organismo como mutantes del proteasoma. Entre los 2815 genes seleccionados (que cubren el 56% del total de los ORF), 19 genes, cuya supresión inducir una fuerte letalidad sintética con bortezomib, fueron identificados. Los productos de los 19 genes incluidos cuatro enzimas ubiquitina y un factor proteasoma nuclear, y 13 de ellos se conservan en los seres humanos. Nuestros resultados proporcionarán información útil para la comprensión de la acción de bortezomib dentro de las células
Visto:. Takeda K, Mori A, Yanagida M (2011) La identificación de los genes que afectan a la toxicidad de la droga contra el cáncer bortezomib por genoma completo Proyección en
S. pombe
. PLoS ONE 6 (7): e22021. doi: 10.1371 /journal.pone.0022021
Editor: Michael Polymenis, Texas A & amp; M University, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Marzo, 2011; Aceptado: June 12, 2011; Publicado: 8 Julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Takeda y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. KT era el apoyo financiero de la beca de investigación de la Fundación para la investigación del Astellas trastornos metabólicos (http://www.astellas.com/jp/byoutai/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la vía de la ubiquitina /proteasoma es una maquinaria proteolítica importante en las células y tiene un papel fundamental en el ciclo de división celular, la apoptosis, etc. [1]. Por lo tanto, esta vía se considera que es un objetivo potencial fuerte de tratamiento clínico de enfermedades como el cáncer, y los productos químicos que modulan la actividad de la ruta de ubiquitina /proteasoma se han investigado intensamente [2], [3]. Bortezomib /PS-341 /Velcade es un ácido bórico péptido que inhibe la actividad de tipo quimotripsina de la subunidad beta 5 del proteasoma
in vitro
. Bortezomib tiene fuertes potenciales efectos antitumorales en
in vitro y en animales
estudios y se ha desarrollado como un fármaco contra el cáncer para tratar el mieloma múltiple y otros tipos de cáncer [3], [4]. La inhibición del proteasoma provoca efectos pleiotrópicos. Por lo tanto, se han sugerido varios mecanismos para la citotoxicidad de Bortezomib, como la inhibición de las proteínas anti-apoptóticas, la estabilización de p53, la perturbación de la progresión del ciclo celular, etc [5]. Para aumentar el conocimiento de los mecanismos de los efectos antitumorales y adversos de bortezomib, que será beneficioso para identificar los genes que involucran en la citotoxicidad de esta droga. Un esfuerzo pionero para identificar dichos genes se informó por el grupo Lightcap en 2010 [6].
La levadura de fisión
Schizosaccharomyces pombe
es un simple eucariota unicelular y se ha utilizado como organismo modelo básico de biología celular, debido a su tratabilidad genética y su similitud con los eucariotas superiores. Una biblioteca de 2815 cepas con genes eliminados está disponible para todo el genoma estudios de sensibilidad a los fármacos [7], [8], [9].
A continuación, hemos intentado identificar los genes evolutivamente conservados que afectan a la citotoxicidad de bortezomib mediante el aprovechamiento de la biblioteca de genes de supresión en
S. pombe
y estableció un método para llevar a cabo la detección sintético letal en todo el genoma con bortezomib. Entre los 2815 genes seleccionados, cepas de deleción de 19 genes tenían una fuerte letalidad sintética con bortezomib (tales genes fueron denominados en lo sucesivo sintético letal con bortezomib; SLB). De los 19 genes SLB, 13 se conservan desde la levadura a humanos e incluyen factores que intervienen en la proteolisis de ubiquitina /proteasoma dependiente, el silenciamiento de la cromatina, el transporte nuclear /citoplásmico, aminoácidos y metabolismo de la vitamina, el tráfico vesicular, el metabolismo del RNA, etc.
resultados
arresto mitótico y el fracaso en la segregación cromosómica inducida por bortezomib
Se encontró que el bortezomib (LC Laboratories) inhibe eficazmente la proliferación de
S. pombe
, mientras MG132, un auténtico inhibidor del proteasoma en células de mamífero no inhibió la proliferación (Figura S1). A continuación, examinó el nivel de proteínas poli-ubiquitinated en la presencia o la ausencia de bortezomib (Figura S1). culturas en fase logarítmica se recogieron a las 0, 4, y 9 horas después de la adición de Bortezomib 1 mM y las proteínas totales se extrajeron para análisis de inmunotransferencia. En presencia de bortezomib, proteínas poli-ubiquitinated acumulan de una manera dependiente del tiempo. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el bortezomib inhibe eficazmente la proliferación celular y la actividad proteolítica del proteasoma en
S. pombe
.
mutantes sensibles a la temperatura de los componentes del proteasoma (
mts3-1 Opiniones de Rpn12 de 19S partículas de regulación y
mts2-1 Opiniones de Rpt2 de partícula reguladora 19S ) son detenidos en la fase M debido a la inhibición de la degradación de los reguladores de la mitosis como Cdc13 (ciclina) [10], [11]. Este hallazgo nos llevó a examinar en detalle cómo bortezomib afecta el ciclo celular. Después de añadir Bortezomib culturas a fase semilogarítmica, las concentraciones de células y la viabilidad se midieron con el tiempo (Figura 1A). La proliferación celular finalmente cesó y la viabilidad se redujo a 21, 10, y 4,7% a las 4, 6, y 9 horas después de la adición de Bortezomib. Sin bortezomib, las células continuaron dividiendo y la viabilidad sostenida. Para examinar cómo el ciclo celular se ve afectada por el bortezomib, el ADN de la cromatina, los microtúbulos, y cuerpos polares del huso (SPB: homólogo al centrosoma) se visualizaron mediante el etiquetado de la proteína fluorescente verde o rojo para la histona H2A (por cromatina), alfa-tubulina (microtúbulos) y la proteína Sid4 (SPB, el centrosoma levadura equivalente, que se muestra como un punto en la Figura 1C), respectivamente. La proporción de células con cromosomas sobre-condensados y husillos metafase fue más alta (30%) a 1 hora después de la adición Bortezomib y posteriormente disminuyó (Figura 1B y 1C-a). Como la disminución de la proporción de células en metafase, la proporción de células con un núcleo desplazados aumentó (Figura 1C-b), en la que las cromátidas hermanas no se separaron, y el núcleo se desplaza desde el centro. Como la relación de 'núcleos desplazadas fue más alta en 4 h y la disminución de las células posteriormente, anucleados y las células con un núcleo gigante aumentado (Figura 1B y C-c). Esto fue probablemente el resultado de la terminación de la citocinesis en células con un núcleo desplazados. Por lo tanto, en presencia de bortezomib, las células fueron detenidos brevemente en la metafase, incapaz de separar las cromátidas hermanas, y se perdió viabilidad. Estos fenotipos inducidos por bortezomib son prácticamente idénticos a los defectos causados por mitótico
mts2-1
, la mutación sensible a la temperatura en Rpt2 subunidad 19S de partículas [10]. En el caso de
mts3-1
mutación (Rpn12 de 19S), fenotipo detención en metafase es más severa; 75% de las células son detenidos en la metafase brevemente [11]. En ambos casos, la detención de la metafase es temporal y el núcleo se desplaza posteriormente como se muestra en el caso del tratamiento Bortezomib. Dado que el defecto en la transición /anafase metafase se debe a la inhibición de la proteólisis, ubiquitinated sustratos del proteasoma, tales como Cdc13 (ciclina) deben acumular [12]. Para examinar esto, las células que expresan ectópica hexa-histidina (His6)-etiquetados ubiquitina se prepararon y se cultivaron en presencia o ausencia de Bortezomib durante 4 horas a 26 ° C. Las proteínas se extrajeron a partir de ambos cultivos bajo condiciones de desnaturalización con guanidina-HCl 6M y los extractos resultantes se aplicaron a perlas TALON (Clontech), que absorben la etiqueta His6, para purificar los proteínas ubiquitinadas. proteínas TALON purificado se analizaron por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo contra Cdc13 (Figura 1D). En presencia de Bortezomib, se observó multi-ubiquitinated Cdc13, como se informó en los mutantes sensibles a la temperatura de la proteasoma [12]. Estos resultados demostraron que un inhibidor químico para el proteasoma se puede utilizar para reemplazar los ts mutantes del proteasoma. Este fármaco podría ser útil para analizar los fenotipos de proteasoma defecto a una temperatura baja, por ejemplo, en la meiosis o en los experimentos en los que las respuestas de choque térmico debe ser evitado. Por lo tanto, adoptamos Bortezomib para su posterior detección genética para identificar los genes que afectan el fenotipo de disfunción proteasomal.
(A) El bortezomib (1 mM) inhibe la proliferación celular. Se presentan las concentraciones de células y viabilidades. BZ: Bortezomib (B) Bortezomib (1 mM) inhibió la progresión normal de la fase M. El gráfico indica la relación de células con husos metafase y más de condensados-cromosomas (azul, células muestra en la Figura 1C-
a
), las células con un núcleo desplazado (rojo, Figura 1C-
b
), las células sin núcleo y con un núcleo gigante (naranja, Figura 1C-
c
), y las células con el cromosoma desgarrado por el tabique (verde, Figura 1C-
d
, y
e
). (C) Los cromosomas, los microtúbulos, y SPB se observaron en presencia de Bortezomib. Las células que muestran anomalías mitótico correspondiente a la Figura 2B se muestran en la a-e (panel superior: + BZ). Imágenes de la progresión normal de la división celular se muestran en el panel inferior (-BZ). Bar = 10 micras ciclina ubiquitinada-Poly (D) /Cdc13 acumula en la presencia de Bortezomib. Véase el texto para más detalles.
mutantes relacionados proteasoma son hipersensibles a bortezomib
Antes de la proyección integral, se examinó cómo la citotoxicidad Bortezomib se ve afectado por mutaciones relacionadas con la ubiquitina /proteasoma sistema. En comparación con el tipo salvaje eran cinco mutantes relacionados proteasoma de la siguiente manera:
mts2-1
,
mts3-1
,
pts1-727 gratis (mutado en la beta 5 subunidad de 20S complejo [13]),
ump1-620 gratis (mutado en el factor de maduración 20S Ump1 [13]), y
Δcut8 gratis (gen-mutante de deleción de
cut8
+
necesario para la localización nuclear adecuada de la proteasoma [14], [15]). Cada cepa se incubó en una placa de agar SÍ rica para formar una colonia y luego se vio en placas de agar que contenían 0, 100, 250, o 500 mM Bortezomib, asistido por un sistema de robot (rotor, Cantante, Reino Unido). Después de 3 días de incubación a 26 ° C, se evaluó la capacidad de formación de colonias de cada mancha (Figura 2A y B). El tipo salvaje colonias en todas las placas de forma, mientras que los mutantes relacionados proteasoma eran defectuosas en las colonias de la formación de placas de bortezomib (
Δcut8
a 100 micras y otros en 500 mM). La clara hipersensibilidad de
Δcut8
a bortezomib nos llevó a adoptar el método descrito anteriormente para una revisión adicional de todo el genoma de los mutantes letales sintéticos con bortezomib.
(A) Estrategia para la detección sintético letal ( B) los mutantes de componentes de la vía ubiquitina /proteasoma son hipersensibles a bortezomib. Ocho colonias de cada cepa fueron réplica en placas sobre placas de agar con varias concentraciones de Bortezomib y se incubaron durante 3 días a 26 ° C. (C) Resumen de la detección sintético letal con bortezomib. Véase el texto para más detalles. (D) La validación de los mutantes aislados que tenían defectos de crecimiento en 100 M Bortezomib mediante la detección de 5 veces diluciones seriadas de las células en crecimiento vegetativo.
de todo el genoma de cribado sintética letal con bortezomib
Para identificar los genes que afectan la citotoxicidad de bortezomib en
S. pombe
, que exhibió 2815 mutantes de deleción de genes para la inhibición del crecimiento sintética en placas de agar con bortezomib SÍ utilizando asistida por robot réplica de chapado. Desde el cribado primario, 59, 62, y 135 cepas fueron aisladas que tenía defectos de crecimiento en medios con 100, 250, y 500 mM Bortezomib, respectivamente. No hubo mutante resistente Bortezomib clara que creció más rápido que la cepa de tipo salvaje en medio 500 M bortezomib. Un resumen de la proyección se muestra en la Figura 2C (ejemplos de los resultados en bruto de la criba primaria y la lista de genes se muestran en la Figura S2 y la Tabla S1). Las 59 cepas que tenían defectos de crecimiento con 100 mM Bortezomib se volvieron a analizar mediante la detección de 5 veces diluciones seriadas de cultivos en fase de registro de cada cepa (de 10 células a 6250 células) en placas de SI con y sin Bortezomib (Figura 2D). Se realizó estas repeticiones de pruebas por duplicado. Como resultado, 19 mutantes de deleción de genes reproducible mostraron defectos de crecimiento en las placas que sí con 100 mM Bortezomib. Diecisiete y 12 cepas mostraron defectos de crecimiento con 250 y 500 M Bortezomib, respectivamente. El resto de los mutantes no mostró defectos de crecimiento claras con bortezomib en la prueba de manchas. Ninguno de los mutantes probados en dosis más bajas (1 nM-10 mM) de bortezomib mostró defectos de crecimiento significativas (Figura S3). Por lo tanto, adoptamos una concentración de 100 mM de bortezomib para el cribado de hipersensibilidad
S.pombe
mutantes en nuestro presente estudio, aunque en el estudio anterior y similar sobre las células humanas, una concentración de 4 a 7-nM de bortezomib utilizado en los controles [6]
los 19 genes que muestran defectos de crecimiento claras sobre 100 placas M bortezomib en la prueba de manchas se clasifican según la función:. cinco pertenecían a la vía de la ubiquitina /proteasoma, cuatro para proteínas /cromatina nuclear y el transporte nuclear, tres al tráfico vesicular, de tres a amino ácido y el metabolismo de vitaminas, de tres a metabolismo del RNA, y la proteína quinasa a (Tabla 1). La Tabla 1 enumera los nombres sistemáticos, nombres primarios (si procede), la levadura en ciernes
Saccharomyces cerevisiae Opiniones y ortólogos humanos, y una breve descripción de cada gen SLB. Entre los 19 genes SLB, se informaron 13 genes ortólogos tener potenciales en los seres humanos.
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado que el bortezomib, un inhibidor del proteasoma ampliamente utilizado como un fármaco anti-cáncer, inhibe eficazmente la proliferación de
S.pombe
e induce la detención de la mitosis, así como las mutaciones sensibles a la temperatura de las subunidades proteasomal. Diecinueve mutantes de deleción de genes fueron identificados por la proyección de todo el genoma para ser sintético letal con bortezomib
.
A pesar del fuerte efecto de bortezomib para detener el ciclo celular, otro inhibidor del proteasoma, MG132, tuvieron efectos inhibidores más débiles en la proliferación de el estudio presente. MG132 es, sin embargo, reportó para inhibir la proteolisis dependiente de protesome en el lisado celular de
S.pombe
, lo que indica que el proteasoma de
S.pombe
es sensible a este inhibidor [16]. En
S.cerevisiae
, MG132 se utiliza para inhibir la proteolisis
in vivo
bajo la deleción del gen de PDR5, la bomba de eflujo de fármaco importante, que puede excretar eficazmente MG132 de la célula [17].
S.pombe
posee dos ortólogos PDR5, PdR1 y Bfr1. La diferencia en los efectos de bortezomib y MG132 podría ser debido a sus diferencias en la permeabilidad celular o la eficacia de la excreción de bombas de eflujo de fármacos. Bortezomib puede servir como una herramienta útil para el estudio de la vía ubiquitina /proteasoma en
S.pombe
.
Realizamos la pantalla sintética letal para identificar los genes que afectan la sensibilidad de bortezomib, usando el 2815 mutantes de deleción de genes de
S. pombe
. Diecinueve mutantes de deleción fueron identificados con defectos de crecimiento graves inducidas por 100 M Bortezomib (listados en la Tabla 1 y la Figura 3). Cinco de los genes responsables (SLB designado) eran ubiquitina /proteasoma relacionados: pof3, Cul3, mug30, ubp16 y cut8. Su letalidad sintética con bortezomib podría explicarse mediante una acción inhibidora de la droga contra el proteasoma. Por ejemplo, ubiquitina ligasas proporcionan los sustratos para proteasoma de modo que la disminución de tanto podría causar efectos sintéticos graves. No se han reportado otros a estar relacionado con la función del proteasoma. Sin embargo, algunos de los genes SLB todavía podría ser explicado a través de las funciones del proteasoma. Durante tres genes SLB tráfico vesicular (sec28, ftp105, y ryh1), defectos en la vía secretora invocan ER (retículo endoplasmático) subrayan que puede aumentar el requisito de la actividad del proteasoma [18]. Una de tráfico vesicular genes SLB, ftp105, codifica la proteína de localización de Golgi que se informó de interactuar con deubiquitinase Usp5 y ser necesarios para la localización de Golgi de Usp5 [19]. El ortólogo humano de Ftp105 es C17orf28 /DMC1 (abajo-regulada en múltiples tipos de cáncer), un potencial supresor tumoral [20]. Por lo tanto, la letalidad sintética de ftp105 eliminación con bortezomib se estudiará más en el futuro. Ryh1 se informó recientemente para regular DE TORC 2 (objetivo de rapamicina complejo 2) en
S.pombe
[21]. En cuanto a las proteínas SLB nucleares, más proteasoma puede ser necesario cuando la dinámica de la cromatina se ve comprometida en los mutantes de deleción de los reguladores de la cromatina, como el proteasoma nuclear se sabe que contribuyen a las regulaciones de la cromatina como la reparación de daños en el ADN, la replicación del ADN, y la transcripción [15], [22 ], [23], [24]. Uno de los productos de genes nucleares SLB es Rik1, un componente del complejo ubiquitina ligasa CLRK requerido para la cromatina silenciamiento [25], [26]. Aunque no se conocen los sustratos de CLRK ubiquitina ligasa, que puede ser un curioso experimento para examinar si Bortezomib afecta silenciamiento de la cromatina del ADN. Se informó PKA estar involucrado en la regulación de la metafase /anafase en la levadura de fisión y en los sistemas de Xenopus huevo
in vitro
[12], [27], [28]. Mientras que algunos de los otros genes SLB, tales como la vitamina factores metabólicos, son difíciles de explicar, que podrían estar implicados a una de muy diversas funciones celulares del proteasoma. Bortezomib, posiblemente, puede tener objetivos distintos del proteasoma dentro de las células de
S. pombe
. Por lo tanto la evaluación de los genes SLB aparentemente no relacionadas con la ubiquitina /proteasoma podría valer la pena para tener en cuenta otros objetivos. Combinación de SLB supresión de genes y las mutaciones sensibles a la temperatura proteasomal será útil para juzgar si la letalidad sintética es debido a la inhibición del proteasoma o de otras perturbaciones causadas por Bortezomib. Si la letalidad sintética es debido a la inhibición del proteasoma, se espera que el doble mutante del gen SLB y el proteasoma para mostrar un fenotipo mucho más severa que un solo mutante proteasomal. En realidad, un mutante de
cut8
, un gen SLB, muestra letalidad sintética a mutaciones proteasomal
mts2-1
y
mts3-1
[14]. Aunque hay que tener en cuenta que el bortezomib tiene otro objetivo, los presentes resultados tienen implicaciones potencialmente importantes para la biología básica del proteasoma mediante la apertura de vías para descubrir nuevos e inesperados relaciones entre el proteasoma y otras vías celulares. Un genoma de pantalla ancha similar en células humanas sugiere que las traducciones de proteínas, ER vía /Golgi, vía a reparar el daño del ADN, y la regulación de Myc y poliaminas están implicados en la muerte celular inducida por bortezomib [6]. Los hallazgos del presente estudio reciente sugieren que los genes implicados en vitaminas y aminoácidos vías metabólicas, el silenciamiento de la cromatina nuclear, /citoplasma yendo y viniendo, y la vía cAMP están relacionados con el proteasoma en la levadura de fisión
S.pombe
. Por lo tanto, se deben hacer más esfuerzos para comprender los mecanismos de la letalidad sintética de estos inesperados deleciones de genes SLB con bortezomib
.
Trece genes conservados SLB se muestran en rojo.
Identificamos 13 genes conservados SLB potencialmente interesantes para estudios posteriores. Como se mencionó en los resultados, de 4 a 7 nM de bortezomib se utilizó para los genes de pantalla que afectan a la citotoxicidad de bortezomib en líneas celulares de cáncer, y 100 M de bortezomib se utilizó para
S.pombe
detección mutante en el presente estudio . La diferencia en la sensibilidad Bortezomib podría reflejar la diferencia en la biología de estos organismos, tales como la permeabilidad del fármaco y la excreción de fármacos. En general, las células de levadura son más resistentes a las perturbaciones por inhibidores químicos. Por lo tanto, los ortólogos humanos de los genes conservados SLB deben ser examinados por pequeña interferencia de ARN para ver si su caída afecta a la capacidad de supervivencia de las células humanas en dosis más bajas de bortezomib. Si los mismos efectos sintéticos se producen en las células humanas, tales genes SLB tienen potencial para la innovación de nuevas terapias o diagnósticos. Por ejemplo, si se desarrollan inhibidores químicos de estos productos SLB conservados, dichas sustancias químicas serán candidatos utilizados para la terapia de cóctel con bortezomib. Por otra parte, los pacientes con un fondo genéticamente débil debido a estos ortólogos SLB pueden tener efectos adversos graves tras la administración Bortezomib. Por lo tanto se espera que nuevas investigaciones sobre los ortólogos SLB en humanos en el futuro.
Materiales y Métodos
tratamientos de tensión, media, la cultura, y la droga
S. pombe
heterotálico haploides 972
h
- Opiniones y 975
h
+
y se utilizaron sus derivados. Completan rica YE, YES y se utilizaron medios mínimos EMM2 [29]. Las soluciones madre de bortezomib (LC Laboratories, Woburn, MA) se prepararon en DMSO y se añadieron a las drogas cultivo líquido o un medio de agar a la concentración indicada.
Sintético letal de detección
Para en todo el genoma detección, adoptamos la biblioteca supresión de la
S. pombe
haploides comprado a Bioneer Corp. (Corea). Las cepas de tipo salvaje de control son ED666 (
h
+ ade6-M210 ura4-D18 leu1-32
) y ED668 (
h
+ ade6-M216 ura4-D18 leu1-32
), que también se adquirieron de Bioneer Corp. La biblioteca de genes de supresión haploides se ofrece como stocks de glicerol en placas de 96 pocillos. En primer lugar, 5 l de cada población de supresión cepa fue vista en placas SI a partir de una placa de 96 pocillos usando el sistema de automatización de laboratorio BioMek FX (Beckman Coulter, Brea, CA). Después de 3 días de incubación a 26 ° C, una colonia de cada cepa fue recogido arriba y vio en otro plato Sí (considerado las placas madre) usando el robot rotor (Singer Instruments, UK). Una colonia se cuadruplicó para comprobar la reproducibilidad. A partir de las placas madre, detectaron colonias se recogieron de nuevo en marcha y manchas en las placas que contienen SI 0, 100, 250, y 500 M Bortezomib, respectivamente. platos manchados con diversas concentraciones del fármaco se incubaron durante 3 días a 26 ° C y se evaluó la formación de colonias de cada cepa. Para la validación del cribado primario, sensibilidades del bortezomib de cepas seleccionadas de la detección primaria se volvieron a analizar mediante pruebas de localización.
inmunotransferencia y purificación de proteínas
Para el análisis de inmunotransferencia, proteínas totales se extrajeron usando el ácido tricloroacético método (TCA). cantidades idénticas de proteínas se separaron por electroforesis en gel SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Anti-poli-ubiquitina (FK-2; monoclonal de ratón, MBL, Japón), anti-alfa-tubulina (TAT1; monoclonal de ratón, un regalo del doctor gaviota) y anti-Cdc13 (policlonal de conejo) se utilizaron como anticuerpos primarios. Peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpos secundarios y un sistema de quimioluminiscencia ECL (GE Healthcare) se utilizaron para amplificar la expresión de la señal. Para purificar las proteínas ubiquitinated, el método anteriormente descrito se aplicó con modificaciones menores [15].
microscopía fluorescente
Todas las imágenes fueron adquiridas mediante un ajuste de axioplan 2 (Zeiss, Alemania) microscopio de fluorescencia. Los métodos de construcción de GFP o RFP gen fusionado se describieron anteriormente [30].
Apoyo a la Información
Figura S1.
Bortezomib inhibe la proliferación de
S.pombe
. (A) El bortezomib y MG-132 se añadieron a un cultivo en fase logarítmica de
S. pombe
a las concentraciones indicadas y la proliferación celular se examinó durante 8 horas. Fold-aumenta a 8 horas después de la adición del fármaco se presentan en el eje y. (B) Los niveles de proteínas poli-ubiquitinated fueron examinados en presencia (+) o ausencia (-) de bortezomib 1 mM. proteínas poli-ubiquitinated acumulan de una manera dependiente del tiempo después de la adición de bortezomib
doi:. 10.1371 /journal.pone.0022021.s001 gratis (TIF)
figura S2.
se muestra un ejemplo de la detección primaria. Como se describe en el texto, todas las colonias de cada cepa con el gen eliminación fue descubierto para cada posición (A1, A2 ...) de placas de agar que sí con 0, 100, 250, y 500 mM Bortezomib. A la pantalla 2815 cepas, se prepararon 31 conjuntos de estas placas. Después de incubar a 26 ° C durante 3 días, se evaluó la formación de colonias. cepas de tipo salvaje fueron vistos a posiciones H2 y H3 (blanco línea discontinua). Las cepas manchados en A3, B8, B10, C10 y fueron seleccionados como candidatos que muestran graves defectos de crecimiento con 100 mM bortezomib y se volvieron a analizar mediante la detección de dilución en serie
doi:. 10.1371 /journal.pone.0022021.s002 gratis (TIF )
Figura S3.
sensibilidad a dosis más bajas de bortezomib. capacidad de colonias de formación de cinco mutantes SLB se examinó en medio de agar que contiene SÍ 0, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 mM, 10 mM y 100 mM Bortezomib como se describe en la Figura 2 (D). Bajo 10 M bortezomib, no se observó un crecimiento significativo defecto
doi:. 10.1371 /journal.pone.0022021.s003 gratis (TIF)
Tabla S1.
Lista de genes que se identificaron para mostrar defecto de crecimiento en presencia de 100, 250 y 500 mM Bortezomib de la criba primaria.
doi: 10.1371 /journal.pone.0022021.s004 gratis (XLS)
Reconocimientos
Tenemos una gran deuda con el Dr. Colin Gordon para suministrar el
S. pombe
cepas y el Dr. Keith gaviota para el suministro de anticuerpos.