Extracto
Aplicaciones
La heparina de unión a factor de crecimiento epidérmico-como factor de crecimiento (HB-EGF) es un miembro de la familia del factor de crecimiento epidérmico. La membrana proHB-EGF es conocido por ser un precursor de la forma soluble de HB-EGF (SHB-EGF), que promueve la proliferación celular y la supervivencia. Mientras que las funciones de SHB-EGF se han estudiado ampliamente, aún no se entiende completamente si proHB-EGF también participa en los eventos de señalización celulares. En este estudio, hemos utilizado los anticuerpos monoclonales anti-HB-EGF Y-142 y Y-073, que tienen especificidades diferenciales hacia proHB-EGF, con el fin de dilucidar las funciones de proHB-EGF en células de cáncer.
Experimental Diseño
Las actividades biológicas de proHB-EGF se evaluaron en la proliferación celular, la activación de caspasa, y ensayos de actividad juxtacrine mediante el uso de una cultura esferoide 3D de NUGC-3 células.
resultados
y-142 e y-073 exhibían actividades similares unión y neutralización de SHB-EGF. Sin embargo, sólo Y-142 obligado a proHB-EGF. Hemos podido detectar la función del expresado de forma endógena proHB-EGF en una cultura esferoide 3D. El bloqueo de proHB-EGF con Y-142 reducido la formación de esferoides, suprimió la proliferación celular, y el aumento de la activación de caspasas en la cultura esferoide 3D de NUGC-3 células.
Conclusiones
Nuestros resultados muestran que proHB- EGF actúa como un factor de la proliferación celular y la supervivencia celular en las células cancerosas. Los resultados sugieren que proHB-EGF puede desempeñar un papel importante en la progresión tumoral
Visto:. Sato S, H Kamada, Watanabe T, Tsuji I, J Fan (2013) Identificación de la proliferación de células cancerosas y las funciones de supervivencia de proHB-EGF mediante el uso de un anticuerpo anti-HB-EGF. PLoS ONE 8 (1): e54509. doi: 10.1371 /journal.pone.0054509
Editor: Emilio Hirsch, de la Universidad de Turín, Italia |
Recibido: 29 Agosto, 2012; Aceptado: December 12, 2012; Publicado: 21 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Sato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Todos los autores son /eran empleados de Takeda Pharmaceutical Company Limited o Takeda San Francisco, Inc. y se pagan como tales. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
HB-EGF es un miembro de la factor de crecimiento epidérmico (EGF) la familia de factores de crecimiento [1]. Se sintetiza como una proteína transmembrana, proHB-EGF, compuesto de un péptido señal; un pro-péptido; y de unión a heparina, similar a EGF, juxtamembrane, transmembrana y dominios citoplásmicos [2]. Durante el estrés celular, proHB-EGF se somete a derramamiento ectodominio que libera la forma soluble, SHB-EGF, y el fragmento C-terminal intracelular (CTF) [3], [4]. SHB-EGF ejerce una actividad mitogénica y /o quimiotáctica potente a través de la activación de sus receptores EGFR y ERBB4 [1], [5], [6]. El CTF se transloca en el núcleo e induce la expresión del gen de la ciclina A y cyclinD2 por la supresión de la función de PLZF y BCL6, respectivamente [7], [8].
Además de ser un precursor de SHB-EGF y CTF, proHB-EGF tiene propiedades únicas como un receptor de toxina de la difteria [9], una molécula de adhesión celular [10], y un factor de juxtacrine [11]. toxina de la difteria unión a proHB-EGF es potenciada por CD9 o moléculas similares a la heparina [12], [13], y la unión provoca la inhibición de la síntesis de proteínas a través de la internalización de la toxina de la difteria complejo-proHB-EGF. Como una molécula de adhesión celular, proHB-EGF contribuye a blastocisto adhesión al útero durante la implantación en ratones [10]. La actividad de yuxtacrina proHB-EGF se observó por primera vez en un sistema de co-cultivo, donde se sembraron las células proHB-EGF en las células que sobreexpresan EGFR con sobreexpresión [11]. Para aislar y evaluar la señalización iniciada por proHB-EGF por separado de la iniciada por SHB-EGF, las células proHB-EGF-sobreexpresan se fijaron con formalina, evitando de este modo la liberación de SHB-EGF. En este sistema de co-cultivo, las células que promueve la síntesis de ADN y la apoptosis en las células impedido que sobreexpresan EGFR en algunos de los estudios proHB-EGF que sobreexpresan donde se utilizó [11], [14], [15]. Por el contrario, cuando las células proHB-EGF-overexpressing intactos no se fijaron con formalina, que inhiben la síntesis de ADN y promueven la apoptosis en las células que sobreexpresan EGFR en una condición de co-cultivo modificado [16]. Las funciones de proHB-EGF también se evaluaron mediante el análisis de los efectos de proHB-EGF sobreexpresión en eventos celulares autónomos. La proliferación proHB-EGF sobreexpresión suprimido o promovido celular en diferentes líneas celulares [17], [18]. Por lo tanto, los papeles de proHB-EGF no han sido consistentemente o claramente dilucidado.
En este estudio, hemos evaluado las funciones de proHB-EGF en las células del cáncer mediante el uso de 2 anticuerpos monoclonales anti-HB-EGF que tienen diferentes especificidades hacia proHB-EGF. Nuestros hallazgos sugieren que proHB-EGF desempeña un papel en la proliferación y supervivencia de las células cancerosas.
Anticuerpos monoclonales
Materiales y Métodos
Materiales
El anti-HB-EGF Y- 073 e y-142 y SHB-EGF se generaron anteriormente [19]. En breve, Y-142 se preparó mediante la inmunización de ratones BALB /c (Japan Clea) con inyecciones subcutáneas de lapa ojo de cerradura hemocianina conjugado SHB-EGF y las inyecciones abdominales de 293F células (Invitrogen) transfectadas de forma transitoria con un plásmido de expresión de proHB-EGF. Y-073 se obtuvo por inmunización de ratones BALB /c con inyecciones subcutáneas de lapa ojo de cerradura hemocianina conjugado SHB-EGF. Ambos anticuerpos se purificaron a partir de su sobrenadante de cultivo de hibridoma con rProteinA Sepharose (GE Healthcare). SHB-EGF se preparó a partir del sobrenadante de cultivo de células 293F (Invitrogen) transfectadas con un plásmido de expresión de SHB-EGF [19]. También se utilizaron los siguientes reactivos: control del ratón IgG y rábano picante marcada con peroxidasa (HRP-etiquetados) anti-ratón-anticuerpo IgG de Jackson ImmunoResearch Laboratorios; Alexa488 anti-ratón marcada anticuerpo IgG, anticuerpo anti-IgG de cabra marcado con HRP, y marcado con HRP de anticuerpos IgG anti-conejo de Invitrogen; anti-anfirregulina (ARG-anti) anticuerpo monoclonal, anti-HB-EGF anticuerpo policlonal, anticuerpo policlonal anti-EGFR, y el anticuerpo policlonal anti-EGFR biotinilado de R & amp; D Systems; anti-β-actina de anticuerpos de Señalización Celular Tecnología; erlotinib de Selleck productos químicos; biotinilado anticuerpo anti-fosfotirosina de Millipore; sulfotagged estreptavidina de Meso Escala Descubrimiento; y forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) de Wako.
Cell Cultura y
NUGC-3 células de cáncer de estómago (Colección japonesa de Recursos Biológicos de Investigación), 5637 células de cáncer de vejiga (American Type Culture Collection), y BxPC-3 células de cáncer de páncreas (American Type Culture Collection) se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero. células de cáncer de ovario EFO-27 (DMSZ) se mantuvieron en medio RPMI 1640 con 20% de suero. Las células se mantuvieron en placas de cultivo celular en 2D, y para experimentos de cultivo de esferoide 3D, que se transfirieron a una placa de cultivo de Celltight esferoide (Sumitomo Bakelite).
Citometría de Flujo
Las células se separan de una placa de cultivo con tampón de disociación celular (Invitrogen) y se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-HB-EGF o anticuerpo monoclonal anti-ARG durante 1 hora a 4 ° C. Después de lavar con PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA), las células se incubaron con anticuerpo secundario marcado con Alexa488 durante 1 hora a 4 ° C. La expresión de proteínas se midió utilizando un instrumento de FACS CantoII (Becton Dickinson), y los datos se analizaron a continuación con el software FlowJo (Árbol estrella). Para generar un control positivo para la unión de la anti-ARG anticuerpo, EFO-27 células fueron transfectadas con un plásmido de expresión ARG utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
SHB-EGF-Ensayo de unión
se detectó la actividad de unión de anti-HB-EGF anticuerpo monoclonal a SHB-EGF como se describe anteriormente [19]. SHB-EGF o BSA se inmovilizó a 1 mg /ml en una placa de 96 pocillos durante la noche a 4 ° C. Después de la unión no específica fue bloqueada con PBS que contenía 1% de BSA, el anticuerpo monoclonal anti-HB-EGF se incubó a varias concentraciones en la placa. anticuerpo IgG anti-ratón marcado con HRP se hizo reaccionar después durante 1 h a temperatura ambiente. TMB peroxidasa EIA Substrato (Bio-Rad) se añadió a continuación, en cada pocillo. la unión a SHB-EGF anticuerpo se detectó mediante la medición de la absorbancia a 450 nm usando un lector de placas de SPECTRA MAX (Molecular Devices).
EGFR Ensayo de fosforilación
La actividad inhibidora de anti-HB- se detectó anticuerpo monoclonal contra EGF fosforilación de EGFR inducida por SHB-EGF como se describe anteriormente [19]. células NUGC-3 se sembraron a 1 x 10
4 células /pocillo en medio RPMI 1640 con 1% de suero. Después de un período de incubación de 1-d, las células se trataron con varias concentraciones de anticuerpo anti-HB-EGF y 10 nM SHB-EGF durante 15 min a 37 ° C. Los lisados celulares se prepararon con tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Applied Science) y un cóctel inhibidor de fosfatasa (Sigma Aldrich) y se utilizaron para el análisis con un kit ELISA de detección de pEGFR (R & amp; D Systems).
proliferación celular y caspasa Ensayos
Las células se sembraron a una concentración de 1 × 10
4 células /pocillo en medio RPMI 1640 que contiene 1% de suero en placas de cultivo Celltight Esferoide. Se midió la caspasa 3/7 de activación después de un 1-d período de incubación mediante el uso de la caspasa-Glo 3/7 (Promega) y la proliferación celular se mide después de un 3-d período de incubación mediante el uso de CellTiter-Glo (Promega). Las mediciones para ambos parámetros se obtuvieron utilizando un instrumento Envision (Perkin Elmer). La proliferación celular se calculó como el porcentaje del nivel de proliferación medido en ausencia de anticuerpo.
siRNA transfección
células NUGC-3 se transfectaron con ARNsi de control negativo o HB-EGF siRNA (Dharmacon) utilizando Lipofectamine 2000 durante el cultivo celular 2D. El HB-EGF siRNA utilizado en este estudio fue una mezcla de 4 siRNAs, comprado a Dharmacon (cat. L-019624-00-005) y se transfectó a una concentración final de 6 nM (1,5 nM para cada siRNA). Después de la transfección, las células se transfirieron a un cultivo esferoide 3D. células siRNA transfectadas a continuación, se utilizaron en el ensayo de proliferación celular. Reducción de la expresión de la proteína HB-EGF fue examinado por Western blot. expresión de HB-EGF fue detectada por los anticuerpos anti-HB-EGF anticuerpo policlonal y el anticuerpo anti-IgG de cabra marcado con HRP. β-actina, control interno de carga, se detectó con anti-β-actina de anticuerpos y de anticuerpos IgG anti-conejo marcado con HRP.
Medición de proHB-EGF juxtacrine Actividades en el
NUCG-3 las células fueron incubadas con 200 nM y-142 o y-073 durante los tiempos indicados bajo la condición de cultivo de esferoides. IgG de ratón control (200 nM) y erlotinib 1 nM también se utilizaron en el ensayo como controles negativo y positivo, respectivamente. Para la detección de la fosforilación de EGFR, los lisados celulares preparados como se describió anteriormente, se incubaron en una placa de lector Imager Sector 6000 (Meso Escala Descubrimiento) pre-revestido con anticuerpo policlonal anti-EGFR. La placa se incubó con anticuerpo anti-fosfotirosina biotinilado, seguido de incubación con estreptavidina sulfotagged. Para la detección de EGFR totales, los lisados celulares se incubaron en una placa de 6000 Lector Sector Imager recubierto con un anticuerpo policlonal anti-EGFR. a continuación, el anticuerpo policlonal anti-EGFR biotinilado se incubó en la placa, seguido de incubación con estreptavidina sulfotagged. Leer continuación, se añadió tampón T (Meso Escala Descubrimiento), y la quimioluminiscencia se midió con un instrumento de Imágenes del Sector 6000 (Meso Escala Descubrimiento). La señal de fosforilación de EGFR se normalizó a la señal total EGFR y se ha calculado como el porcentaje de la fosforilación máxima de EGFR que se midió en ausencia de Y-142, Y-073, el control de IgG, y erlotinib.
Para la detección de la fosforilación de ERK1 /2 y AKT, se utilizó el kits phosphoAKT phosphoERK1 /2 y (Meso Escala Descubrimiento), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. En breve, los lisados celulares preparados como se describe anteriormente se añadieron a la placa con manchas de anti-ERK1 /2 y anti-anticuerpos phosphoERK1 /2, o con manchas de anticuerpos anti-phosphoAKT anti-AKT y. A continuación, cada placa se incubó con sulfotagged anti-ERK1 anticuerpo /2 o con el anticuerpo anti-AKT sulfotagged. Leer T búfer con A continuación se añadió tensioactivo, y la quimioluminiscencia se midió con un Imager Sector 6000 instrumento. La señal de ERK1 /2 o fosforilación de AKT se normalizó a la señal total ERK1 /2 o AKT, respectivamente. ERK1 /2 o la fosforilación de Akt se calcula entonces como el porcentaje de la máxima fosforilación de ERK1 /2 o AKT, respectivamente, que se midió en ausencia de Y-142, Y-073, el control de IgG, y erlotinib.
Detección de CTF
NUGC-3 células fueron tratadas con 200 nM y-142 para 3 d o 50 nM de PMA durante 30 min como un control para derramar inducción ectodominio y producción CTF. Los lisados celulares preparados como se ha descrito anteriormente se sometieron a western blot. El fragmento de CTF se detectó utilizando el anticuerpo policlonal anti-CTF y el anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con HRP. Anti-CTF anticuerpo policlonal se generó por inmunización de un conejo con un péptido antígeno correspondiente a los aminoácidos 185-208 de proHB-EGF, tal como se describe anteriormente [20].
Resultados
Caracterización de Y -142-073 e y
un gran número de anticuerpos neutralizantes anti-HB-EGF se generaron utilizando un enfoque de hibridoma como se informó anteriormente [19]. Durante la caracterización de los anticuerpos neutralizantes, se encontró que los anticuerpos mostraron unión hacia la forma unida a la membrana transitoriamente overexpressed de HB-EGF, proHB-EGF diferencial. Este hallazgo nos permitió la hipótesis de que la caracterización de los anticuerpos podría conducir a la identificación de la función proHB-EGF. Se seleccionaron 2 anticuerpos, Y-142 como un aglutinante proHB-EGF y Y-073 como un aglutinante no proHB-EGF, y se compararon sus características en las células cancerosas. En primer lugar, hemos confirmado que Y-142 e Y-073 tenían diferentes perfiles de unión a líneas de células cancerosas que expresan endógenamente proHB-EGF. Y-142 con destino a las líneas celulares de cáncer de prueba, mientras que Y-073 no mostró unión (fig. 1A).
A. La unión de anti-HB-EGF anticuerpos a proHB-EGF. Las células se incubaron con anticuerpo anti-HB-EGF, seguido de incubación con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Alexa488. La unión se detectó por citometría de flujo. Sin IgG, línea de negro; Y-142, histograma negro; Y-073, histograma gris. B. Expresión de anfirregulina (ARG) en líneas celulares de cáncer. Las células se incubaron con anticuerpo anti-ARG, seguido de incubación con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Alexa488. La actividad de unión de anticuerpo anti-ARG se confirmó usando células EFO-27 transfectadas con un plásmido de expresión ARG. Sin IgG, línea de negro; anticuerpo anti-ARG, histograma gris.
ligandos de EGFR incluyen HB-EGF, anfirregulina (ARG), factor de crecimiento tumoral α, β1 neuregulina, EGF, betacelulina y, y nuestro estudio anterior mostró que Y- 142 recognizesARG además de HB-EGF [21]. Ambos ligandos se expresan como formas unidas a la membrana de la superficie celular [22]. Por lo tanto, para confirmar que la unión a las células Y-142 fue atribuible a su reconocimiento de proHB-EGF, y no a ARG, expresión ARG fue examinado por citometría de flujo, y no se detectó expresión ARG (Fig. 1B). Para descartar la posibilidad de que el anticuerpo anti-ARG no tenía actividad de unión para ARG, hemos utilizado transfectadas ARG como control positivo. Este resultado confirmó además que la unión de Y-142 a las líneas celulares de cáncer probadas fue atribuible a su reconocimiento de proHB-EGF. También se probó la especificidad ligando de EGFR de Y-073 e Y-073 se unía específicamente a HB-EGF (datos no mostrados).
Para examinar más a fondo las características de los anticuerpos, se ensayó su actividad de unión a SHB -EGF por ELISA. Curiosamente, Y-142 e Y-073 obligados a SHB-EGF con comparables CE
50 valores de 56 pM y 110 pM, respectivamente, y ninguno de ellos vinculado a la BSA control negativo (Fig. 2A). Además, hemos probado su actividad neutralizante sobre la fosforilación de EGFR inducida por SHB-EGF. La línea celular de cáncer de estómago NUGC-3 se utilizó para detectar la fosforilación de EGFR debido a su alta expresión de EGFR. Como se muestra en la Fig. 2B, tanto de los anticuerpos inhibe la fosforilación de EGFR en una manera dependiente de la concentración con IC similares
50 valores (Y-142 = 3,8 nM; Y-073 = 4,1 nM). Estos resultados indican que sólo Y-142 tenía la capacidad de unirse a proHB-EGF, aunque ambos Y-142 e Y-073 tenían actividades de unión y neutralizantes similares hacia SHB-EGF.
A. la actividad de Y-142 e Y-073 hacia SHB-EGF. El anticuerpo anti-HB-EGF se incubó a varias concentraciones en un-EGF-revestido SHB o una placa recubierta con BSA. Unión de los anticuerpos se detectó con un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con HRP. la unión a BSA, cuadrado blanco Y-142; la unión a BSA, círculo blanco Y-073; Y-142 vinculante para SHB-EGF, cuadrado negro; la unión a SHB-EGF, círculo negro Y-073. Los puntos de datos representan la media ± desviación estándar (DE) de los valores adquiridos por duplicado. B. Actividad neutralizante de Y-142 e Y-073 contra la fosforilación de EGFR inducida por SHB-EGF. anticuerpo anti-HB-EGF se incubó a las concentraciones indicadas en la presencia de 10 nM SHB-EGF con NUGC-3 células durante 15 minutos a 37 ° C. Los lisados celulares se incubaron en una placa recubierta con anticuerpo anti-EGFR, seguido de incubación con anticuerpo anti-fosfotirosina marcado con HRP. Sin SHB-EGF, círculo blanco; SHB-EGF y el control de IgG, cuadrado blanco; SHB-EGF e Y-142, cuadrado negro; SHB-EGF e Y-073, círculo negro. Los puntos de datos representan la media ± desviación estándar de los valores adquiridos por triplicado.
Proliferación Celular y funciones de supervivencia de proHB-EGF
Un estudio previo ha demostrado que proHB-EGF está implicada en contacto célula-célula [10]. En una cultura esferoide 3D, las células cancerosas se someten a más amplios contactos célula-célula que en una cultura 2D [23]. Especulamos que el efecto proHB-EGF mediada por contacto célula-célula podría ser más pronunciada y más fácil de detectar en la cultura esferoide 3D. Con este fin, se estableció un ensayo basado en células de cultivo de esferoides 3D mediante el uso de NUGC-3 células. Cuando las células NUGC-3 se sembraron en una placa de cultivo de esferoides, formaron un esferoide con una masa de células pequeñas en el núcleo central y las células débilmente distribuidas que rodean el núcleo (gris oscuro y gris claro, respectivamente, en el control de PBS en la Fig. 3A ). Curiosamente, en el marco del tratamiento Y-142, las células eran más difusa y tenía un núcleo central más pequeño y un halo mayor. El cambio morfológico causado específicamente por Y-142 sugiere que este cambio en la morfología esferoidal era atribuible a la modulación de las funciones proHB-EGF. Además, exploramos las funciones proHB-EGF mediante el ensayo de cultivo de esferoide 3D. En el ensayo de proliferación celular, Y-142 inhibió significativamente la proliferación de NUGC-3 de una manera dependiente de la concentración (Fig. 3B). La inhibición de la proliferación celular alcanzó 72% a la concentración máxima de anticuerpos. Por el contrario, Y-073 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación. Se obtuvieron resultados similares en las otras líneas celulares ensayadas, es decir, 5637 y BxPC-3 (Fig. 3B). Como Y-073 inhibe las funciones de SHB-EGF y no tuvo ningún efecto sobre cualquiera de las líneas celulares proHB-EGF en la cultura esferoide, se sugirió que la función endógena de proHB-EGF fue dominante en la cultura esferoide, en comparación con el la función endógena de SHB-EGF. Estos resultados indicaron que proHB-EGF actuó como un importante factor de la proliferación celular en las células cancerosas.
formación de esferoides y la proliferación celular por la función de proHB-EGF se evaluaron bajo tratamiento Y-142. Las células se sembraron en una placa de cultivo esferoide en presencia de 1% de suero. Después de un período de incubación de 1-d, las células se trataron con las concentraciones indicadas de anti-HB-EGF anticuerpo y se cultivaron durante 3 d. A. formación de esferoides de NUGC-3 células. La barra en cada imagen indica 500 micras. B. Inhibición de EGF proHB-dependiente de la proliferación celular por Y-142. La proliferación celular se midió por CellTiter-Glo y se muestra como el porcentaje de la proliferación de células tratadas con PBS. IgG control, cuadrado blanco; Y-142, cuadrado negro; Y-073, círculo negro. Los puntos de datos representan la media ± desviación estándar de los valores adquiridos por triplicado. C. Reducción de la proteína de HB-EGF por HB-EGF siRNA. Los lisados celulares de células NUGC-3 transfectadas con siRNA se sometieron a SDS-PAGE. HB-EGF fue detectada por Western Blot, con β-actina como control interno. D. Confirmación de la proliferación celular proHB-EGF-dependiente por HB-EGF siRNA. células NUGC-3 fueron transfectadas con siRNA HB-EGF antes del cultivo de esferoides. Un día después de la transfección de ARNsi, las células se sembraron en una placa de cultivo de esferoides. La proliferación celular se midió por CellTiter-Glo y se muestra como un porcentaje de la proliferación celular de células tratadas con PBS. Los puntos de datos representan la media ± desviación estándar de los valores adquiridos por triplicado.
Para confirmar aún más que la inhibición de la proliferación celular fue causado por la perturbación de la función proHB-EGF, se evaluó el efecto de HB- EGF siRNA sobre la proliferación celular en el ensayo de esferoide para NUGC-3 células. La reducción de expresión de proHB-EGF debido a HB-EGF siRNA se confirmó por transferencia de Western (Fig. 3C). De acuerdo con la caída de la expresión de proHB-EGF, HB-EGF siRNA causado la proliferación celular reducida (Fig. 3D). Se encontró que el grado de inhibición de la proliferación celular por HB-EGF siRNA fue similar a la observada con Y-142. Estos resultados son consistentes con la noción de que Y-142 inhibe la función de proHB-EGF, que puede conducir a la proliferación celular reducida.
Para explorar el mecanismo molecular subyacente a las funciones de proHB-EGF en la supervivencia celular, que mide la caspasa activación, un acontecimiento clave en la apoptosis [24], en NUGC-3 células. Como se indica en la figura. 4, Y-142 promovido la activación de caspasa-3/7 (Fig. 4), mientras que Y-073 no tuvo ningún efecto. Este resultado indicó que proHB-EGF tiene actividad de supervivencia celular en las células cancerosas y que la inhibición de proHB-EGF desencadena la apoptosis mediada por caspasa.
La actividad de supervivencia de células de proHB-EGF fue probada mediante la medición de la activación de caspasa. células NUGC-3 se sembraron en una placa de cultivo esferoide en presencia de 1% de suero. Después de un período de incubación de 1-d, las células fueron tratadas con Y-142 y se cultivaron durante 1 d. La activación de caspasa se midió por la caspasa-Glo 3/7. IgG control, cuadrado blanco; Y-142, cuadrado negro; Y-073, círculo negro. Los puntos de datos representan la media ± desviación estándar de los valores adquiridos por triplicado.
La inhibición de proHB-EGF juxtacrine Actividades por Y-142
A diferencia de SHB-EGF, que actúa por autocrina y mecanismos paracrinos, la señalización yuxtacrina es un mecanismo único para proHB-EGF [11]. La hipótesis de que el efecto de la Y-142 puede ser mediada específicamente a través de la inhibición de la señalización yuxtacrina proHB-EGF. Debido a que la actividad juxtacrine se informó a ser mediada por EGFR [11], que mide la fosforilación de EGFR así como de sus proteínas aguas abajo ERK1 /2 y AKT, que están involucrados en la proliferación celular y la apoptosis mediada por caspasa, respectivamente, en NUGC células -3. El erlotinib inhibidor de EGFR, que se utiliza como control positivo, inhibió la fosforilación de EGFR, ERK1 /2 y AKT (Fig. 5). Similar al efecto de erlotinib, Y-142 disminuyó la fosforilación de EGFR, ERK1 /2 y AKT, mientras que Y-073, así como IgG de control no lo hicieron. La inhibición de su fosforilación por Y-142 fue significativo a 15 min después del tratamiento y duró hasta 3 d, lo que sugiere que la señal de juxtacrine se constitutivamente activada en el esferoide. Estos datos sugirieron que la actividad juxtacrine proHB-EGF conduce a la proliferación celular, así como la actividad de la supervivencia celular.
Actividad juxtacrine
proHB-EGF se midió utilizando Y-142. NUGC 3-células en una placa de cultivo de esferoides fueron tratadas con 200 nM IgG de control, 200 nM Y-142, 200 nM Y-073, o 1 nM erlotinib durante los tiempos indicados. A. Fosforilación de EGFR. B. La fosforilación de ERK1 /2. C. La fosforilación de AKT. La fosforilación se calculó como el porcentaje de la fosforilación de las células tratadas con PBS. Los puntos de datos representan la media ± desviación estándar de los valores adquiridos por triplicado. El análisis estadístico se realizó mediante el test t no apareado (una cola, frente muestra tratada con PBS en el punto de tiempo correspondiente). *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,005; ***, P. & Lt; 0,0005
Sin Efecto de Y-142 de CTF Generación
CTF
, que se produce junto con SHB-EGF por ectodominio derramamiento, impulsa la proliferación celular [ ,,,0],25]. Para evaluar la contribución de CTF en la inhibición de la proliferación celular por Y-142, la cantidad CTF fue examinado en NUGC-3 células. PMA [26] se utilizó como controles para estimular el ectodominio derramamiento y la producción de CTF. Como se muestra en la Fig. 6, la cantidad de CTF generado en presencia y en ausencia de Y-142 no era sustancialmente diferente, lo que sugiere que Y-142 no tuvo impacto en la generación de CTF.
El efecto de CTF en la inhibición observada de la proliferación celular (Fig. 3B) fue examinado midiendo la cantidad de CTF. Los lisados celulares de la PMA-, IgG de control, Y-142-, o células NUGC-3-tratados con 073 Y se sometieron a SDS-PAGE. CTF se detectó con un anticuerpo policlonal anti-CTF en el Western Blot.
Discusión
HB-EGF consiste en una forma unida a membrana (proHB-EGF), una forma soluble (SHB -EGF), y un fragmento C-terminal (CTF), y cada forma tiene una actividad biológica única. Entre estas 3 formas, la función de SHB-EGF ha sido ampliamente evaluado el uso de proteínas recombinantes. Hasta la fecha, la actividad biológica de proHB-EGF se ha sugerido sobre la base del efecto de la transfectadas proHB-EGF en la proliferación y supervivencia de las células que expresan EGFR [11], [14] - [16] o sobre la base de el efecto de proHB-EGF sobreexpresión sobre la proliferación celular autónomo [17], [18]. Sin embargo, la información sobre la función proHB-EGF ha sido escasa e inconsistente, posiblemente debido a la falta de un método para activar o inhibir específicamente proHB-EGF. En algunos otros estudios, mutante uncleavable proHB-EGF (uc-proHB-EGF), que cuenta con 2 sustituciones de aminoácidos (Leu148 y Pro149) en el sitio de escisión, se utilizó para evaluar la función proHB-EGF [26]. uc-proHB-EGF se ha demostrado que poseen actividad juxtacrine en las células que expresan EGFR fijados con formalina [27]. Si uc-proHB-EGF representa plenamente las funciones silvestres tipo proHB-EGF incluso en las células vivas, este mutante podría ser útil en la identificación de las funciones proHB-EGF en la cultura esferoide. Recientemente, se utilizó otra versión de la UC-proHB-EGF, cuyo sitio de escisión ha sido eliminada, para estudiar las funciones proHB-EGF. Este uc-proHB-EGF impidió anoikis de Madin-Darby de riñón canino células [28]. Sin embargo, en comparación con estos enfoques utilizados hasta ahora, hay algunas ventajas en nuestro enfoque se utiliza un cultivo de esferoides 3D y un anticuerpo funcional anti-HB-EGF: las funciones de forma endógena expresó proHB-EGF se puede detectar, y la fijación con formalina, que puede causar artefactos, no es necesario porque no hay ninguna función SHB-EGF endógeno.
informes acumulados mostraron que imita cultivo de esferoides el entorno del cáncer mejor que una cultura 2D en términos de contactos célula-célula, resistencia a los medicamentos, drogas la penetración, y la eficiencia de nutrientes [23], [29]; Por lo tanto, las funciones de endógenamente expresadas proHB-EGF se encuentra en el esferoide 3D sugieren que proHB-EGF puede jugar un papel importante en la progresión del tumor. En este estudio, hemos utilizado 3 líneas de células cancerosas que expresan endógenamente proHB-EGF. Y-142 inhibió la proliferación de NUGC-3 células por 72%, 5637 células por 55%, y BxPC-3 células por 24% a la concentración máxima (Fig. 3B). Como se muestra en la Fig. 1A, las líneas celulares 3 tienen diferentes niveles de expresión proHB-EGF (células NUGC-3 & gt; & gt 5637 células; BxPC-3 células), lo que puede explicar el efecto relativo de Y-142 sobre la proliferación. Las líneas de células 3 se derivan de estómago, de vejiga, y los tejidos de cáncer de páncreas, que son conocidos para sobreexpresar HB-EGF [30] - [32]. HB-EGF se ha informado de que se upregulated en otros tipos de cáncer tales como cánceres de mama y de ovario y de glioblastoma [33] - [35]; Por lo tanto, proHB-EGF puede ejercer sus funciones en una amplia gama de tipos de cáncer.
En la cultura esferoide, el tratamiento con Y-142 aumentó el número de células que difunde fuera del núcleo esferoide (Fig. 3A) . La inhibición de la actividad juxtacrine proHB-EGF se detectó incluso 3 d después del tratamiento Y-142 (Fig. 5), cuando se observó la difusión celular. Los autores especulan que el contacto célula-célula mediada por proHB-EGF se asocia directamente con su actividad yuxtacrina proHB-EGF. Los resultados de un estudio anterior utilizando uc-proHB-EGF apoyaron esta especulación en que los resultados se indica un papel citoprotector de proHB-EGF mediante el aumento de contacto célula-célula mediada por EGFR y demostraron que la activación de caspasas se inhibió por el proHB-EGF /EGFR /AKT vía [28]. También se detectó la activación de caspasas e inhibió la fosforilación de EGFR y AKT mediante tratamiento Y-142 en el cultivo de esferoides (. Las figuras 4, 5A y 5C). Nuestros resultados se pueden derivar de la inhibición de la función citoprotectora de proHB-EGF. Especulamos que la función anti-caspasa de proHB-EGF contribuye a la supervivencia de células de cáncer mediante la inhibición de señales de apoptosis, tales como las activadas en células sometidas a agentes quimioterapéuticos, la radioterapia, la hipoxia y la citotoxicidad mediada por células inmunes. Un estudio informó de que la proteína anti-apoptótica BAG-1 media el efecto de supervivencia celular proHB-EGF [36]. El efecto de supervivencia de células BAG-1-mediada de proHB-EGF se observó en células CHO, que carezcan de EGFR, lo que sugiere que el /BAG-1 vía de proHB-EGF utiliza EGFR independiente de la señalización celular supervivencia. proHB-EGF puede utilizar tanto las vías de EGFR-dependiente y EGFR independiente para ejercer sus efectos de supervivencia celular. Además, hemos observado la inhibición de ERK1 /2 fosforilación por Y-142 (Fig. 5B), lo que sugiere que la señal de la proliferación de células de proHB-EGF es mediada a través de la vía ERK1 /2. Mientras que la medición de la actividad juxtacrine de proHB-EGF en una cultura esferoide 3D, se observó la inhibición de la señalización de EGFR por Y-142 (Fig. 5), lo que sugiere que proHB-EGF ejerce las funciones anti-apoptóticas y la proliferación celular en las células vecinas a través de la vía del EGFR. En los casos en que las células de cáncer expresan tanto proHB-EGF y EGFR, la misma célula puede actuar como el donante y el aceptor de las señales de supervivencia y proliferación celular. Tomados en conjunto, predecimos que proHB-EGF induce eficazmente la progresión tumoral mediante la promoción directa de la proliferación de células cancerosas y mediante la inhibición de la apoptosis. Como se muestra en la Fig. 6, Y-142 no inhibe ectodominio derramamiento, lo que lleva a la producción de CTF. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la actividad biológica de Y-142 encontrado aquí no era atribuible a la inhibición de la producción del FTL.