Extracto
Antecedentes
Poco se sabe acerca de las moléculas que contribuyen al crecimiento de los carcinomas de ovario epitelial (EOC), que siguen siendo el cáncer ginecológico más letal en mujeres. La quimiocina Fractalquina /CX
3CL1 ha sido ampliamente informado a desempeñar un papel biológicamente relevante en el crecimiento tumoral y la diseminación. Presentamos aquí la primera investigación de la expresión y el papel de CX
3CL1 en EOC.
Resultados
Las células epiteliales de la superficie del ovario y las trompas de Falopio y desde benignos, borderline y los tumores malignos manchadas positivo para CX
3CL1. En las muestras de tumor de 54 mujeres que se sometieron a tratamiento quirúrgico para el diagnóstico de EOC, CX
3CL1 inmunoreactividad se distribuye de manera desigual en las células epiteliales del tumor, y varió de fuerte (33%) que ausentarse (17%). Esta distribución desigual de CX
3CL1 no refleja la heterogeneidad morfológica de EOC. Se correlacionó positivamente con el índice de proliferación Ki-67 y con GILZ (inducida por glucocorticoides cremallera de leucina), previamente identificada como un activador de la proliferación de células malignas EOC. análisis de agrupación jerárquica, incluyendo la edad al momento del diagnóstico, el grado del tumor, estadio FIGO, el índice Ki-67, CX
3CL1, SDF-1 /CXCL12 y anota inmunotinción GILZ, distinguido dos grupos principales que corresponden a niveles bajos y altos de proliferación y diferentes en términos de GILZ y CX
3CL1 expresión.
GILZ
sobreexpresión en la línea celular de carcinoma de BG1 derivados dio lugar a cambios paralelos en CX
3CL1 productos. Por el contrario, CX
3CL1 promueve a través de su unión a CX
3CR1 la activación de AKT y la proliferación de las células BG1. En un modelo de xenoinjerto subcutáneo del ratón, la sobreexpresión de
GILZ
se asoció con una mayor expresión de CX
3CL1 y el crecimiento más rápido del tumor.
Conclusión
Nuestros resultados destacan la la expresión constitutiva de poco apreciado anteriormente CX
3CL1 anterior tumorigénesis en las células epiteliales de ovario. Junto con GILZ, este quimioquinas emerge como un regulador de la proliferación celular, que puede ser de relevancia clínica potencial para la selección de el tratamiento más adecuado para los pacientes EOC
Visto:. Gaudin F, Nasreddine S, Donnadieu AC, Emilie D, Combadiere C, Prévot S, et al. (2011) Identificación de la quimiocina CX
3CL1 como un nuevo regulador de la proliferación de células malignas en el cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 6 (7): e21546. doi: 10.1371 /journal.pone.0021546
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de mayo de 2011; Aceptado: 1 de junio de 2011; Publicado: 7 Julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Gaudin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Ligue contre le cancer (Comité Val d'Oise), el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), la Université Paris-Sud, y la Unión Europea 6PM (INNOCHEM, el número de concesión LSHB-CT -2,005-518.167). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial (EOC) constituye el sexto cáncer más común y la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres en los países desarrollados [1]. Debido a la naturaleza silenciosa de la enfermedad en estadio temprano, la mayoría de las mujeres con enfermedad diseminada han EOC (
es decir
expansión en el peritoneo y la metástasis en el epiplón) en el momento del diagnóstico y la enfermedad avanzada la actualidad, con un anillo de cinco tasa de supervivencia a cinco años por debajo del 30% [2]. A pesar de las altas tasas de incidencia y mortalidad de EOC, los factores etiológicos implicados en la carcinogénesis de ovario aún bien definidos, lo que limita la eficacia de los protocolos de tratamiento.
El microambiente del tumor epitelial consiste en un tejido complejo que contiene varios tipos de células. La mayor parte de estas células producen y /o responden a las quimioquinas, que puede jugar un papel clave en el desarrollo y progresión de tumores epiteliales primarias [3] - [5]. Hemos demostrado, por ejemplo, que la α-quimioquinas CXC del estroma derivadas de células Factor-1 SDF-1 /CXCL12 contribuye a la red inmunosupresor dentro del microambiente del tumor, en particular por orquestar el reclutamiento de pre-DC2s [6]. También hemos demostrado que CXCL12 regula la angiogénesis tumoral y que esto es crítico para el crecimiento tumoral [7]. Por el contrario, poco o nada se sabe sobre el papel de la quimiocina Fractalquina /CX
3CL1 en EOC, aunque se ha evidenciado para mediar una fuerte adhesión celular [8] y su presencia en los tejidos epiteliales está ampliamente documentada [9] - [10]. CX
3CL1 existe en dos formas. La forma anclada a la membrana media la firme adhesión de las células que expresan su único receptor, CX
3CR1, al endotelio bajo un flujo fisiológico, a través de su propia función de adhesión intrínseca y por medio de activación de la integrina [11] - [12]. se libera la forma soluble a través de la escisión en un sitio cerca de la membrana [13]. Al igual que otras quimiocinas convencionales, que recluta células inmunes que llevan CX
3CR1, tales como los linfocitos T y células NK citotóxicos, células dendríticas o una gran subpoblación de CD14
+ monocitos [8]. Como resultado tanto de la adhesión y de las actividades quimiotácticas de la quimiocina, el CX
3CL1 /CX
3CR1 complejo pueden mediar o bien efectos pro- o anti-tumorales [14]. células de adenocarcinoma ductal pancreático que llevan CX
3CR1 adhieren específicamente a CX
3CL1 que expresan las células de origen neural y migrar en respuesta a CX
3CL1 producido por las neuronas y fibras nerviosas, lo que contribuye a perineural difusión en el cáncer de páncreas [15 ]. células de cáncer de próstata que expresan CX
3CR1 se adhieren a las células endoteliales de médula ósea humana y migran hacia un medio condicionado por los osteoblastos, que secretan la forma soluble de la quimioquina que contribuye a la alta probabilidad de células de cáncer de próstata metástasis a la esqueleto [16] - [17]. Por el contrario, soluble CX
3CL1 (SCX
3CL1) lanzado en el microambiente tumoral puede ser un componente activo de la respuesta anti-tumor [18] - [21], haciendo que la vacunación de ratones con células de carcinoma de modificar para producir CX
3CL1 una respuesta antitumoral potente debido a la quimioatracción de células NK [22], o haciendo CX
3CL1 expresión por las células de cáncer de colon de un factor que reduce drásticamente su potencial metastásico [23].
en el presente trabajo, hemos investigado la expresión de CX
3CL1 en los tejidos ováricos sanos y malignos y su papel en la proliferación de células epiteliales malignos de ovario. Las quimiocinas se produce tanto por las células epiteliales de ovario sanas y malignas, y su producción en EOC se correlacionó positivamente con el índice de proliferación celular. Curiosamente, también se correlacionó con la expresión de la inducida por glucocorticoides cremallera de leucina (GILZ), una proteína de 17 kDa de cremallera de leucina descubierto como una transcripción inducida por dexametasona en timocitos murinos, y que recientemente han mostrado para mejorar la proliferación celular en EOC y para activar AKT, una molécula de señalización importante en la tumorigénesis [24], [25]. Nuestros hallazgos fueron apoyados por los datos paralelos y complementarios acumulados en las muestras tumorales de pacientes con diagnóstico de EOC, en la línea celular de cáncer de ovario BG-1 y en un modelo de xenoinjerto subcutáneo del ratón. Proporcionan una mayor comprensión de la función de la CX
3CL1 en la proliferación de células malignas y el crecimiento tumoral, estrechamente asociados con GILZ.
Resultados
Detección de CX
3CL1 en sana y malignos tejidos ováricos
La expresión celular de CX
3CL1 fue examinado por inmunohistoquímica (IHC) en secciones aisladas de tres ovarios sanos, ocho tumores benignos seroso y mucinoso (algunos todavía contiene tejido ovárico normal), ocho y serosa tumores borderline mucinoso, dos tumores de células de la granulosa del ovario, y de 54 especímenes de EOC invasivo. CX
3CL1 se detectó claramente en la superficie del ovario epitelio (OSE) y células en el epitelio de las trompas de Falopio (Figura 1A). En los tumores benignos y borderline seroso y mucinoso, se detectó CX
3CL1 inmunoreactividad en la proliferación de células tumorales derivadas de epitelio (Figura 1, B y C). CX
3CL1 expresión se detectó en muestras de EOC, incluyendo la serosa, de células claras, endometrioide y subtipos histológicos mucinoso (Figura 1D). En estos tumores, se detectó principalmente en las células malignas, por lo que las células tumorales en la fuente más importante de CX
3CL1 en EOC. En consonancia con este hallazgo, CX
3CL1 se detectó en las células epiteliales de la ascitis maligna, con mayores niveles de expresión del CD326
+ fracción (Figura 1E). CX
3CL1 se limitó al citoplasma de las células epiteliales malignas y no se detectó en los núcleos. CX
3CL1 estaba ausente de tumores de ovario de células granulosas no epiteliales (Figura 1F).
(A) del ovario sano, CX
3CL1 inmunoreactividad en el OSE (i) y la trompa de Falopio (ii) . (B) serosa (i) y (ii) tumores epiteliales benignos de ovario mucinoso. (C) serosa (i) y (ii) los tumores epiteliales de ovario borderline mucinoso. (D) malignos epiteliales tumores de ovario: mucinoso (i), endometrioide (ii), clara de células (iii) y serosa (iv), CX
3CL1 inmunoreactividad en las células epiteliales se limita al citoplasma, ninguna tinción en los núcleos de las células tumorales. (E) citocentrifugadas CD326
- no epitelial (i) y CD326
+ epitelial (ii) las células aisladas a partir de la ascitis maligna recogidas de un paciente diagnosticado de EOC invasivo. CX
3CL1 se detecta en CD326
+ células y también en algunos CD326
- células. tumor de células de la granulosa ovárica (F) no epiteliales, ausencia de CX
3CL1 inmunotinción. (A-F) Aumento x 40.
El ARN mensajero para CX
3CL1 se visualizó mediante RT-PCR, que generó un producto del tamaño esperado (387 pb) a partir de tres muestras de ovario sanos , en seis muestras de tumores ováricos benignos, tres muestras borderline y nueve muestras de EOC. También se detectó en el BG1, SKOV3 y líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR3. Los datos representativos se muestran en la Figura 2A. La cantidad de ARNm se cuantificó mediante PCR en tiempo real en cinco muestras de EOC. Se correlacionó positivamente con la intensidad de la tinción IHC en una escala de siete puntos (test de Spearman,
P Hotel & lt; 0,05, r = 0,88) (Figura 2B). Una proteína de 90 kDa, que corresponde al tamaño esperado de los de larga duración CX
3CL1, se detectó en muestras de biopsia de EOC, en CD326
+ células epiteliales de la ascitis maligna y en SKOV3, células BG1 y OVCAR3 (Figura 2C). CX
3CL1 es una molécula unida a la membrana con el dominio de quimioquinas en un tallo tipo mucina. La escisión en la base de este tallo por las metaloproteinasas genera una quimiocina soluble, que funciona como un quimioatrayente clásica [13]. a continuación, se investigó si SCX
3CL1 se libera de las células de cáncer de ovario. Se detectó en la ascitis maligna (que van desde 1,3 hasta 1,5 ng /ml). También llevamos a cabo ensayos de ELISA en los sobrenadantes de cultivo. Las mayores cantidades de SCX
3CL1 se recuperaron a partir del sobrenadante del cultivo de células OVCAR3, que dio la señal más fuerte en las transferencias Western (Figura 2D). Nuestros resultados destacan la expresión constitutiva de poco apreciado anteriormente CX
3CL1 en epitelios saludable de la superficie y las trompas de Falopio ovario, lo que indica que EOC puede originarse de cualquiera de estos epitelios. Nos revelan además que CX
3CL1 por las células epiteliales malignos precede a la tumorigénesis
.
(A)
CX
3CL1
mRNA se detectó por PCR convencional en el tamaño esperado (387 pb ) en muestras representativas de 2 ovarios sanos, 5 cistadenomas (tumores benignos), 2 tumores borderline, 5 adenocarcinomas (tumores malignos) y en las líneas celulares derivadas de EOC, SKOV3, OVCAR3 y BG1. La línea vertical blanca separa los carriles no se ejecutan en el mismo gel. (B)
CX
3CL1
niveles de mRNA fueron cuantificados por PCR en tiempo real y se expresan como
CX
3CL1
contenido normalizado a la de
ß-actina
. El diagrama muestra la distribución de las puntuaciones de inmunotinción frente a la cantidad de
CX
3CL1
ARNm normalizado a los de
ß-actina Opiniones de 5 muestras de EOC. Cada símbolo representa una muestra de ejecución individual en triplicado (valor medio); prueba de Spearman,
P Hotel & lt; 0,05, r = 0,88. (C) CX
3CL1 inmunotransferencias de lisados totales de proteínas a partir de muestras de EOC, de CD326
+ muestras de ascitis maligna enriquecida con células epiteliales, y desde SKOV3, BG1 y líneas de células OVCAR3. La
CX proteína 3CL1 se indica como una banda de aproximadamente 90 kDa. los niveles de ß-actina se muestran para la normalización. (D) Detección por ELISA de SCX
3CL1 en el medio de cultivo de 24 h de células BG1, OVCAR3 y SKOV3 (Los datos son medias ± SEM de tres experimentos separados); indetectable SCX
3CL1 en el medio de cultivo de células HEK-293T (HEK), utilizado como control negativo.
CX
3CL1 se correlaciona con Ki-67 y GILZ en EOC
CX
3CL1 inmunotinción fue heterogénea en muestras de EOC, que va desde la ausencia de tinción detectable (puntuación de 0, 9/54) a una fuerte inmunorreactividad (puntuaciones de 5-7, 18/54). Por ello, investigó si las diferencias en el CX
3CL1 niveles de expresión se asocia con la expresión de dos marcadores de proliferación: Ki-67, que se utiliza de forma rutinaria para el diagnóstico [26] y GILZ, que recientemente hemos identificado como un factor que controla la proliferación de las células malignas EOC [25]. Inmunoreactividad para CX
3CL1, GILZ y Ki-67 se puntuó en una escala de siete puntos sobre la base de la intensidad de la tinción y el grado de tinción de secciones seriadas de fragmentos de EOC de 54 pacientes. Hubo una correlación positiva altamente significativa entre las puntuaciones de Ki-67 y los de GILZ, como se esperaba (Tabla 1). Curiosamente, no se encontraron correlaciones positivas significativas entre CX
3CL1 y Ki-67 y entre CX
3CL1 y GILZ, para toda la cohorte de 54 pacientes (Figura 3, A y B). Los inmunotinción calificaciones de estas proteínas también se correlacionaron en el carcinoma seroso y el carcinoma seroso no (Tabla 1).
(A y B) CX
3CL1 y Ki-67 puntuaciones finales (A, test de Spearman,
P Hotel & lt; 0,01, r = 0,38) y las puntuaciones finales CX
3CL1 y GILZ (B, la prueba de Spearman,
P Hotel & lt; 0,0001, r = 0,59) se correlacionaron positivamente en el 54 especímenes incluidos EOC (cuadrados negros) serosas y no serosa (cuadrados blancos) muestras. (C) dendrograma generado por el análisis jerárquico de aglomeración de clúster para las 54 muestras estudiadas EOC, contra la edad al momento del diagnóstico, estadio FIGO, grado, Ki-67, GILZ, CX
3CL1 y los niveles de inmunorreactividad CXCL12. Dos grupos se identifican, con baja (arriba) y (abajo) niveles altos de proliferación. muestras relevantes se marcan con números.
CXCL12, una quimiocina producida por las células de cáncer de ovario [6], se ha implicado en el control de la proliferación en estas células [27]. Como ya hemos demostrado en una cohorte de 183 pacientes [28], CXCL12 inmunoreactividad en las células de cáncer fue heterogénea, con una puntuación de 0 (producción indetectable) obtenidos en 16 pacientes y de 5 a 7 (inmunoreactividad fuerte) obtenido en ocho pacientes de nuestra cohorte de 54 pacientes. No hubo correlación significativa entre las puntuaciones finales para CXCL12 y CX
3CL1, o entre las puntuaciones finales para CXCL12, GILZ y Ki-67. Un análisis de los siete conjuntos de datos, incluyendo la edad al momento del diagnóstico, estadio FIGO, clasificación, GILZ, Ki-67, CX
3CL1 y CXCL12 inmunorreactividades, basados en un enfoque de agrupamiento jerárquico de aglomeración reveló dos grupos principales, como lo muestra el dendrograma generado a partir de el análisis estadístico (Figura 3C). Las principales características que distinguen a los dos grupos principales, que corresponden a niveles bajos y altos de proliferación, se presentan en la Tabla 2. Como era de esperar, la producción de CXCL12 no difirió significativamente entre los dos grupos. Por el contrario, CX
3CL1 y GILZ inmunorreactividades en las células tumorales fueron mayores para el grupo con el nivel más alto de proliferación. A pesar del número relativamente pequeño de pacientes, el número de cánceres en la FIGO estadios III y IV fue significativamente mayor en el grupo de alto proliferación. Por el contrario, la edad al momento del diagnóstico y el grado no fue diferente entre los dos grupos. Por lo tanto, mayores tasas de proliferación se asociaron con la regulación al alza de GILZ y CX
3CL1 expresión.
GILZ upregulates CX
3CL1 expresión
Los resultados de inmunohistoquímica indica claramente que GILZ niveles en las células malignas se correlacionaron positivamente con CX
3CL1 niveles, lo que sugiere un posible papel de GILZ en la regulación CX
3CL1 producción. Pusimos a prueba esta hipótesis mediante la determinación de las cantidades de CX
ARNm y proteína en 3CL1 pGILZ (que sobreexpresa GILZ) y CTRL (baja cantidad de producción de GILZ) células BG1. Como era de esperar, el contenido GILZ (ARNm y proteína) fue significativamente mayor en pGILZ que en clones CTRL. incremento paralelo de la CX
3CL1 ARNm y proteínas se representan en la RT-PCR, IHC y transferencias Western (Figura 4, A, B y C). Además, las células pGILZ liberan grandes cantidades de SCX
3CL1 que las células control (Figura 4D). El uso de un Ab dirigido al dominio extracelular de CX
3CL1, transferencias Western de lisados de células BG1 tratados con forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), una proteína quinasa C (PKC) activador, mostraron una ausencia de la 90-kDa banda correspondiente a la longitud completa de CX
3CL1. Por el contrario, este tratamiento aumenta la liberación de SCX
3CL1 en el sobrenadante. (Figura 4, C y D). Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que el CX
3CL1 por las células malignas epiteliales de ovario es aumentada por GILZ.
(A)
CX
3CL1
intensidad de la señal de PCR en CTRL y pGILZ células BG-1 se cuantificaron por densitometría con la normalización respecto a la señal de
ß-actina
; Los resultados se expresan como
CX
Tarjetas telefónicas relaciones 3CL1 /ß-actina. Un experimento representativo de tres. (B) La inmunotinción para CX
3CL1 en CTRL y pGILZ BG1 centrifugadas células. Magnificación x 40. (C) Total de extractos de proteínas celulares de células CTRL y pGILZ BG1 cultivadas con o sin 100 ng /ml de PMA durante 24 h fueron analizados por Western Blot con un Ab específico que reconoce el dominio extracelular de CX
3CL1. CX
3CL1 niveles se cuantificaron por densitometría, con la normalización respecto a la señal de ß-actina; Los resultados se expresan como CX
relaciones 3CL1 /ß-actina. Un experimento representativo de tres. (D) Los histogramas muestran la liberación de SCX
3CL1 en el sobrenadante de las células tratadas o no con PMA, tal como se mide por ELISA. Los resultados son las medias ± SEM de tres experimentos independientes. *
P & lt; 0,05
, ausencia frente a presencia de PMA y
#
P & lt; 0,05 frente a
, CTRL pGILZ BG1 células (sin pareja
t
prueba)
CX
3CL1 aumenta la proliferación de células malignas
Hemos demostrado que la SCX
3CL1 es liberada por las células de cáncer de ovario en el derramamiento de la quimiocina unida a la membrana que sugiere que la SCX
3CL1 puede ser un componente activo de la microambiente tumoral. Aquí, nos preguntamos si esta quimiocina tiene un impacto sobre la proliferación de células tumorales, como lo sugiere la correlación de CX
3CL1 y Ki-67 en muestras immunostainings EOC. Esta acción proliferativa puede resultar de un efecto autocrino de CX
3CL1, que depende de la expresión de su receptor único, CX
3CR1 [8]. Detectamos
CX
3CR1
ARNm por RT-PCR convencional en el tamaño esperado (340 pb) en todas las muestras analizadas EOC (N = 14) y en las tres líneas celulares EOC, BG1, y SKOV3 OVCAR3. Citometría de flujo análisis de membrana de revelado también CX
3CR1 expresión de CD45 en tanto
+ y CD45
- células de muestras de tumores malignos. En el CD45
- fracción, que está altamente enriquecido en células de ovario epiteliales malignos, el porcentaje de CX
3CR1
+ células varió de 20% a 95% (Figura 5A). En las células BG1, el nivel de estado estacionario de la membrana CX
expresión 3CR1 era débil (& lt; 10% de las células totales) en condiciones basales (Figura 5B). Curiosamente, la fracción de CX
3CR1
+ células se aumentó notablemente por el tratamiento ácido, un proceso conocido para disociar el ligando de su receptor. En otro lado, la disminución de la concentración de FBS del 10% al 1% en medio de cultivo condujo a una mayor expresión en la membrana de CX
3CR1 en células BG1 (Figura 5C). En contraste, el nivel de la superficie CX
3CR1 fue menor en células pGILZ, que producen cantidades más altas de SCX
3CL1 que las células CTRL. Sobre la base de estos resultados, se utilizaron células CTRL BG1 cultivadas en un medio suplementado con FBS al 1% para medir el efecto proliferativo de humana recombinante (rh) CX
3CL1 por [
3H] -timidina. Los resultados de nueve experimentos independientes mostraron que rhCX
3CL1 más o menos se duplicó la tasa de proliferación de las células después de 24 h de tratamiento (Figura 6A). Esta respuesta fue abrogada por la adición de un CX
3CL1 analógico con un N-terminal modificado que se une a CX
3CR1 y actúa como un antagonista (Figura 6B) [29]. Estos resultados muestran una acción proliferativa de exógena CX
3CL1 a través de su unión a CX
3CR1. Hemos investigado si la próxima endógena CX
3CL1 estimula la proliferación de células tumorales. Para este propósito, las células pGILZ BG1, que generan grandes cantidades de endógeno CX
3CL1, fueron tratados con el CX
3CL1 analógica renueva cada 24 h durante 72 h. En estas condiciones, la tasa de proliferación celular se redujo notablemente, subyacente a un papel para los niveles de CX
3CR1 y endógeno CX
3CL1 en la regulación de la proliferación de células tumorales (Figura 6C).
(A) del marcador pan-hematopoyéticas CD45 se determinó mediante citometría de flujo en 2 muestras recién disociadas de muestras de EOC. Los números indican las frecuencias de CX
3CR1
+ CD45
- células. (B) los perfiles FACS representativos para CX niveles
3CR1 en células BG1. Izquierda, la expresión superficial de CX
3CR1 en condiciones basales; medio, la expresión superficial de CX
3CR1 en las células después del tratamiento con ácido; derecho, expresión de CX
3CR1 en las células permeabilizadas. Los números indican el porcentaje de CX
3CR1
+ células (media ± SEM) de 3 experimentos independientes. (C) Los histogramas muestran la intensidad de fluorescencia de CX
tinción 3CR1 en la superficie de las células CTRL BG1 cultivadas en presencia de 1% o 10% de FBS, y de las células CTRL y pGILZ BG1 cultivadas en presencia de 1% de FBS. Los números indican el porcentaje de CX
3CR1
+ células de un experimento representativo de tres.
(A-C) La proliferación se midió por [
3H] -timidina (a) en células CTRL incubó con o sin 10 ng /ml rhCX
3CL1 durante 24 h, 9 experimentos independientes. Los histogramas representan las medias ± SEM, prueba t pareada,
**
P Hotel & lt; 0,001; (B) en las células CTRL incubó con o sin 10 ng /ml rhCX
3CL1 durante 24 h, en presencia o ausencia de 10 mg /ml CX
antagonista 3CR1; cada símbolo representa una muestra de ejecución individual en triplicado, las líneas representan los valores medios, *
P Hotel & lt; 0,05,
t
prueba, un experimento representativo de 3; (C) en las células pGILZ con y sin tratamiento con 10 mg /ml CX
3CR1 antagonista reemplazado cada 24 h durante 72 h, cada símbolo representa una muestra de ejecución individual en triplicado, las líneas representan los valores medios, *
P
& lt; 0,05,
t
de prueba, un experimento representativo de 3. (D) total de extractos de proteínas celulares de células CTRL cultivadas en presencia y ausencia de 10 ng /ml rhCX
3CL1 analizaron por Western Blot con Abs específicos. niveles pAKT se cuantificaron por densitometría, con normalización contra la señal para AKT total. Los resultados se expresan como cocientes de pAKT /AKT. Una mancha, representativo de tres realizados, se muestra.
hiperactivación AKT se observa con frecuencia en los cánceres de ovario y se relaciona con el control de la proliferación celular en EOC [30], [31] [32] - [33]. Los niveles de pAKT, que es la forma AKT activo, fueron mayores en células rhCX BG1
3CL1 tratados con (Figura 6D). Estos resultados sugieren fuertemente que el efecto proliferativo de la CX
3CL1 /CX
3CR1 pareja está asociada con la activación de AKT. GILZ ha sido identificado previamente como un factor de activación de AKT proliferativa en EOC [25]. Para confirmar que CX
3CL1 acción implica la activación de AKT
In situ
, medimos Ki-67 y pAKT puntuaciones en las muestras de EOC se calificó como 0 para GILZ y, o bien producir o no CX
3CL1. Como se muestra en la Tabla 3, la proliferación y la fosforilación de AKT fueron mayores en las muestras que producen CX
3CL1. En conjunto, estos hallazgos sugieren que el efecto proliferativo de CX
3CL1 en las células malignas epiteliales de ovario es consecutiva a CX
3CR1 unión que activa AKT.
En vivo
impacto de GILZ sobreexpresión
Finalmente, se investigó el impacto de GILZ y CX
3CL1 sobre el crecimiento tumoral
in vivo
mediante el uso de un modelo de xenoinjerto subcutáneo del ratón. Se inyectaron células BG1 ya sea GILZ sobreexpresa (pGILZ) o no (CTRL) por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos y el crecimiento tumoral fue seguido durante 35 días. Los volúmenes tumorales medios se representan gráficamente en la Figura 7A. Los tumores de las células en desarrollo pGILZ tenían volúmenes significativamente mayores que las de desarrollar CTRL, en cualquier momento dado. transferencias Western de extractos de xenoinjertos y inmunotinción mostraron un incremento paralelo en GILZ y CX
3CL1 los niveles de proteína (Figura 7, B y C). Por lo tanto,
GILZ
sobreexpresión está claramente asociada con niveles más altos de CX
3CL1 producción en los tumores, lo que resulta en mayores tasas de crecimiento y la proliferación tumoral.
células (A) o CTRL pGILZ BG1 (40 × 10
6 células /ml) fueron inyectados por vía subcutánea en los flancos derecho de ratones desnudos. El tamaño del tumor se midió cada 5 días, durante 35 días (N = 3 ratones por grupo). El volumen del tumor [mm
3] se calculó de la siguiente manera: (longitud [mm]) x (ancho [mm])
2 × 0,5 **
P Hotel & lt; 0,001 (sin pareja em
t
prueba). (B) Total de extractos de proteínas celulares de tumores xenoinjertados se analizaron por transferencia de Western con Abs específicos. niveles CX
3CL1 y GILZ se cuantificaron por densitometría, con la normalización respecto a la señal de ß-actina; Los resultados se expresan como CX
3CL1 o GILZ /ratios de ß-actina. Se muestra un blot representativo de tres realizados. (C) Las secciones seriadas de pGILZ y Ctrl tumores xenoinjertados se tiñeron para CX
3CL1, GILZ y Ki-67. Control negativo: no se detectó el etiquetado cuando se omitió cada Ab primario. Aumento x 40.
Discusión
En este estudio, se dio a conocer que CX
3CL1 se produce constitutivamente en EOC y se investigó el papel de esta quimiocina en el crecimiento tumoral. La producción de esta quimiocina precedida tumor maligno en el OSE, y también se encontró en las trompas de Falopio de mujeres sanas y en los tumores benignos. El análisis inmunohistoquímico reveló que CX
3CL1 producción en muestras de EOC se correlaciona con los niveles de Ki-67 y GILZ, dos marcadores de proliferación de las células epiteliales malignos de ovario. El análisis de agrupamiento jerárquico identificó dos grupos principales, con altos y bajos niveles de proliferación, que difieren en GILZ y CX
3CL1 niveles.
in vitro
, GILZ sobreproducción conduce a un aumento de la CX
3CL1 la producción en las células BG1. CX
3CL1 aumenta la proliferación celular BG1 través de su receptor, CX
3CR1, y se observa un aumento paralelo en los niveles pAKT. En los ratones xenoinjertados, la sobreexpresión de ambos GILZ y CX
3CL1 se asocia con el crecimiento tumoral más rápido. Estos resultados ponen de manifiesto una relación entre GILZ y CX3CL1 como un regulador clave de la proliferación de células malignas y el crecimiento tumoral.
De acuerdo con recientes hipótesis sobre el origen y la histogénesis de EOC, tumores de tipo I, que se cree que incluyen los principales histotypes, originados por la OSE, que fue considerado tradicionalmente como el origen de la transformación neoplásica. Por el contrario, los tumores de tipo II, que se cree que comprenden casi exclusivamente carcinomas serosos de alto grado, se cree que surge de la región distal de las trompas de Falopio [34] - [36]. Tanto el OSE y las trompas de Falopio se cree actualmente que las posibles fuentes de EOC neoplásica y ambos se derivan del conducto Mülleriana embrionario [37]. CX
3CL1 se ha detectado en el endometrio humano [38] y las trompas de Falopio [39]. También se detectó CX
3CL1 en el OSE, indicando además que la producción de CX
3CL1 por las células epiteliales de ovario precede a la tumorigénesis. CX
3CL1 fue también detectado en las células tumorales benignos y borderline, lo que sugiere que su producción no está asociado con la malignidad.
tumores epiteliales de ovario son morfológicamente heterogénea y se clasifican por patólogos en serosa, de células claras y endometrioide subtipos mucinosos sobre la base de un examen histopatológico. Cada subtipo se caracteriza por un perfil específico de ARNm, factores de riesgo genéticos y características moleculares [34] [40] - [41], lo que sugiere que el carcinoma de ovario es una enfermedad heterogénea [42]. A pesar de esta heterogeneidad, se encontró asociación significativa entre CX
3CL1 niveles y tipo histológico en nuestra serie, que incluyó muestras representativas de los cuatro principales tipos histológicos de EOC. Al igual que GILZ y CXCL12, CX
3CL1 se expresa ampliamente en los EOC y su presencia no refleja la heterogeneidad morfológica de EOC [25] [28].
Las quimiocinas CXCL12, entre ellos, son de producción local en el ovario tumores y contribuir a microambiente tumoral [5] - [6]. Aquí, identificamos CX
3CL1 como otro componente del microambiente EOC. Las células epiteliales de la ascitis maligna, las muestras de tumor y de tres líneas celulares de cáncer de ovario, a saber, BG1, OVCAR3 y SKOV3, muestran la tinción de CX
3CL1. CX
3CL1 se limitó al citoplasma y estuvo ausente de los núcleos. Las células contenidas CX
3CL1 con un peso molecular de 90 kDa correspondiente a la forma de membrana de CX
3CL1, de la que la forma soluble se deriva por el derramamiento de [8]. La producción de SCX
3CL1 en sobrenadantes de cultivo paralela a la de la forma unida a la membrana, lo que sugiere que la producción de SCX
3CL1 en EOC microambiente fue mayor en los tumores con una fuerte CX
3CL1 inmunorreactividad. Curiosamente, el local de liberación de CX
3CL1 puede también depender de CXCL12, producida por las células malignas epiteliales de ovario en EOC y conocido para regular la escisión de CX
3CL1 de las neuronas [43]. No podemos excluir la posibilidad de que CXCL12 estimula las metaloproteinasas implicadas en la CX
3CL1 la escisión en los EOC, como lo hace en cultivos neuronales. De hecho, se requiere investigación adicional de este aspecto de concluir.
La intensidad de CX
3CL1 tinción y la fracción de células tumorales teñidas para CX
3CL1 fueron variables en nuestra cohorte de 54 pacientes con avanzada EOC primaria. Esta heterogeneidad en la producción de CX
3CL1 se correlacionó positivamente con los niveles GILZ. Agradecemos a los Dres.