Extracto
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Varias alteraciones en el metabolismo del RNA se han encontrado en las células de cáncer de pulmón; esto sugiere que las moléculas relacionadas con el metabolismo de ARN están implicadas en el desarrollo de esta patología. En este estudio, se realizaron búsquedas de RNA genes relacionados con el metabolismo que presentan diferentes niveles de expresión entre tejidos pulmonares normales y tumorales. Se identificaron ocho genes expresados diferencialmente en adenocarcinoma de pulmón de datos de microarrays. De éstos, siete fueron hasta reguladas mientras que uno fue regulada hacia abajo. Curiosamente, la mayoría de estos genes no hubieran sido previamente asociado con el cáncer de pulmón. Estos genes desempeñan diversos papeles en el metabolismo del mRNA: tres están asociados con el spliceosome (ASCL3L1, SNRPB y SNRPE), mientras que otros participan en los procesos de ARN-relacionados, tales como la traducción (MARS y MRPL3), la estabilidad del mRNA (PCBPC1), el transporte del ARNm (RAE ), o la edición de ARNm (ADAR2, también conocido como ADARB1). Por otra parte, se encontró una alta incidencia de la pérdida de heterozigosidad en el cromosoma 21q22.3, donde se encuentra el locus ADAR2, en líneas celulares de cáncer y tejidos primarios, lo que sugiere que la regulación a la baja de ADAR2 en cáncer de pulmón está asociado con pérdidas genéticas específicas. Por último, en una serie de pacientes con adenocarcinoma, la expresión de cinco de los genes desregulados (ADAR2, MARS, RAE, SNRPB y SNRPE) correlaciona con el pronóstico. Tomados en conjunto, estos resultados apoyan la hipótesis de que los cambios en el metabolismo del RNA están involucrados en la patogénesis del cáncer de pulmón, e identificar nuevas dianas potenciales para el tratamiento de esta enfermedad
Visto:. Valles I, Pajares MJ, Segura V , Guruceaga E, Gómez-romana J, Blanco D, et al. (2012) La identificación de genes relacionados con el metabolismo Novel Liberalizado ARN en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (8): e42086. doi: 10.1371 /journal.pone.0042086
Editor: Stefan Maas, Lehigh University, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Marzo, 2012; Aceptado: 2 Julio 2012; Publicado: 2 agosto 2012
Copyright: © Valles et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido apoyado por "proyecto UTE CIMA"; Gobierno español (ISCIII452RTICC RD06 /0020/0066, PI02 /1116 y PI10 /00166), el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) "Una Manera de Hacer Europa". Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es uno de los cánceres humanos más comunes y una causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1], [2]. Incluye dos principales subtipos histológicos, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), y esta última representa el 80-85% de todos los casos. El cáncer de pulmón se detecta a menudo en una fase avanzada, momento en el que la enfermedad es casi incurable. Además de la caracterización de las alteraciones biológicas asociadas con su patogénesis potencialmente podría ayudar a identificar nuevos biomarcadores para el diagnóstico precoz y nuevas dianas para terapias más eficaces.
El empalme alternativo es un proceso biológico esencial para la diversidad de proteínas. A través de corte y empalme alternativo, múltiples transcripciones se generan a partir de un solo precursor de ARNm. Las alteraciones de corte y empalme alternativo se ha demostrado que se asocia con diversas enfermedades, incluyendo el cáncer. Varios productos de genes empalmados alternativamente se han relacionado con el desarrollo de la enfermedad neoplásica [3]. variantes de empalme asociados con el cáncer pueden servir potencialmente como herramientas de diagnóstico y pronóstico, así como dianas terapéuticas en el cáncer [4]. En el cáncer de pulmón, muchas alteraciones de corte y empalme se han descrito anteriormente en los procesos relacionados con el cáncer tales como el crecimiento celular, el control del ciclo celular, apoptosis, o la angiogénesis [5] - [9]. Por ejemplo, se ha informado de altos niveles de la variante anti-apoptótica Bcl-xL para contribuir a la progresión del tumor tanto en SCLC y NSCLC [10], [11]. Recientemente, empalme cambios que afectaban a las transcripciones de VEGFA, MACF1, APP, y entumecido se demostraron en pacientes con adenocarcinoma de pulmón [9]. Por otra parte, se demostró la expresión de una isoforma específica de NUMB en muestras de tumores para promover la proliferación celular [9]. Además, la modulación de la caspasa 9 splicing alternativo se demostró para afectar a la sensibilidad de las células de NSCLC a algunos agentes quimioterapéuticos [12].
Los mecanismos subyacentes a corte y empalme alternativo aberrante en el cáncer de pulmón siguen siendo poco conocidos. En algunos casos, las mutaciones en los elementos reguladores de empalme dentro de la secuencia de nucleótidos del gen producen modificaciones en la selección del sitio de empalme, a su vez conduce a empalmados alternativamente transcripciones [13]. En otros casos, los cambios en las proteínas relacionadas con el metabolismo de ARNm-son responsables de los patrones de corte y empalme anormales. Algunos estudios han informado de cambios en la concentración, localización, la composición o la actividad de varias proteínas de unión a ARN en el cáncer de pulmón [14] - [19], lo que sugiere que esta vía es frecuentemente alterado y es importante para la transformación maligna. El ARN de unión a proteínas SF2 /ASF se sobreexpresa en tumores de NSCLC y promueve la supervivencia mediante la mejora de la expresión de survivina [18]. Estudios en modelos animales sugieren que la alteración del equilibrio entre diferentes proteínas de unión a ARN contribuye a la carcinogénesis de pulmón [20], [21]. Sin embargo, la caracterización del repertorio de moléculas relacionados con el metabolismo de ARN implicados en el cáncer de pulmón es actualmente incompleta, y están garantizados estudios adicionales.
En este estudio, que tuvo como objetivo identificar nuevos genes relacionados con el metabolismo de ARN-con expresión alterada en tumores primarios de pulmón. El uso de adenocarcinoma de pulmón microarrays de datos, se realizaron búsquedas de los genes que mostraron significativamente diferentes niveles de expresión entre los tejidos pulmonares normales y tumorales. Se identificaron siete ARNm de las proteínas relacionadas con el metabolismo hasta reguladas en los tejidos tumorales y una baja regulado. Algunos de los genes sobreexpresados pertenecen a la familia de las proteínas spliceosomal, implicando esta maquinaria celular en el desarrollo de NSCLC. El ADAR2 genes regulados a la baja se encuentra en una zona con una alta frecuencia de deleciones en NSCLC. Además, la expresión de cinco de estos genes se asoció con el pronóstico de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón, el apoyo a la importancia del metabolismo de ARN en la biología del cáncer de pulmón.
Resultados
gen de selección por análisis de la bioinformática
los genes pertenecientes a las categorías de ARN relacionados con el metabolismo fueron seleccionados de la base de datos de ontología de genes (www.godatabase.org). Tres categorías principales de ARN relacionados con el metabolismo se eligieron: "ARN vinculante", "empalme de ARN", y "spliceosome complejo". El factor de cambio (FC) de los niveles de expresión génica entre el tejido pulmonar normal y adenocarcinoma se calculó utilizando datos de tres experimentos de microarrays [22] - [24]. Se obtuvo un conjunto de genes con niveles de mRNA expresión significativamente diferentes entre los tejidos normales y cancerosas de cada uno de los tres experimentos de microarrays (Tabla S1). Un ejemplo representativo se muestra en la Figura 1A, y el solapamiento entre las diferentes listas se muestra en la Figura 1B. Además, se encontró que estos genes fueron expresados diferencialmente en el carcinoma de células escamosas, carcinoma de pulmón de células pequeñas, y los casos carcinoides presentes en los conjuntos de datos (datos no mostrados). Para corroborar la validez de esta selección, adicional
in silico
validación se realizó con una cuarta cohorte independiente de pacientes con adenocarcinoma de pulmón [25], y los resultados confirman las conclusiones del experimento inicial (Tabla S2).
) genes de ARN relacionadas con los niveles de expresión significativamente diferentes (P & lt; 0,01) entre las muestras de adenocarcinoma de pulmón y muestras de pulmón normal (últimos 10 columnas) en una de las bases de datos de microarrays utilizados en el estudio [23]. el color rojo indica altos niveles de expresión, mientras que el color verde indica bajos niveles de expresión. B) diagrama de Venn que corresponde a los genes con importantes diferencias de expresión entre las muestras normales y adenocarcinoma.
La expresión de genes relacionados con el metabolismo del RNA seleccionados en líneas celulares de cáncer de pulmón y de pulmón normal de cultivos primarios
los niveles de expresión de los genes seleccionados fueron evaluados por PCR convencional en SCLC y líneas de células de NSCLC y en las células NHBE primarios. Para la mayoría de los genes, los niveles de ARNm en las líneas celulares de cáncer de pulmón fueron mayores que en las células NHBE (Figura 2). Por otra parte, los niveles de mRNA fueron generalmente mayores en las líneas celulares de SCLC frente a líneas celulares de NSCLC. Este resultado está en concordancia con las observaciones anteriores en los que los niveles de expresión de otras proteínas de unión a ARN también se determinó que eran más altos en comparación con SCLC NSCLC [15]. En ADAR2, varias líneas celulares de cáncer de pulmón mostraron niveles de ARNm menores en comparación con las células NHBE. Se excluyeron RNPS1 y SNRPC en los análisis posteriores debido a que los niveles de expresión fueron homogéneos entre todos los tipos de células.
Los niveles de expresión se determinaron en líneas celulares de cáncer de pulmón y las células normales del epitelio bronquial humano (NHBE). GAPDH se utilizó como gen de control. SCLC: cáncer de pulmón de células pequeñas; ADC: adenocarcinoma; SCC: el carcinoma de células escamosas; LCC: carcinoma de células grandes; CT: tumor carcinoide; Carolina del Norte:. Control negativo (agua) guía empresas
Para cuantificar las diferencias en los niveles de expresión, PCR en tiempo real para cada uno de los ocho genes seleccionados se realizó en el panel de líneas celulares de cáncer de pulmón, así como en NHBE células y SAECs primarios normales. Este análisis confirmó los resultados anteriores: expresión de los genes regulados era mayor en las células de cáncer de pulmón en comparación con las células NHBE o SAECs. En cambio, la expresión ADAR2 en células de cáncer de pulmón fue menor que en las células NHBE o SAECs (Figura 3).
Los niveles de expresión se determinaron en líneas celulares de cáncer de pulmón y cultivos primarios de pulmón no malignas (NHBE y SAEC). HPRT se utilizó como gen de control. Las barras representan los coeficientes de expresión normalizaron con respecto a los niveles de genes en células NHBE. Ratios & gt; 1 indican mayores niveles de expresión que en las células NHBE, mientras que las proporciones & lt; 1 denotan bajos niveles de expresión
alteraciones genéticas en el locus ADAR2
Hemos caracterizado las alteraciones genéticas asociadas. ADAR2 con baja regulación en el cáncer de pulmón. Por lo tanto, se evaluó la presencia de LOH en 21q22.3, la ubicación del locus ADAR2. Se utilizó un panel de ocho microsatélites heterocigotos. Los microsatélites fueron amplificados por PCR y se analizaron mediante electroforesis capilar. la heterocigosidad de microsatélites se evaluó inicialmente en el panel de líneas celulares de cáncer de pulmón y los resultados se muestran en la Figura 4. En seis líneas celulares (H23, HCC827, A549, H322, H1385, y H1299), todos los microsatélites eran homocigotos. Aunque la presencia de pérdida de heterocigosidad (LOH) no es definitivamente concluyentes debido a la falta de ADN genómico normal correspondiente, este homozygosity es muy poco probable y sugiere fuertemente una pérdida de material genético. En otras líneas celulares de los resultados fueron variables, y ciertos casos sugirieron áreas de LOH (por ejemplo, la región más centromérica en células H157) localizados. A continuación, se comparó la homocigosis en 21q22.3 y los niveles de expresión de ARNm ADAR2 (obtenido anteriormente). Todas las líneas celulares homocigotos para los microsatélites expresan bajos niveles de ARNm ADAR2. De hecho, dos de las tres líneas celulares con los precios más niveles de expresión de ARNm ADAR2 (A549 y H1385) pertenecen a este grupo. En contraste, las cinco líneas de células con los más altos niveles de expresión ADAR2 (H82, H187, H157, H226 y H460) eran en su mayoría heterocigotos para los microsatélites que flanquean el locus ADAR2 (D21S171 y D21S1574).
homocigosidad (verde) o heterocigosidad (rojo) se determinó en cada línea celular. Los microsatélites están ordenados desde el más centromérica de los más telomérica. ADAR2 locus se encuentra dentro de D21S171 y D21S1574.
Se estudió la presencia de homocigosis en 21q22.3 en el ADN genómico de 48 pacientes con cáncer de pulmón. La evaluación de los ocho microsatélites en los tejidos tumorales y tejidos normales emparejados nos permitió determinar con precisión la frecuencia de LOH en esta región cromosómica. La figura 5A ilustra los tres patrones electroforéticos obtenidos alternativos: Caso de no informativa, retención de heterocigosidad, y LOH. Después de análisis de microsatélites, LOH fue identificado en aproximadamente el 30-40% de los casos (Figura 5B). LOH en 21q22.3 fue significativamente mayor en los carcinomas de células escamosas que en adenocarcinomas (25 ± 6% vs. 49 ± 7%, p = 0,003). No se encontraron diferencias en la frecuencia de LOH entre las etapas (etapa I: 37 ± 2% frente a los estadios II-III: 34 ± 7%, p = 0,279). Para evaluar el locus ADAR2 más específicamente, se analizó un SNP localizado en el gen ADAR2 (rs1051367). De las veinte casos informativos (es decir, los casos heterocigotos para rs1051367 SNP en el tejido normal), quince (75%) eran homocigotos en el tejido tumoral emparejado correspondiente. Una comparación entre los resultados obtenidos del análisis de microsatélites y SNP secuenciación demostró concordancia entre las técnicas respectivas, aunque el número de pacientes con LOH en el ADAR2 SNP fue mayor (30 a 40% vs. 75%).
se utilizaron ADN genómico de los cánceres primarios de pulmón y sus tejidos pulmonares normales correspondientes. A) Los ejemplos representativos de los patrones electroforéticos obtenidos por análisis de microsatélites: un caso no informativa, con sólo un pico de amplificación; retención de heterocigosidad, con dos picos en ambas muestras normales y tumorales; y LOH, con dos picos en la muestra normal, pero sólo un pico en la muestra de tumor correspondiente. Las flechas apuntan a los alelos de microsatélites. B) LOH de los microsatélites indicados se analizó en 48 pacientes con CPNM. Los microsatélites están ordenados desde el más centromérica de los más telomérica. LOH en el locus ADAR2 se analizó por secuenciación directa de los rs1051367 polimorfismo (A /G). cuadros de color verde representan LOH, cajas rojas indican la retención de heterocigosidad, y las cajas amarillas son loci no informativa.
La expresión de genes relacionados con el metabolismo del RNA y el resultado clínico del cáncer de pulmón
Hemos investigado si la expresión de los genes relacionados con el metabolismo de ARN expresados diferencialmente se asoció con resultados clínicos en pacientes con adenocarcinoma de pulmón utilizando un conjunto de datos de microarrays a disposición del público [26]. Los pacientes fueron divididos de acuerdo a los niveles altos y bajos de expresión de ARNm utilizando la mediana como el punto de corte (Figura 6). En el caso de ASCC3L1, MRPL3, y PABPC1, no se encontró asociación entre los niveles de ARNm y el resultado clínico de los pacientes (datos no mostrados). Alta expresión de Marte, Rae1, SNRPB, y SNRPE se asoció significativamente con la supervivencia global reducida. Los altos niveles de ARNm ADAR2 se asociaron significativamente con un mejor resultado. Para un análisis combinado de los cinco genes de pronóstico, los pacientes se dividieron en tres grupos: los pacientes sin acontecimientos desregulación, los pacientes con uno a tres eventos, y los pacientes con cuatro o cinco eventos. La puntuación combinada de los cinco genes fue un marcador pronóstico fuerte (Figura 6). Por lo tanto, los pacientes con eventos desregulación exhiben muy buena supervivencia. Por el contrario, los pacientes con la desregulación en cuatro o cinco de los genes mostraron la peor supervivencia. El modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizó para evaluar el impacto de la puntuación pronóstica en la supervivencia global, tanto en el análisis univariante y multivariante (tabla 1). La puntuación de ARN-metabolismo era un factor pronóstico independiente de la supervivencia global en pacientes con adenocarcinoma de pulmón.
Los datos se obtuvieron de un estudio de microarrays [26]. Las cifras muestran las curvas de Kaplan-Meier y log rank estadísticas para la supervivencia global en pacientes divididos en la expresión de ARNm de alta y baja (utilizando la mediana como punto de corte). La cifra final corresponde a pacientes divididos por el número de desregulación de eventos (ver Material y Métodos).
Discusión
Se identificaron ocho genes de ARN-relacionados expresados diferencialmente en el cáncer de pulmón , un hallazgo que apoya la hipótesis de que el ARN metabolismo es importante en la patogénesis del cáncer de pulmón. Siete de los genes identificados fueron reguladas, mientras que sólo uno fue regulada hacia abajo. Curiosamente, la mayoría de estos genes no se había informado anteriormente a estar asociado con cáncer de pulmón. Además, la expresión de la mayoría de estos genes mostró una asociación con la supervivencia global en pacientes con adenocarcinoma de pulmón, lo que sugiere una conexión entre el metabolismo del RNA y la patogénesis del cáncer de pulmón.
informes anteriores han demostrado que los genes de ARN-metabolismo están desreguladas y implicado en la transformación maligna de las células pulmonares [14], [16], [18]. Los resultados de nuestro estudio identifica un nuevo conjunto de genes expresados diferencialmente asociados con ARN-metabolismo. Está claro que la expresión de muchos otros genes de ARN-relacionado es alterado en el cáncer de pulmón. El grupo de genes identificados en nuestro estudio fue fuertemente influenciado por la estrategia rigurosa de selección. Los análisis estadísticos fueron restrictiva; Por lo tanto, se eligieron sólo los genes más importantes. Por otra parte, los cambios en el empalme, que han sido reportados para algunos genes de ARN-relacionados [17], [27], [28], no puede ser detectado mediante este enfoque analítico.
La mayoría de los genes de ARN-relacionados identificados en nuestro estudio fueron hasta reguladas en el tejido tumoral. La razón de esto no esta clara; puede ser debido a la mayor tasa metabólica asociada con la proliferación de células tumorales. Sin embargo, la gran mayoría de los genes de ARN-relacionados no mostró diferencias entre los tejidos pulmonares normales y tumor. Por otra parte, un gen de referencia definidos en nuestro estudio se downregulated (ADAR2), y la expresión del ARNm de cinco de los genes seleccionados se asoció con el resultado clínico en una serie de pacientes con adenocarcinoma. En particular, la alta expresión de genes regulados (MARS, Rae1, SNRPB, y SNRPE) se asoció con un peor pronóstico, mientras que la alta expresión del gen regulado por disminución (ADAR2) correlaciona con una mejor supervivencia. Curiosamente, el grupo de pacientes sin la desregulación en cualquiera de estos genes mostró muy buena supervivencia. Por otro lado, un alto número de eventos desregulación se asoció con la supervivencia pobre. Estos resultados sugieren que la actividad de la maquinaria de ARN-metabólica podría servir como un marcador de pronóstico para el cáncer de pulmón.
proteínas traducidas a partir de tres de los ocho genes regulados pertenecen a la familia de ribonucleoproteínas nucleares pequeñas spliceosomal ( snRNPs): ASCC3L1, SNRPB, y SNRPE. El spliceosome es un complejo de snRNPs además de una multitud de proteínas asociadas. Este complejo reconoce los sitios de empalme y elimina intrones a partir de moléculas de pre-ARNm. Poco se sabe acerca del papel desempeñado por la spliceosome en el cáncer. Recientemente, utilizando el análisis de la secuenciación del exoma, algunos estudios han identificado una alta frecuencia de mutaciones en los distintos componentes de la spliceosome en la leucemia linfocítica crónica y mielodisplasia [29] - [33], lo que implica esta maquinaria celular en el desarrollo del cáncer [34] . Por lo tanto, algunos inhibidores de spliceosomal han sido probados en las células cancerosas y la spliceosome se ha propuesto como un blanco contra el cáncer [35]. La identificación de tres spliceosomal proteínas expresadas diferencialmente en el cáncer de pulmón sugiere que un papel es interpretado por el spliceosome en esta malignidad. Por desgracia, hay poca información publicada sobre el papel de estas proteínas en el cáncer de particulares. ASCC3L1 (SNRNP200) codifica helicasa Brr2, un componente importante de la U5 spliceosomal snRNP. Para nuestro conocimiento, este estudio es el primero en demostrar que ASCC3L1 se asocia con malignidad. Pequeño ribonucleótido nuclear proteína asociada B (SNRPB) es parte de snRNP U1. SNRPB se ha informado de que un supresor de la metástasis en un modelo de aloinjerto de ratón de cáncer de próstata [36]. Un polimorfismo en el gen rara SNRPB se ha asociado con un menor riesgo de cáncer de mama en portadoras de mutaciones BRCA1 [37]. La sobreexpresión de pequeña ribonucleótido nuclear de la proteína asociada a E (SNRPE) según los informes, se ha asociado con la detención del crecimiento en la fase G2 tanto en las células malignas y no malignas [38]. Sin embargo, de acuerdo con nuestros resultados, SNRPE se amplifica y se sobreexpresa en los gliomas malignos y carcinomas de células escamosas orales [39], [40]. SNRPE también se amplifica y hasta regulado en el carcinoma hepatocelular y puede funcionar como un oncogén mediante el aumento de la proliferación celular [41].
Las otras proteínas que son regulados hasta en nuestro estudio fueron MARS, MRPL3, PABPC1 y RAE . La metionina-tRNA sintetasa (MARS o MetRS) actúa como un catalizador en la unión de la metionina a su correspondiente tRNA. Aumento de la actividad de esta enzima ha sido reportado en cáncer de colon humano [42]. Más recientemente, una inducción de la expresión MARS se muestra en líneas celulares de cáncer de mama estimuladas con factor de crecimiento similar a la insulina [43]. mutaciones frameshift en MARS se han descrito en los carcinomas gástricos y colorrectales con inestabilidad de microsatélites [44]. Mitocondrial L3 proteína ribosomal (MRPL3) es un componente de la subunidad 39S del ribosoma mitocondrial. Alta expresión de esta proteína se ha informado en hepatocarcinoma, carcinoma de colon, y el linfoma, lo que sugiere una asociación de esta proteína con altas tasas de división celular [45]. Poli-A de unión a proteína citoplasmática 1 (PABPC1) participa en poli-A acortamiento en el extremo 3 'de los ARNm eucariotas. Se han reportado resultados contradictorios en cuanto al papel de esta proteína en el cáncer. Un estudio concluyó que los niveles bajos de PABPC1 correlacionados con los tumores más invasivos y peores tasas de supervivencia en pacientes con cáncer de esófago [46]. Sin embargo, en otros estudios, PABPC1 sobre-expresión se describe en los tumores de próstata [47], carcinoma hepatocelular [48], cáncer de vejiga superficial [49], y el cáncer de pulmón [50]; en este último informe, los autores sugieren la participación del complejo de iniciación de la traducción en el proceso tumoral en el cáncer de pulmón. PABPC1 también regula la actividad de la telomerasa, lo que lleva a una ventaja de crecimiento en los queratinocitos expresan papiloma humano tipo 16 E6 [51]. Exportación de ARN 1 homólogo (Rae1) es una proteína de exportación nuclear participan en el transporte de ARNm desde el núcleo hasta el citoplasma. Rae1 también juega un papel crítico en el mantenimiento de la bipolaridad del huso durante la división celular [52], [53]. Rae1 ARNm y los niveles de proteína disminuyen la inhibición de la proliferación celular del neuroblastoma, y su sobreexpresión evita la detención del ciclo celular inducida por el ácido retinoico y la diferenciación [54]; Sin embargo, un estudio previo demostró que los ratones mutantes /Nup98 Rae1 son más susceptibles a tumores pulmonares inducidos por DMBA en comparación con los ratones de tipo salvaje, lo que indica que combina Rae1 /NUP98 Haplo-insuficiencia potencialmente promueve la tumorigénesis [55].
El gen deaminasa adenosina downregulated que actúa sobre el ARN 2 (ADAR2 o ADARB1) es un editase ARN que cataliza la desaminación de la adenosina a inosina en las regiones de doble cadena. La desregulación de la adenosina a inosina edición en los cánceres humanos potencialmente contribuye al programa transcripcional alterada necesario para sostener la carcinogénesis [56]. ADAR2 se expresa ubicuamente en muchos tejidos, en particular en el sistema nervioso central [57]. epilepsia de inicio temprano y la muerte prematura fueron reportados en ADAR2 ratones knock out [58]. En el cáncer, un estudio previo reportó la sobreexpresión de ADAR2 en
in vitro
células transformadas adultas humanas madre mesenquimales, fibroblastos transformados, y algunas líneas de células de otros tejidos [59]. Los niveles más altos de mRNA ADAR2 se observaron también en líneas celulares de cáncer de próstata independientes de andrógenos en relación con las líneas de células sensibles a andrógenos [60]. Sin embargo, la mayoría de los informes vinculan el cáncer con la expresión o actividad reducida ADAR2. Por lo tanto, una disminución de la actividad enzimática de ADAR2 en pacientes con glioblastoma multiforme (MGB) se asoció con mayor Ca
2 + permeabilidad y la activación de la vía de Akt, contribuyendo al crecimiento del tumor y la agresividad [61], [62]. Paz et al. También encontraron una disminución de los niveles de mRNA ADAR2 en los tumores cerebrales y demostró que su sobreexpresión en una línea celular MGB produjo una disminución de la proliferación celular [63]. Una disminución en la actividad de edición ADAR2, que se correlacionaban con el grado de malignidad, también se encontró en los astrocitomas pediátricos [64]. Cuando el estado de edición se revirtió en tres líneas de células de astrocitoma, se encontró una disminución significativa en el comportamiento maligno de células [64]. Más recientemente, Galeano et al. observado una disminución general de edición de eventos mediados por ADAR2 en la vejiga y el cáncer de colon [65]. En el caso de cáncer de pulmón, una reducción de la expresión ADAR2 se ha descrito anteriormente en el carcinoma de pulmón de células escamosas [66].
regulación a la baja de ADAR2 en cáncer de pulmón está asociada potencialmente con alteraciones genéticas en 21q22, donde el gen es ADAR2 situado. Estudios previos han informado de la pérdida de material genético en el brazo largo del cromosoma 21 en pacientes con varios tumores sólidos [67] - [71], incluyendo el cáncer de pulmón [72] - [76]. Lee et al. analizaron nueve marcadores microsatélites, colocados entre 21q21.1 y 21q22.3 en pacientes con CPNM. LOH se detectó durante al menos uno de ellos en más de 55% de los tumores, con una tasa de incidencia LOH -48% 26% en microsatélites individuales [74]. Sato et al. describe LOH en 21q22.3 en 28% de las muestras de adenocarcinoma y los pacientes de carcinoma de células escamosas [72]. Nos centramos en el análisis de las alteraciones 21q22.3 en la región de ADAR2. Encontramos un 30-40% de incidencia de LOH en los pacientes con CPNM, con casi la mitad de los tumores (23 de 48) que presenta LOH en al menos uno de los microsatélites analizados. De acuerdo con estudios anteriores, carcinomas de células escamosas mostraron una mayor frecuencia de LOH en 21q22 que los adenocarcinomas. Además, se observó una muy alta incidencia de LOH (75%) en el análisis de un SNP localizado en el gen ADAR2. Estos resultados pueden explicarse por la existencia de alternando regiones con y sin LOH, e indican que el locus genético ADAR2 es una de las regiones modificadas con mayor frecuencia en la carcinogénesis pulmonar. En conjunto, las pérdidas genéticos frecuentes en el locus ADAR2 y su reducción de expresión sugieren que ADAR2 potencialmente funciona como un supresor de tumores en el cáncer de pulmón. Los datos funcionales también apoyan esta hipótesis, ya que la sobreexpresión de ADAR2 en líneas celulares de cáncer inhibe la proliferación y la migración [63], [64]. Por otra parte, hemos demostrado que los bajos niveles de ARNm ADAR2 están asociados significativamente con la supervivencia global en pacientes con adenocarcinoma de pulmón. Una puntuación de pronóstico basado en la expresión de genes ADAR2 y cuatro relacionados con el metabolismo de ARN adicionales (MARS, Rae1, SNRPB y SNRPE) puede estratificar a los pacientes con cáncer de pulmón en grupos de alto y bajo riesgo de muerte por cáncer. La investigación adicional es orden para examinar si esta información puede ser útil para identificar a los pacientes con CPCNP resecable que están en alto riesgo de recurrencia y se beneficiarían de la terapia adyuvante
.
En conclusión, en este estudio hemos identificado nueva metabolismo del RNA relacionadas con los genes expresados diferencialmente en el cáncer de pulmón y se asocian con el resultado clínico. Estos resultados apoyan el papel del metabolismo de ARN en la patogénesis de esta enfermedad. Además de la caracterización de los mecanismos que regulan este proceso puede potencialmente conducir al desarrollo de mejores estrategias para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el comité ético de la Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, España) y el hospital Marqués de Valdecilla (Santander, España). escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente
experimentos de microarrays
Cuatro experimentos de microarrays a disposición del público se utilizan para identificar el ARN del metabolismo de los genes expresados diferencialmente relacionados entre adenocarcinoma de pulmón y el tejido pulmonar normal [22]. - [25]. Algunos de estos experimentos incluyeron datos de otros subtipos histológicos. Un quinto experimento de microarrays se utilizó para analizar la relación entre los niveles de expresión de genes y el pronóstico en pacientes con adenocarcinoma de pulmón [26]. Tabla S3 contiene información sobre el número de muestras y los subtipos histológicos presentes en cada estudio.
líneas celulares de cáncer de pulmón y cultivos primarios
líneas celulares de cáncer de pulmón se obtuvieron de la American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). Las células fueron cultivadas en medio RPMI suplementado con glutamina 2 mM, suero bovino fetal 10%, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas (SAEC) se adquirieron de Lonza (Walkersville, MD) y se cultivaron en las vías respiratorias pequeñas medio de crecimiento epitelial (SAGM, Lonza) suplementado con SAGM SingleQuots (Lonza). Las células normales del epitelio bronquial humano (NHBE) (Clonetics, San Diego, CA) se cultivaron en medio de crecimiento de células del epitelio bronquial (BEGM, Clonetics) complementado con los suplementos de crecimiento de la BulletKit (Clonetics). Los cultivos de células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2 en un incubador humidificado. Antes de la extracción de ARN o ADN, las células se ensayaron para
Mycoplasma
la contaminación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MycoAlert Kit de Detección de Mycoplasma, Cambrex, Rockland, ME).
Muestras Clínicas
los tumores primarios y sus correspondientes tejidos pulmonares normales se obtuvieron de pacientes con CPNM tratados con cirugía de resección curativa de la Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, España) o en el hospital Marqués de Valdecilla (Santander, España). Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Quirúrgicamente muestras retiradas se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Sólo se usaron muestras que contienen células tumorales más de 70%. Las histologías y etapas de los tumores incluidos en el estudio se enumeran en la Tabla S4. Los tumores se clasifican de acuerdo con la OMS 2004 de clasificación [77].
La extracción de RNA
La extracción de RNA se llevó a cabo utilizando ARN Ultraspec (Biotecx Laboratories, Houston, TX). Para tejidos primarios, la extracción de RNA se llevó a cabo después de la fragmentación mecánica de las muestras congeladas, utilizando β-mercaptoetanol y RNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las muestras de ARN se diluyeron en agua con DEPC y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. La concentración de ARN se determinó por espectrofotometría (Nanodrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE).
La transcripción inversa (RT)
Dos microgramos de ARN se incubaron con 1 mM dNTPs y 50 ng /l de oligo -dTs a 65 ° C durante 5 minutos. Posteriormente, se añadieron 4 l de 5 x tampón RT, 1 l de DTT 0,1 M, 40 U de RNasa Out y 200 U de transcriptasa inversa del Súper Guión III (todos de Invitrogen). Los tubos se incubaron 50 minutos a 50 ° C y 15 minutos a 70 ° C, y luego se colocan en hielo. Finalmente, se añadieron 2 U de RNasa H (Invitrogen), y los tubos se incubaron 20 minutos a 37 ° C.