Extracto
Antecedentes
Un ligando inductor de proliferación (ABRIL) es un miembro del factor de necrosis tumoral (TNF) súper familia. Se une a sus receptores específicos y está implicado en múltiples procesos durante la tumorigénesis y células tumorales de proliferación. Los altos niveles de expresión de abril están estrechamente correlacionados con el crecimiento, la metástasis, y 5-FU resistencia a los medicamentos de cáncer colorrectal. El objetivo de este estudio fue identificar un péptido específico unión de APRIL (BP) capaces de bloquear la actividad de abril que podría ser utilizado como un tratamiento potencial para el cáncer colorrectal.
Métodos
Una biblioteca de presentación en fagos se utilizó para identificar péptidos que se unieron selectivamente a soluble abril humana recombinante (sAPRIL). Los péptidos con la mayor afinidad de unión para sAPRIL se identificaron utilizando ELISA. Los efectos de sAPRIL-BP sobre la proliferación celular y el ciclo celular /apoptosis
in vitro
se evaluaron utilizando el ensayo de CCK-8 y citometría de flujo, respectivamente. Un
in vivo se utilizó
modelo de ratón de cáncer colorrectal para determinar la eficacia antitumoral de la sAPRIL-BP.
Resultados
Tres péptidos candidatos se caracterizaron desde las ocho fagos clones con alta afinidad de unión para sAPRIL. El péptido con la mayor afinidad se seleccionó para una caracterización adicional. El identificado sAPRIL-BP suprime la proliferación de células del tumor y la progresión del ciclo celular en las células LOVO de una manera dependiente de la dosis.
In vivo
en un modelo de desafío colorrectal ratón, el sAPRIL-BP redujo el crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos mediante la inhibición de la proliferación y la inducción de apoptosis por vía intratumoral. Por otra parte, en un
in vivo
modelo de metástasis, sAPRIL-BP reduce la metástasis hepática de células de cáncer colorrectal
Conclusiones
el crecimiento del tumor suprimió de forma significativa.
sAPRIL-BP
In Opiniones y vitro
in vivo
y podría ser un candidato para el tratamiento de los cánceres colorrectales que expresan altos niveles de abril de
Visto:. Él Xq, Guan J, Liu M, Li J, Él Sr. (2015) identificación de la unión del péptido sAPRIL y sus efectos de inhibición del crecimiento de las células del cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (3): e0120564. doi: 10.1371 /journal.pone.0120564
Editor Académico: Chih-Pin Chuu, Institutos de Investigación Nacional de Salud, TAIWAN
Recibido: August 1, 2014; Aceptado: 5 Febrero 2015; Publicado: 31 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 He et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:.. Este trabajo fue apoyado por el Tema de Guangzhou Ciencia y Tecnología (Proyectos previstos 2012J4300091) guía
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
el cáncer colorrectal es uno de los cánceres digestivos más comunes en todo el mundo y los pacientes a menudo mueren de metástasis de las células del cáncer [1]. La quimioterapia tradicional tiene desventajas, incluyendo, diferentes grados de citotoxicidad de las células diana y fuera de efectos que pueden dañar los tejidos sanos, estos efectos secundarios de tener un impacto perjudicial en la calidad de vida del paciente. Es crucial desarrollar una terapia dirigida contra el cáncer que tiene una baja citotoxicidad y es altamente selectiva para mejorar la tasa de pronóstico y la supervivencia de los pacientes con cáncer colorrectal.
A-ligando inductor de proliferación (ABRIL) es un ligando de la necrosis tumoral factor de (TNF) superfamilia que funciona como un factor soluble [2]. Abril se expresa principalmente por células hematopoyéticas y tiene funciones biológicas en la supervivencia de células B y la activación de células T [3-5]. Los tejidos normales expresan niveles muy bajos de APRIL sin embargo, las líneas celulares de cáncer y tumores, como el cáncer digestivo, cáncer hematológico y cáncer urotelial, expresar altos niveles del mes de abril [6-9]. Abril está implicada en múltiples procesos relacionados con la tumorigénesis como la promoción de la proliferación celular tumoral y la supervivencia en diversos tipos de cáncer [10-14]. En el cáncer colorrectal, la alta expresión de abril está estrechamente correlacionada con el crecimiento tumoral, la metástasis, y 5-fluorouridina (5-FU) resistencia [12, 13, 15].
abril ejerce sus funciones biológicas mediante la interacción con varios receptores. ABRIL receptores conocidos incluyen el antígeno B maduración de las células (BCMA), activador transmembrana e interactor ligando de ciclofilina (TACI), y proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPGs) [7, 16]. BCMA se expresa principalmente en los linfocitos B maduros [17], pero también es altamente expresado en células de mieloma múltiple [18]. TACI se expresa principalmente en las células B maduras y células plasmáticas [19], y HSPG se expresan ampliamente en la superficie de muchas células de mamífero [20]. Tras la unión a estos receptores, APRIL aumenta la proliferación, o suprime la apoptosis para promover la progresión tumoral a través de mecanismos moleculares múltiples. En las células B leucemia linfocítica crónica (LLC-B), APRIL soluble estimula la activación de NF-μB, y protege a las células de LLC-B de la apoptosis espontánea o inducida por fármacos [21]. En las células B de linfoma no Hodgkin (LNH), APRIL recombinante activa NF-μB, aumenta la expresión de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-XL, y regula a la baja la proteína pro-apototic Bax para inhibir la apoptosis [14]. En células de glioma, la expresión ectópica de abril confiere protección de ligando de muerte /apoptosis mediada por el receptor, posiblemente, por la regulación positiva de anti-apoptótica inhibidor ligada al cromosoma X de proteínas de la proteína de apoptosis (XIAP) [22]. En el mieloma múltiple, APRIL promueve la progresión del ciclo celular mediante el aumento de la fase S y G
2-M fase [23]. En las células de cáncer colorrectal humano, derribando abril y usará los bloques de interferencia de ARN factor de crecimiento transformante (TGF) -μ1 señalización y activación de quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) para inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis [24].
la orientación de abril para suprimir el crecimiento tumoral, la proliferación y la supervivencia podría ser una estrategia viable para tratar el cáncer colorrectal. Otros han demostrado que el silenciamiento abril reduce la proliferación de células tumorales y la metástasis en el cáncer colorrectal [25-27]. Hemos demostrado anteriormente que la regulación a la baja de APRIL reduce la proliferación, la apoptosis aumenta y mejora la sensibilidad a la quimioterapia con 5-FU en la línea celular colorrectal LOVO, que expresa altos niveles del mes de abril [28]. Gao
et al
. han desarrollado con éxito un anticuerpo monoclonal anti-APRIL y demostrado su efecto antiproliferativo
in vitro
y
in vivo
[29]. Otros grupos han utilizado receptores sAPRIL recombinantes o sAPRIL mutante para competir con sAPRIL endógeno por la unión a sus receptores [30, 31]. En comparación con otras estrategias para la orientación abril, como siRNA o anticuerpos anti-APRIL, polipéptidos poseen varias ventajas, incluyendo baja inmunogenicidad, un alto grado de seguridad, facilidad de síntesis y purificación, la capacidad de penetrar en el tejido y los órganos, y menos toxicidad. Identificación y síntesis de polipéptidos anti-tumor se ha convertido en una estrategia popular para el desarrollo de terapias dirigidas contra el cáncer [32, 33]. Sin embargo, no hay polipéptidos específicos APRIL se ha informado hasta la fecha. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue identificar los péptidos de unión específica sAPRIL utilizando un banco de presentación de fagos, y evaluar su
in vitro y Hoteles en
in vivo
efectos contra el cáncer para proporcionar un candidato terapéutico para su uso contra el cáncer colorrectal que expresan altos niveles de abril de
Materiales y Métodos
in vitro paneo
sAPRIL recombinante humana (R & amp; D, EE.UU.). se utilizó como proteína diana para el cribado de una biblioteca de presentación de fagos 12-péptido de acuerdo con el protocolo del fabricante (NEB, EE.UU.). Brevemente, se añadieron los fagos de la biblioteca sobre placas de ELISA recubiertas con sAPRIL y se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min. fagos no unidos se eliminaron mediante lavado con TBST (TBS + 0,1% [v /v] Tween-20). Posteriormente, fagos unidos se lavaron con glicina-HCl (pH 2,0) y se amplifica. Los fagos con afinidad de unión por sAPRIL se recogieron después de cuatro rondas de unión /amplificación. Excepto la primera ronda, el tampón de lavado para eliminar los fagos no era TBST (TBS + 0,5% [v /v] Tween-20).
Selección del clon positivo por ELISA
Veinte sola colonias se seleccionaron de la última ronda de selección y se incubaron con el
e
.
coli cepa huésped ER2738
durante 4,5 horas a 37 ° C con agitación. Una placa de ELISA recubierta con sAPRIL se bloqueó con albúmina de suero bovino 5% (BSA) durante la noche y luego el sobrenadante de se añadió durante 1 h una suspensión de colonias de fagos. Para detectar los fagos unidos, una peroxidasa de rábano picante (HRP) marcado con anticuerpo anti-M13 se añadió (GE Healthcare, EE.UU.) durante 1 h, seguido de tetrametilbenzidina (TMB) durante 10 min, y después la reacción se detuvo con un H
2SO
4 solución. Las colonias con una A
450 que era por lo menos 6 veces mayor que el control positivo se consideraron positivos para la unión sAPRIL.
Análisis de secuencias de los clones positivos seleccionados y la síntesis de péptidos
Las secuencias de los clones positivos se analizaron y se traducen en las secuencias de aminoácidos, y los péptidos correspondientes se sintetizaron y se purificaron (Hangzhou chino Peptide Company). Los péptidos de unión sAPRIL se ensayaron a continuación por su afinidad por sAPRIL y el TNF superfamilia miembro de BAFF por ELISA. El péptido que tenía la actividad de unión más alta para sAPRIL fue elegido para las pruebas de seguimiento.
Cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer de colon colorrectal SW620, Lovo HCT116, HT29, SW480 y se compraron de la ATCC. Todas las líneas celulares se cultivaron en RPMI-1640 con FBS al 10%, y 100 KU /L penicilina & amp (Gibco BRL Co. Ltd, EE.UU..); estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO
2.
Modelo in vivo
Se llevaron a cabo todos los estudios con animales de acuerdo con las directrices institucionales, y aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo en Nanfang Hospital. Hembra BALB /c ratones desnudos (4-6 semanas de edad) fueron adquiridos de Guangdong Laboratorio Médico Animal Center y se mantiene bajo condiciones gnotobióticos. células LOVO (2 × 10
6 células en 100 l de PBS) se inyectaron por vía subcutánea (100 l /inyección; un sitio de inyección /tumor) y el tamaño del tumor se midió cada 3 días. Después de 3 semanas, el nódulo subcutáneo se considera un tumor cuando alcanzó 100-200 mm
3. Los ratones se dividieron en tres grupos y se inyectaron por vía intratumoral con PBS (control), 20 mg /kg sAPRIL-BP (dosis baja), o 40 mg /kg sAPRIL-BP (dosis alta) cada dos días durante dos semanas. El volumen del tumor (V) se calculó usando la fórmula: V = AB
2/2, en la que A es el diámetro máximo, y B es el diámetro perpendicular a la línea de A.
Para el colorrectal cáncer de hígado modelo de metástasis, las células LOVO (2x10
6 células /100 l) se inyectaron en el bazo después de la laparotomía. Tres semanas después de la inyección, los ratones se asignaron al azar a 3 grupos (N = 5) y por vía intraperitoneal inyectados con PBS (200 l) como control, la dosis baja de sAPRIL-BP (20 mg /kg), o la dosis alta de sAPRIL- BP (40 mg /kg) en los días 22, 24, 26, 30, 32, y la inyección del tumor 34 puesto. Los ratones fueron sacrificados en el día 35. Se recogieron las hígados y se determinó el número y el tamaño de los nódulos de metástasis.
inversa-reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa (RT-PCR)
ARN de la célula de cáncer colorrectal líneas se extrajo con Trizol (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. ARN de cada muestra se utilizó para la síntesis de ADNc usando RevertAid kit (Fermentas, Canadá). PCR se realizó usando PCR premezcla (SBS Genetech, China). El primer secuencias de abril fueron: adelante 5'-AGAAGAAGCAGCACTCTGTC-3 'y revertir 5'-CCATGTGGAGAGAGGTTAAG-3' (producto de 394 pb). GAPDH se utilizó como control interno. Los cebadores GAPDH fueron: adelante 5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3 'y revertir 5'-AGGGTCTACATGGCAACTG-3' (producto de 240 pb). Las condiciones de reacción de PCR fueron: 95 ° C durante 3 min, 94 ° C durante 50 s, 58 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 1 min, durante 32 ciclos, seguido de extensión a 72 ° C durante 7 min. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron con irradiación UV.
Western Blotting
Western Blot se realizó de acuerdo con protocolos estándar. Los anticuerpos utilizados fueron contra abril, ciclina D1, ciclina A, ciclina E, ciclina B1, CDK4, CDK6, p53, p27, y p16 (1: 1000, Abcam, EE.UU.) y de conejo anti-GAPDH (1: 2.000, ZSGB- BIO, china).
la proliferación celular ensayo
LOVO células SW620 y se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (2 x 10
3 células /pocillo) en un volumen de 200 l durante la noche . Se añadieron cinco dosis de péptido de unión sAPRIL recombinante (5 m, 10 m, 20 m, 40 m, y 80 mM) durante 24 h, 48 h, y 72 h. La proliferación celular se determinó usando el kit de CCK-8 (Instituto de Biotecnología Beyotime, China) según las instrucciones del fabricante.
ciclo celular y la apoptosis análisis
células LOVO se sembraron en cultivo de 6 pocillos placas (1 × 10
5 células /pocillo /ml). Después de 24 h, sAPRIL péptido (20 mM o 40 mM) de unión se añadió un adicional de 48 h. Para el análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo (citómetro de flujo BD LSR, BD Biosciences, EE.UU.), se recogieron las células y se fijaron con 7% de etanol durante 24 horas a 4 ° C. Después de lavar con PBS, las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI) solución (50 mg /ml PI, 100 mg /ml de ARNasa A, 0,2% de Triton X-100) durante 30 min a 4 ° C. Los datos se analizaron usando el software Modfit LT. Para el análisis de la apoptosis por citometría de flujo, las células recolectadas se tiñeron con un kit de detección de apoptosis (Beyotime, China) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se tiñeron con 500 l de tampón de unión, 5 l de anexina V-FITC y 5 l de PI durante 5-15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
Inmunohistoquímica La tinción
Todos los xenoinjertos de tumores se fijaron con formalina al 10% y embebido en parafina para seccionar. Para la recuperación de antígenos, las secciones de tejido se colocaron en un tampón de 0,01 M citrato a pH 6,0 y después se calentó a 98 ° C a 100 durante 15 min en un horno microondas. la actividad de peroxidasa endógena se bloqueó incubando las secciones en peróxido de hidrógeno al 3% (en metanol fresco) para 15 min a temperatura ambiente. A continuación, las secciones de tejido se tiñeron con anticuerpos primarios específicos para Ki-67 (1: 100, Abcam, EE.UU.) y se escindió de la caspasa-3 (1: 200, CST, EE.UU.). Un conejo de conjugado anti-IgG de ratón anticuerpo secundario (1: 200, Abcam, EE.UU.) se utilizó. La tinción positiva se visualizó con DAB. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio óptico Olympus BX41. El porcentaje de células tumorales Ki67 positivas (índice de proliferación) y el porcentaje de células tumorales de caspasa-3-positivo escindidos (índice de apoptosis) se determinaron por tres campos separados que contienen al menos 1000 células adyacentes para cada diapositiva.
estadísticas
Todos los resultados fueron analizados con el programa SPSS versión 17.0. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar (SD) a menos que se especifique lo contrario. La significación estadística se evaluó utilizando un ANOVA de una vía o prueba de la t de dos colas. La diferencia entre los grupos se consideró significativo cuando
p
. & Lt; 0,05
Resultados
Identificación de unión específica sAPRIL-péptido
Se utilizó un banco de fagos para identificar 20 clones individuales que expresan los péptidos de unión potenciales sAPRIL. Los clones fueron seleccionados al azar después de cuatro rondas de cribado. Ocho clones individuales fueron identificados como "positiva" que indica una alta afinidad de unión (definida como una DO ≥6 veces la DO del control positivo) para sAPRIL por ELISA (Figura 1A). Los ocho clones representados tres secuencias de ADN que corresponden a los siguientes polipéptidos de unión (BP): AAAPLAQPHMWA, SSTTTSDKYLSA, y SNLHDNNTEKNV (Tabla 1). La afinidad por sAPRIL se midió para cada polipéptido mediante ELISA y se compara con un polipéptido no relacionado (HWDPFSLSAYFP) como un control negativo. Los tres péptidos identificados usando la biblioteca de fagos tenían afinidades de unión sAPRIL que fueron 13,7, 10,8, y 9,3 veces mayor que el péptido de control, respectivamente (Fig 1B). La afinidad de unión de la sAPRIL-BPs también se ensayó contra otro TNF BAFF ligando superfamilia (factor de activación de células B de la familia TNF). Las afinidades de unión para cada sAPRIL-BP fueron 1.2, 1.1, y 0.9, respectivamente (Fig 1B). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la sAPRIL-BP se une específicamente a APRIL y no reacciona de forma cruzada con BAFF. sAPRIL-BP1 (AAAPLAQPHMWA) tenía la afinidad de unión más alta y fue utilizado posteriormente
in vitro
para evaluar si era capaz de inhibir la unión de la línea colorrectal humano fijo de células cancerosas células LOVO (figura 1C) sAPRIL. sAPRIL-BP1 mostró un efecto inhibidor dependiente de la dosis en sAPRIL unión a las células LOVO. Por lo tanto, sAPRIL-BP1 (en adelante sAPRIL-BP) fue elegido para la caracterización funcional adicional.
(A) La afinidad de unión de clones de fagos para No.1-20 sAPRIL se determinaron por ELISA. Clone 21 se utilizó como control positivo. El factor de cambio de la densidad óptica se normalizó con el control positivo. Los clones que tenían al menos un 6 veces mayor afinidad que el control positivo se considera "positivo" para la unión sAPRIL. (B) Tres péptidos de unión fueron sintetizados y su afinidad de unión con sAPRIL (barras negras) se determinó y se comparó con el control negativo (NC) usando ELISA. La reactividad cruzada se evaluó mediante la medición de la afinidad de unión a BAFF (barras grises). (C) Clon BP1 (sAPRIL-BP) se mezcló con sAPRIL a diferentes dosis para competir por la unión con células células LoVo.
Los efectos anti-proliferativos de sAPRIL péptidos de unión en las células LOVO
Para evaluar el papel de APRIL en el cáncer colorrectal, la expresión de abril fue examinado en cinco líneas celulares humanas colorrectales por RT-PCR (figura 2A y 2B) y el Western Blot (figura 2C y 2D). El HCT116 y líneas celulares LOVO tenían niveles significativamente más altos de ARNm del mes de abril (
p Hotel & lt; 0,05) y proteínas (
p Hotel & lt; 0,05) que las líneas de células SW480, SW620 y HT29. Por lo tanto, se evaluó el efecto de sAPRIL-BP en LOVO y HCT116 (ABRIL
alto) las células, y las células SW620 y (ABRIL
Menor) HT-29. Para determinar si había dosis efectos, la proliferación celular se midió a diferentes concentraciones de sAPRIL-BP. La tasa de proliferación se inhibió significativamente (
p & lt; 0,05
) por tratamiento con sAPRIL-BP en LOVO y células HCT116 (Fig 3A) en un tiempo y dependiente de la dosis manera. Sin embargo, este no fue el caso en SW620 y células HT-29 (Figura 3B). Resultados No sugieren que los efectos antiproliferativos de sAPRIL-BP son específicos para abril
pilas de gran.
expresión de abril fue evaluada en cinco líneas de células colorrectales humanos (indicado) mediante RT-PCR (A) y Western Blotting (C). se muestran imágenes representativas de gel. GAPDH se utilizó como control interno. Las densidades ópticas del mRNA de abril (B) y las bandas de proteínas (D) se analizaron y se normalizaron con el control interno. *
P
. & Lt; 0,05 en comparación con SW620, HT-29, o SW480
(A) ABRIL
alta LOVO y las células HCT116 y (B) ABRIL
bajo SW620 y las células HT-29 fueron tratadas con las dosis indicadas de péptidos de unión sAPRIL por 24, 48, y 72 h, y la proliferación se determinó utilizando el kit de CCK-8. La tasa de inhibición de la proliferación se calculó como: (%) = [(media de DO
Control-media de DO
experimental) /media de DO
de control] x 100%
.
Efectos de sAPRIL péptidos de unión sobre el ciclo celular y la apoptosis en células LOVO
Desde la proliferación de las células cancerosas está regulada principalmente por el ciclo celular, se determinó que la próxima fase del ciclo celular se vio afectada por sAPRIL tratamiento. Basándose en los resultados de proliferación (Fig 3A), elegimos para poner a prueba 20 mM y 40 mM de sAPRIL-BP en células LOVO para determinar la inhibición de sAPRIL altera el ciclo celular y apoptosis. Por citometría de flujo, sAPRIL-BP aumentó significativamente el porcentaje de células en el G
0 /G
1 en la fase de dosis baja (20 mM sAPRIL-BP: 73,1 ± 0,6%;
p
& lt; 0,001) y la dosis alta (40 mM sAPRIL-BP: 76,2 ± 0,1%;
p
& lt; 0,001) en comparación con el control de vehículo (65,2 ± 0,8%). sAPRIL-BP también redujo significativamente el porcentaje de células en el G
2 /M etapa comparación con el control de vehículo (24,3 ± 0,8%) a la dosis baja (20 mM sAPRIL-BP: 15,1 ± 0,5%;
p Hotel & lt; 0,05) y la dosis alta (40 mM sAPRIL-BP: 13,7 ± 0,5%;
p Hotel & lt; 0,001; figura 4A y 4B). Esto sugiere que los efectos antiproliferativos de sAPRIL-BP en células LOVO se deben a una acumulación de células en el G
0 /G
1 etapa, que bloquea la progresión del ciclo celular. En cuanto a los efectos apoptóticos de sAPRIL-BP, citometría de flujo análisis mostró que sAPRIL-BP tuvo efectos dependientes de la dosis en el porcentaje de células en apoptosis temprana LOVO (PI
- Anexina V
+ células). En comparación con el control de vehículo (1,76 ± 0,12%) la dosis baja (20 mM sAPRIL-BP: 2,49 ± 0,23%;
p
& lt; 0,05) y la dosis alta (40 mM sAPRIL-BP: 3,82 ± 0,36 %;
p Hotel & lt; 0,05) un aumento significativo de las células apoptóticas (Fig temprana 4C y 4D). Además, investigó el posible mecanismo molecular que subyace en el efecto de sAPRIL-BP en la progresión del ciclo celular. El tratamiento con sAPRIL-BP no tuvo efecto sobre la ciclina A, B, E1, CDK6, p53, p27, y la expresión de p16 (Fig 5A). Sin embargo, la expresión de la G1 /S-específica proteína ciclina D1 (Fig 5A y 5B) y la división celular quinasa quinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4) (Fig 5A y 5C) se downregulated de una manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con sAPRIL- BP.
LOVO células fueron tratadas con las dosis indicadas de sAPRIL-BP durante 48 h. Las células se tiñeron con PI para el análisis del ciclo celular (A y B) y PI + anexina V para el análisis de la apoptosis (C y D) por citometría de flujo. *
p Hotel & lt; 0,05 comparado con el control del vehículo;#
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo de dosis baja
LOVO células fueron tratadas con las dosis indicadas de sAPRIL-BP durante 48 h.. (A) Los niveles de expresión de las proteínas del ciclo celular indicadas se evaluaron mediante análisis de transferencia de Western. GAPDH se utilizó como control interno. El tamaño de la proteína de la ciclina D1 es 34 kDa, ciclina A 49 kDa, ciclina E 50 kDa, ciclina B1 55 kDa, CDK4 34 kDa, CDK6 37 kDa, p53 53 kDa, p27 27 kDa, p16 40 kDa, y GAPDH 36 kDa. Las densidades ópticas de la ciclina D1 (B) y las bandas de proteína CDK4 (C) se analizaron y se normalizaron con el control interno como factor de cambio. *
P Hotel & lt; 0,05 comparado con el grupo de vehículo;#
P Hotel & lt; 0,05 comparado con el grupo de 10 M, †
P Hotel & lt; 0,05 comparado con el grupo de 20 M
Efecto de sAPRIL-BP en el. el crecimiento de tumores de xenoinjertos
a continuación, el
in vivo
efecto de sAPRIL-BP se evaluó en el modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal. células LOVO se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos, seguido de control, baja (20 mg /kg) o alta (40 mg /kg) Dosis sAPRIL-BP inyecta por vía intratumoral una vez establecido el tumor. Los ratones se sacrificaron en el día 14, las imágenes representativas de los ratones y los tumores se muestran en la Fig 6A. El tratamiento con sAPRIL-BP dependiente de la dosis redujo el volumen del tumor (Fig 6A) y el peso del tumor (Fig 6B) en el modelo de ratón. A partir del día 8 de inyección sAPRIL-BP, el tamaño del tumor de los grupos de baja y alta dosis fue significativamente
(p & lt; 0,05
). Pequeño que el grupo de control (Figura 6C)
Las células fueron LOVO inyecta por vía subcutánea en ratones desnudos y se dejaron crecer durante 3 semanas. Una vez que el tumor era establece, los ratones se dividieron en 3 grupos (N = 5) y tratados con PBS (control), baja (20 mg /kg), o la dosis alta (40 mg /kg) de sAPRIL-BP cada dos días . (A) se muestran ejemplos representativos de los tumores de cada grupo. Panel superior: Barra de escala, 8 mm. Panel inferior: Barra de escala, 7 mm. (B) Los ratones se sacrificaron después de dos semanas de tratamiento con sAPRIL-BP y los pesos de los tumores fueron registrados. *
p Hotel & lt; 0,05 comparado con el control.#
p
& lt; 0,05 en comparación con el grupo de dosis baja. (C) El volumen del tumor se registró cada dos días durante el tratamiento. *
p
. & Lt; 0,05 comparado con el control
Efecto de sAPRIL-BP sobre la proliferación celular y la apoptosis en el tumor de xenotrasplante
Para investigar más a fondo el mecanismo por el que sAPRIL-BP inhibe el crecimiento del tumor de xenoinjerto, se realizó H & amp; e tinción (Fig 7A) en los tejidos tumorales y se encontró que el tratamiento con cualquiera de las dosis baja o alta dosis de sAPRIL-BP no tuvo efectos significativos sobre la morfología de las células tumorales y la arquitectura masa tumoral . Se observó un modesto número de espacios vacíos más grandes entre las células tumorales en el grupo de dosis alta que los otros dos grupos. Además, la tinción inmunohistoquímica para el marcador de proliferación Ki67 en xenoinjertos de tumores (figura 7B y 7D) mostró sAPRIL-BP proliferación de células cancerosas, inhibió
in vivo
de una manera dependiente de la dosis. Por el contrario, la tinción inmunohistoquímica para el marcador de apoptosis escinde la caspasa-3 (Fig 7C y 7E) mostró tratamiento sAPRIL-BP resultó en un aumento significativo y dependiente de la dosis en la apoptosis de las células tumorales. . Estos resultados indican la sAPRIL-BP inhibir el crecimiento tumoral a través de la inhibición de la proliferación y la inducción de la apoptosis
tejidos tumorales embebidos en parafina se utilizaron para el análisis morfológico con H & amp; E tinción (A), el análisis de la proliferación con la tinción de Ki67 (B), y análisis de apoptosis con la caspasa-3 escindido (CLE-casp-3) tinción (C). imágenes representativas de los tumores de cada grupo se muestran (magnificación 200 x). El índice de proliferación (D) y el índice de apoptosis (E) se calcularon y se normalizó para el grupo de control (Con). *
p Hotel & lt; 0,05 comparado con el control.#
p
. & Lt; 0,05 comparado con el grupo de 20 mg /kg
Efecto de sAPRIL-BP a la metástasis de tumores de xenoinjertos
Para investigar más a fondo si sAPRIL- BP tratamiento de inhibición de metástasis, que estableció un modelo de metástasis hepática mediante la inyección de células LOVO en el bazo. imágenes representativas del tumor en el hígado metastásico se muestran en la figura 8A. El tratamiento con sAPRIL-BP redujo el número de nódulos metastásicos de una manera dependiente de la dosis (Fig 8B;
p
& lt; 0,05). La distribución de tamaños de nódulos fue similar en cada grupo (figura 8C). En conjunto, estos resultados sugieren tratamiento sAPRIL-BP no sólo el crecimiento reducido del tumor sino que también disminuyó la metástasis de hígado en un modelo de ratón de cáncer colorrectal.
se inyectaron células LOVO en los bazos de ratones desnudos para observar metástasis hepática experimental. Tres semanas después de la inyección, los ratones se dividieron en 3 grupos (n = 5) y tratados con PBS (control), baja (20 mg /kg), o alta (40 mg /kg) dosis de sAPRIL-BP cada dos días. Los ratones se sacrificaron después de dos semanas de tratamiento con sAPRIL-BP. (A) se muestran imágenes representativas de los tumores metastásicos del hígado de cada grupo. Se registraron (B) El número de nódulos metastásicos por ratón. *
P Hotel & lt; 0,05 comparado con el control.#
P
& lt; 0,05 en comparación con el grupo de dosis baja. Se registraron (C) El número de nódulos metastásicos con el tamaño indicado. El número total de nódulos metastásicos.: n = 197 (Con), n = 130 (20 mg /kg), y n = 84 (40 mg /kg) guía empresas
Discusión
en este estudio, hemos identificado y caracterizado un sAPRIL-BP que podría ser un potencial terapéutico para el cáncer colorrectal.
in vitro
estudios demostraron efectos tanto antiproliferativos y pro-apoptóticos de sAPRIL-BP. Consistentemente, sAPRIL-BP redujo
in vivo
el crecimiento del tumor mediante la reducción de la proliferación celular intratumoral y el aumento de la apoptosis celular intratumoral. Por otra parte, sAPRIL-BP redujo significativamente la metástasis hepática de células de cáncer colorrectal en un modelo de ratón. Los efectos de la sAPRIL-BP identificados en este estudio tendrá que ser probado en ensayos clínicos. polipéptidos anti-cancerosas tienen múltiples ventajas, como la facilidad de su síntesis y purificación, baja inmunogenicidad, y la alta tasa de penetración. Este sAPRIL-BP podría ser una estrategia factible para el tratamiento de abril
altos tipos de cáncer [34-38].
Una biblioteca de presentación de fagos contiene un gran número de diversos polipéptidos expresados en la superficie de fagos [39]. Esta técnica es ampliamente utilizado para la detección de drogas objetivos, agonistas del receptor /antagonistas, análisis epítopo del antígeno, el diseño de vacunas, y análisis de la estructura de la proteína [40-42]. Se empleó este método para desarrollar unión específicos péptidos sAPRIL. Debido a que uno de los mecanismos subyacentes tumorigénesis es la ruptura del equilibrio entre la proliferación celular y la apoptosis, se recomiendan estrategias contra el cáncer que incluyen la proliferación de inhibición y /o inductor de la apoptosis en células de cáncer [43, 44]. La hipótesis de que los péptidos de unión, que compiten con los receptores ABRIL endógenas para obligar a la forma soluble de APRIL, tendrían eficacia terapéutica contra de abril
altos tipos de cáncer. Estrategias similares dirigidos abril tales como, utilizando las formas solubles de receptores señuelo para competir con la unión del ligando y silenciar abril, se ha demostrado que inhiben el crecimiento tumoral en ciertos tipos de cánceres. Por ejemplo, la forma soluble de BCMA se ha demostrado que inhibe la actividad proliferativa de abril
in vitro
y disminuir la proliferación de células tumorales en ratones desnudos [45]. Regulación a la baja de abril por RNAi lentivirus mediada efectivamente inhibe el crecimiento de células de cáncer pancreático
in vitro
y
in vivo
[46]. Wang
et al
. [15, 26] también se utiliza siRNA para silenciar APRIL en un modelo de cáncer colorrectal ratón desnudo y encontraron que abril knockdown aumento de la apoptosis de células cancerosas y redujo el crecimiento del tumor y la metástasis. Del mismo modo, hemos demostrado previamente que el lentivirus mediada por RNAi desmontables de abril inhibe la tasa de crecimiento de las células LOVO y aumenta el número de células en la fase G0 /G1 y disminuye el número en la fase G2 /M [28]. En consonancia con los trabajos anteriores, este estudio mostró que la orientación abril y usará sAPRIL-BP tiene cierta eficacia contra las líneas de cáncer colorrectal.
El trabajo previo [14, 21, 22, 24] sugiere que los mecanismos anti-apoptóticos de sAPRIL -BP podría ser atribuible al bloqueo de la señalización NF-kB, y la regulación de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL, XIAP, ERK, y TGF-ß) o proteínas pro-apoptóticas tales como Bax. Sin embargo, los mecanismos moleculares detallados a través del cual sAPRIL-BP aumento de la apoptosis en las células LOVO aún no se han investigado más a fondo. Además, el sAPRIL-BP identificamos mostró afinidad de unión específica con sAPRIL y capacidad significativa para inhibir competitivamente la unión a receptores sAPRIL abril sobre células LOVO. HSPG es el único receptor de abril encuentra en las células LOVO (datos no mostrados). Por lo tanto, si sAPRIL-BP y HSPG comparten los mismos epítopos de unión en sAPRIL, y la similitud estructural entre HSPG y sAPRIL-BP requiere un estudio adicional.
ABRIL- proliferación celular regulada se ha implicado en muchos tipos de cáncer diferentes, pero a la fecha existen pocos estudios publicados que demuestran el mecanismo molecular subyacente a la regulación del ciclo celular mediada por abril. Wang
et al
. demostrado una reducción de la ciclina D1 y CDK4, que son reguladores críticos de la transición G1 /S, cuando abril fue derribado en células de cáncer colorrectal. Estos hallazgos sugieren que la ciclina D1 y CDK4 podrían estar implicados en la regulación mediada-abril de la proliferación celular [24, 25, 47].