Extracto
Utilizamos perfiles de expresión génica para identificar las citoquinas inflamatorias que se correlacionan con el desarrollo del cáncer de vejiga. perfiles de expresión génica de las muestras de tejido fueron investigados utilizando microarrays de ADNc que contenían 103 no musculares cánceres de vejiga invasivo (CVNMI), cánceres de 62 músculos de la vejiga invasivo (MIBC), 58 muestras de los tejidos circundantes de aspecto histológicamente normal, y 10, en los voluntarios sanos que sirvió como la cohorte de control para la comparación. Se agruparon los conjuntos de datos de acuerdo con las caracterizaciones biológicas y se centró en la respuesta inmune genes con expresión diferencial de al menos 2 veces en MIBC frente a los controles. El conjunto de datos experimentales identificó 36 genes relacionados con la inmunidad que se han alterado de manera significativa en las muestras de MIBC. Además, 10 fueron de genes regulados y 26 genes se redujeron reguladas en muestras de MIBC en comparación con los tejidos normales. Entre las 10 moléculas hasta reguladas examinados, la capacidad tanto para la cicatrización de heridas migración y la invasión se ha mejorado en respuesta a IL-5, IL-20, e IL-28A en las líneas celulares de cáncer de vejiga (células 253J y EJ), en comparación con células no tratadas. Los niveles de expresión de IL-5, IL-20, e IL-28A se incrementaron en pacientes con MIBC. Todos 3 citocinas y sus receptores se producen en líneas celulares de cáncer de vejiga, según lo determinado por PCR en tiempo real, análisis de inmunotransferencia y de inmunofluorescencia confocal. Sobre regulación de MMP-2 y MMP-9 fue encontrado después de IL-5, IL-20, y la estimulación de IL-28A en ambos tipos de células. Además, un ensayo de EMSA mostró que el tratamiento con IL-5, IL-20, e IL-28A inducida por la activación de los factores de transcripción NF-kB y AP-1 que regulan el promotor de MMP-9. Por último, se observó la activación de MAPK y la señalización Jak-Stat después de la adición de IL-5, IL-20, e IL-28A a las células de cáncer de vejiga. Este estudio sugiere la presencia de la citoquina inflamatoria específica (IL-5, IL-20, e IL-28A) asociación mediada en el desarrollo de cáncer de vejiga. Los 3 citoquinas pueden ser importantes nuevas dianas moleculares para la modulación de la migración y la invasión en el cáncer de vejiga
Visto:. Lee S-J, Lee E-J, Kim S-K, Jeong P, Cho Y-H, Yun SJ, et al. (2012) Identificación de las citoquinas pro-inflamatorias asociadas con el músculo invasivo del cáncer de vejiga; El papel de la IL-5, IL-20 e IL-28A. PLoS ONE 7 (9): e40267. doi: 10.1371 /journal.pone.0040267
Editor: Nikolaos Frangogiannis, Albert Einstein College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Enero, 2012; Aceptado: 4 Junio 2012; Publicado: 4 Septiembre 2012
Copyright: © 2012 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Programa de Investigación de Ciencias básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2.010 hasta 0.001.736) y la Corea Healthcare Technology R & amp; D Proyecto, Ministerio de Salud & amp; El bienestar, la República de Corea (A100651-1011-0000200). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es una de las enfermedades más prevalentes en los países económicamente desarrollados, y los cánceres de vejiga casi todos malignos son el carcinoma de células transicionales (CCT), que surgen a partir del epitelio de transición [1], [2]. Hay dos tipos de TCC se han clasificado histológicamente: no músculo cáncer de vejiga invasivo (CVNMI) y el cáncer de vejiga invasivo muscular (MIBC) [3], [4]. En la presentación inicial, el 70-80% de los pacientes son diagnosticados con CVNMI que se limita a la mucosa. El resto de los casos presenta MIBC con la invasión de las capas musculares de la vejiga. Los pacientes con CVNMI pueden ser tratados con éxito, mientras que la mayoría de las muertes se producen en pacientes con accidente MIBC [4]. Por lo tanto, mucho esfuerzo se ha centrado en la comprensión de los mecanismos de desarrollo MIBC para posibles aplicaciones terapéuticas
.
Ahora es ampliamente aceptado que la inmunoterapia intravesical con bacilo de Calmette Guerin (BCG) es el agente adyuvante más eficaz para el tratamiento de CVNMI [5] - [7]. Sin embargo, el método terapéutico más útil para el tratamiento de los pacientes con MIBC permanece ser identificado. Por lo tanto, muchos estudios se han realizado con el fin de obtener más información sobre los mecanismos de desarrollo MIBC, que pueden conducir al descubrimiento de potencial tratamiento terapéutico. Se han analizado los estudios bioquímicos y biológicos asociados a la agresiva TCC para determinar indicadores de pronóstico, o para desarrollar agentes para aplicación de diagnóstico y terapéutica. Varios marcadores moleculares específicos han sido identificados por los perfiles de expresión de genes en el cáncer de vejiga, incluyendo reguladores del ciclo celular, proliferación celular, apoptosis y factores de angiogénesis [8]. La inflamación está implicada en el desarrollo de varias enfermedades, tales como la aterosclerosis, la diabetes, y los tumores, y se acompaña de la aparición de numerosos biomarcadores inflamatorios [9] - [11]. Sin embargo, la asociación inflamatoria-fenotipo que regula el desarrollo del cáncer de vejiga y metástasis aún es poco conocido.
Una enorme cantidad de datos ha demostrado que las interleucinas ejercen numerosas funciones de regulación del crecimiento celular, la supervivencia celular, la diferenciación y la apoptosis en varias enfermedades [11]. Interleucinas también pueden presentar efectos distintos sobre la regulación de la respuesta inmune y la patogénesis del cáncer de vejiga [4] - [7]. El tratamiento con la interleucina-6 (IL-6) se asoció con efecto anti-tumor a través de la inducción de la apoptosis en el carcinoma de vejiga de ratón [12]. la entrega de genes IL-15 mostró un efecto antitumoral en un modelo de cáncer de vejiga ortotópico de ratón [13]. En contraste, el tratamiento con IL-6 se ha encontrado para contribuir al crecimiento de células en células de cáncer de vejiga humano
in vitro
[14]. Además, la expresión de IL-8 e IL-17 se ha implicado en el crecimiento del tumor y la metástasis en el cáncer de vejiga humana [15], [16]. Aunque muchos estudios han analizado los efectos de interleucinas en el crecimiento de cáncer de vejiga [12] - [16]., Su función exacta y el mecanismo molecular en el proceso de migración y la invasión de TCC asociado con estudio clínico no ha sido dilucidado
En este estudio, hemos utilizado un enfoque basado en microarrays para identificar clínica y biológicamente patrones de expresión informativos que difieren entre los pacientes con CVNMI y MIBC y muestras de control. Nuestros resultados se centraron en las diferencias entre las muestras de MIBC y control en los patrones de expresión de genes que desempeñan un papel importante en los procesos celulares más importantes que intervienen en las respuestas inflamatorias. Se han dilucidado los genes con expresión de al menos 2 veces en MIBC diferencial frente a los controles fueron identificados, y las nuevas funciones y vías de señalización en una serie basada en inflamatoria del CCT de vejiga.
Resultados
Diferencial patrones de expresión génica entre los pacientes Grupos en
se caracterizaron los patrones de expresión génica de muestras de cáncer de vejiga 233 pacientes; 103 NMIBCs, 62 MIBCs, y 68 cánceres de la mucosa o mucosa circundante (adyacente a) normales (Tabla 1). Se aplicaron primero el análisis de agrupamiento jerárquico de patrones de expresión génica para evaluar las características moleculares de los diferentes grupos de pacientes. Como era de esperar, el análisis de agrupamiento jerárquico de datos de expresión génica de todos los tejidos dio 3 grupos principales, 1 en representación de la mucosa de la vejiga normal, 1 representa el grupo de pacientes MIBC, y 1 representa el grupo de pacientes CVNMI (Figura 1). Por lo tanto, los patrones de expresión génica que reflejan la configuración molecular eran fácilmente distinguibles entre los tumores de vejiga y tejidos no tumorales.
Se seleccionaron genes con valores de expresión que tenían una desviación estándar de al menos 0,7 (4.145 genes) . Los colores rojos y verdes reflejan niveles altos y bajos de expresión, respectivamente.
A continuación intentó identificar conjuntos de genes que son expresados diferencialmente entre los 3 grupos diferentes. Aplicamos Venn diagrama de comparación de 2 listas de genes para comparar los patrones de expresión génica de NMIBCs y MIBCs. En primer lugar, se generaron 2 listas de genes diferentes mediante la aplicación de una prueba t de 2 muestras (Figura 2 A,
P Hotel & lt; 0,001). Una lista de genes representa los genes que son expresados diferencialmente entre la mucosa normal y CVNMI, y la lista de genes B representa los genes que son expresados diferencialmente entre la mucosa normal y MIBC. Al comparar las 2 listas de genes, se observaron diferentes patrones de 3: NO I (1.452 genes), S e I (679 genes), y no S (381 genes) (Figura 2B). Los genes en el S no me categoría mostraron patrones de expresión CVNMI-específicos, mientras que los genes en la categoría S no me muestran patrones de expresión de genes específicos de MIBC. Los genes en la categoría S y me exhibieron ambos patrones de expresión CVNMI y MIBC, lo que significa 679 genes en la categoría S e I eran comunes tanto para el desarrollo CVNMI y MIBC.
(A) Diagrama de Venn de los genes seleccionados por un 2 -ejemplo de t-test. El círculo azul (lista de genes S) representa los genes expresados diferencialmente entre la mucosa y NMIBCs normal. El círculo rojo (lista de genes I) representa los genes expresados diferencialmente entre la mucosa y MIBCs normal. Una línea de corte
se aplicó P
-valor inferior a 0,001 para seleccionar los genes con una expresión que fue significativamente diferente entre los dos grupos. patrones (B) la expresión de genes seleccionados en el diagrama de Venn. Los datos se presentan en formato de matriz en la que las filas representan genes individuales y las columnas representan cada tejido. Los colores rojos y verdes reflejan niveles altos y bajos de expresión, respectivamente.
Clasificación Funcional de la expresión de genes firma de MIBC Desarrollo
Para determinar si nuestra firma la expresión génica se enriqueció en la conocida funciones biológicas, análisis bioinformático clasificación funcional de los genes que son expresados diferencialmente entre la mucosa normal y MIBC se llevaron a cabo. Este análisis reveló una serie de MIBC desarrollo asociado a las categorías funcionales. Clasificaciones funcionales de conjuntos de genes se ilustran en la Figura 3. Se encontró que los genes implicados en el ciclo celular, el cáncer, el crecimiento celular y la proliferación, la muerte celular, y la replicación de ADN y -Reparación fueron significativamente enriquecido. También se encontró que los genes implicados en los mecanismos de infección, enfermedad inmunológica, y enfermedad inflamatoria también estaban presentes en cantidades significativas. Es interesante que se observó un número significativo de genes implicados en la enfermedad renal y urológica, el desarrollo celular, el desarrollo de tejidos, y trastornos del desarrollo, que inspiró confianza en nuestros resultados. Ha habido un gran progreso en la investigación del cáncer de vejiga en los genes que contribuyen a la del ciclo celular, el desarrollo celular, el crecimiento celular, o la proliferación de células, que eran funciones altamente significativas en la Figura 3. Con el fin de identificar los niveles de expresión génica en tumores de vejiga, se analizar más a fondo los conjuntos de datos de microarrays. muestras de tumores individuales de pacientes con cáncer de vejiga reveló 664 genes que son expresados diferencialmente en todas las muestras de tejido tumoral, donde los genes diferenciales fueron ya sea hacia arriba o hacia abajo reguladas (Tabla S1, S2, S3, y S4).
Clasificación de enriquecimiento se determinó utilizando el software Ingenuity Pathway Analysis (versión 8.8). El significado de cada función se estimó utilizando el método de la prueba exacta de Fisher. El umbral de significación estadística fue -log (
P
= 0,05).
En el presente estudio, se analizó el perfil de expresión de genes implicados en la proliferación celular, la apoptosis, las células el control del ciclo, la angiogénesis, la curación de heridas, la replicación de ADN y repare, citoesqueleto, y la adhesión celular entre la mucosa normal y MIBC (Tabla S1 y S2). En MIBC, los niveles de expresión de mRNA de los genes celulares relacionados con la proliferación VAX1, TTK, TPX2, sin tiempo, Stil, TBRG4, Mcm7, KIF2C, HGS, DHCR7, CENPF, BRCA1, UHRF1, TRAIP, RECQL4, RACGAP1, las ANR, MKI67, KISS1R, KIF15, ING1, IMPDH1, FGF18, E2F1, DLG7, BUB1B, BUB1, BRCA2, y BLM fueron reguladas comparan con la mucosa normal (Tabla S1). El siguiente grupo se compone de los genes relacionados con la apoptosis que estaban sobreexpresados (TOP2A, Scotin, MTP18, GSK3B, FANCG, BIRC5, AKT1S1, YARS, trib3, TRAF2, SCARB1, RAD21, FAF1, ESPL1, E2F2, BCL2L12, ATF5, y AATF) en MIBC (Tabla S1). Los genes pertenecían a una familia en correlación con el citoesqueleto y fueron significativamente sobreexpresado en MIBC: TUBG1, SPTBN2, SPAG5, SCYL1, rcc2, Rae1, PRC1, PPP4C, NUSAP1, MYOHD1, LMNB2, KIFC1, KIF4A, KIF20A, KIF14, KIAA1688 , GTSE1, CCNB1, C9orf48, C18orf24, AZI1, AURKB, TUBA6, STMN1, SNIP, SLC9A3R1, SAC3D1, ODF2, Nek2, LMNB1, KNTC1, KIF22, ITGB4BP, FAM33A, CCNB2, y ANLN (Tabla S1). También se detectó la expresión regulada en marcha de moléculas relacionadas con la adhesión célula como TSTA3, TROAP, ADAM15, TINAG, PVR, PPFIA1, CELSR3, y ADRM1 en MIBC (Tabla S1). genes moleculares relacionados con la angiogénesis, incluyendo TOP2A, POLD1, pFS2, ORC1L, MCM7, NPR1, y FGF18 están regulados en MIBC (Tabla S1). Sin embargo, la expresión arriba regulada del factor angiogénico VEGF se observó inesperadamente en CVNMI (Tabla S1). la replicación del ADN y los genes relacionados con la reparación, fueron hasta reguladas en MIBC: TDP1, DNA2L, TYMS, TDG, POLQ, Pôle2, POLD2, POLA2, ORC6L, MCM10, PRPF19, MGC32020, gtf2h4, EME1, ruvbl2, RAD51AP1, NUDT1, FANCB, y FANCA (Tabla S1). Por último, los datos actuales muestran los niveles de sobre-expresados de genes regulados por el ciclo celular, que contribuyen a la progresión del tumor y la invasión: UBE2C, TREX1, RCC1, PSMD8, pa2g4, lin9, GSG2, E2F3, CDT1, CDK5RAP1, CCNF, ZWINT, PKMYT1 , CDC45L, CCNE2, CCNA2, SUV39H1, RAD54L, POLD1, HCAP-G, H2AFX, GPS1, FLJ22624, FANCD2, CHAF1A, CDCA3, ASPM, XRCC2, SPBC25, SMC4L1, SGOL1, SC65, PTTG1, Palo, PBK, MCM2, KNTC2 , KIAA1794, EXO1, CIT, chaf1b, CEP55, CDCA8, CDCA5, CDCA2, CDCA1, C20ort172, ANAPC11, CDC2, CDC20, Cdc25C, CDC7, Cdc27, y CDC25A (Tabla S1).
IL-5, IL-20 e IL-28A estimular la migración y la invasión de células cancerosas de vejiga
el cáncer de vejiga es una enfermedad inmuno o relacionada con la inflamación, y la inmunoterapia como instilación intravesical de bacilo de Calmette-Guérin (BCG) es el más importante opción de tratamiento para CVNMI para prevenir la progresión de la enfermedad [5] - [7], [9]. estudios acumulativos han indicado que la alteración en los niveles de citoquinas podría ser un evento clave en la determinación de la progresión de la enfermedad de cáncer de vejiga [17] - [19]. Para el siguiente análisis, por lo tanto, se seleccionaron las funciones inmunológicas o inflamatorias de nuestros resultados de la clasificación funcional (Figura 3). Debido a la muerte en pacientes con cáncer de vejiga está fuertemente relacionada con el desarrollo de MIBC [4], se analizaron los patrones de expresión de genes de inmuno representante o genes asociados con la inflamación, la comparación de MIBC y muestras de control (Tabla 2 y 3). Diez (10) de estos genes (IL-5, IL-26, IL-22RA1, IL-1RAPL1, IL-1F5, IL-17RB, IL-17RE, IL-20, IL-28A, y TRAF2) mostró aumento de la expresión y 26 genes se redujeron reguladas en muestras de MIBC, en comparación con las muestras de control (Tabla 2 y 3). Dividimos los 10 genes regulados hasta en 3 tipos: (1) las citoquinas (IL-26, IL-5, IL-20 e IL-1F5) (2) receptores de citoquinas (IL-22RA1, IL-17RB, IL- 17RE, IL-1RAPL1, y IL-28AR1), y (3) proteína adaptadora receptor de citoquina (TRAF-2). En primer lugar, para examinar la capacidad para inducir la migración y la invasión, se utilizó citocinas IL-26, IL-5, IL-20 y IL-1F5. En segundo lugar, se utilizó de citoquinas IL-22, IL-17E, IL-17C y la IL-28A, porque estas citoquinas media las respuestas celulares a través de su interacción con sus receptores (IL-22 /IL-22RA1, IL-17E /IL-17RB, IL-17 C /IL-17RE, IL-28A /IL28AR1) [20] - [23]. En el caso de IL-1RAPL1, se utilizó la sobreexpresión del gen de IL-1RAPL1 cDNA debido a que el ligando de IL-1RAPL1 aún no había sido identificado [24]. Por último, también se utiliza el gen TRAF2 ADNc que había clonado. Informes anteriores indicaron que el desarrollo MIBC está fuertemente asociada con la migración y la invasión de las células del cáncer [4], [15]. Para determinar si los genes regulados hasta en MIBC inducen la migración y la invasión de las células del cáncer de vejiga, hemos realizado ensayos de cicatrización de heridas y ensayos de invasión en 253J cáncer de vejiga y células EJ utilizando proteínas recombinantes o genes de ADNc. Entre las 10 moléculas examinadas, IL-5, IL-20, e IL-28A mejorado significativamente tanto de cicatrización de heridas migración y la invasión de las células 253J, en comparación con las células no tratadas (Figura 4A y 5A). Se encontraron resultados similares en células EJ (Figura 4B y 5B). Además, la proliferación celular no se observó en ninguno de los 3 casos de células de cáncer de vejiga de citoquinas tratados (Figura S1A y B). Sin embargo, el otro 5 citoquinas y 2 genes no tuvo ningún efecto sobre la migración y la invasión de células de cáncer de vejiga (Figura S2, S3 y S4).
(A, B) La confluentes células de cáncer de vejiga se incubaron con medio libre de suero y se trataron con proteína recombinante IL-5, IL-20, e IL-28A durante los tiempos indicados. Las anchuras de las líneas de daño realizada en las células se examinaron a continuación, a las 0 y 24 h. la migración de cicatrización de heridas es representado por el ancho de las líneas de lesiones.
(A, B) Las células se colocaron en la cámara superior, y las concentraciones indicadas de IL-5, IL-20, y IL-28A se coloca en la parte baja así de la cámara de quimiotaxis. el número de células invadidas se contaron después de los tiempos indicados. Los resultados se expresan como el número de células invadidas relativos a un control sin tratar, tal como se determina a partir de 3 experimentos independientes. **
P
. & Lt; 0,01 en comparación con ningún tratamiento
IL-5, IL-20 e IL-28A expresión es regulada hasta en pacientes con MIBC
Para validar el nivel de IL-5, IL-20 e IL-28A, el próximo midieron los niveles de mRNA de 62 MIBCs y 68 muestras normales por PCR en tiempo real. Los resultados mostraron que los niveles de expresión de IL-5, IL-20, y el ARNm de IL-28A eran comúnmente mayor en los pacientes MIBC que en individuos sanos (Figura 6), lo que sugiere que la expresión de IL-5, IL-20, y la IL-28A está fuertemente y significativamente asociado con el cáncer de vejiga invasivo.
cuantitativa en tiempo real PCR se utilizó para validar la expresión génica de IL-5, IL-20, e IL-28A en pacientes MIBC y saludable los individuos. Las muestras clínicas se obtuvieron de 62 pacientes MIBC y 68 individuos sanos. El ARNm se aisló y se utiliza para realizar PCR en tiempo real para la IL-5, IL-20, e IL-28A. Los resultados se representan como IL-5, IL-20, e IL-28A expresión de mRNA en relación con la expresión de GAPDH ARNm. *
P
. & Lt; 0,01 en comparación con los individuos sanos
IL-5, IL-20, IL-28A, y sus receptores detectado por PCR en tiempo real, inmunotransferencia y confocal Microscopía de inmunofluorescencia en células de cáncer de vejiga
con el fin de determinar si el ARNm de IL-5, IL-20 e IL-28A se expresa tanto en las células 253J y EJ, en tiempo real el ensayo de PCR se llevó a cabo. Como se muestra en la Figura 7A y D, la expresión de IL-5, IL-20, y el ARNm de IL-28A se detectó de forma endógena en ambas líneas celulares. El tratamiento de ambas líneas celulares con 10% de FBS durante 24 h mostró importantes sobre regulación de IL-5, IL-20, y la expresión de IL-28A en los niveles de mRNA (Figura 7A y D). Además, en tiempo real el análisis de PCR mostró la expresión de los receptores de citoquinas 3, IL-5Rα, IL-20R1 e IL-28AR1 tanto en las células EJ (Figura 7B y E) y 253J. proteínas IL-5, IL-20, e IL-28A se observaron por inmunotransferencia de extractos de proteínas de las dos líneas celulares (Figura 7C y F). IL-5, IL-20, y expresión de la proteína IL-28A se incrementó mediante la adición de 10% de FBS (Figura 7C y F). Usando microscopía confocal de inmunofluorescencia, el próximo examinado la sub-localización celular de IL-5, IL-20, y la proteína IL-28A en ambas líneas celulares. Los 3 citoquinas se dispersaron en el citoplasma y en las áreas peri-nucleares (Figura 8A y B).
(A, B, D y E) Las células se incubaron con las diferentes concentraciones de SFB durante 24 h y los niveles de expresión de ARNm de IL-5, IL-20, IL-28A (A, D) y sus receptores (B, e) fueron cuantificados por PCR en tiempo real. Los resultados se expresaron como IL-5, IL-20, IL-28A y de su receptor de la expresión de ARNm en relación con la expresión de GAPDH ARNm. *
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con ningún tratamiento. (C, F) Las células se trataron con varias concentraciones de FBS durante 24 h, y los niveles de proteína de IL-5, IL-20, e IL-28A se analizaron por inmunotransferencia. expresión de GAPDH se utilizó como control de carga.
células (A, B) 253J y EJ, respectivamente, se tiñeron con anticuerpos contra IL-5, IL-20, e IL-28A QD565 conjugado (rojo). Ambos núcleos (anti-DAPI) y el citoplasma (anti-tubulina-Alexa488) se counterstained con DAPI (azul) y la tubulina-Alexa488 (verde).
IL-5, IL-20 e IL -28A Activa MMP-9 expresión a través de la activación de factores de transcripción NF-kB y AP-1 en las células del cáncer de vejiga
informes previos han demostrado que la MMP-9 expresión está estrechamente asociada con la invasión tumoral de la vejiga y la migración [4], [15], [25] - [29]. Nuestros datos muestran que la IL-5, IL-20, e IL-28A estimulan la migración y la invasión de células de cáncer de vejiga (Figura 4 y 5). Estos resultados nos llevó a examinar si la IL-5, IL-20 e IL-28A induce la expresión de MMP-9. El tratamiento de ambos tipos de células de cáncer con IL-5 dio lugar a importantes sobre regulación de MMP-9 expresión en una forma de la concentración y dependiente del tiempo, detectado mediante zimografía de gelatina y análisis de inmunotransferencia (Figura 9A, 9B, 10A, y 10B) . Se observaron resultados similares después del tratamiento con IL-20 o IL-28A, respectivamente (Figura 9A, 9B, 10A, y 10B). Además, la expresión de células tratados con 28A IL, tales como 253J y células EJ (Figura 9A, 9B, 10A MMP-2, otra metaloproteinasa de la matriz, también se estimuló en la IL-5, IL-20, y, y 10B). La región reguladora 5 'del promotor de MMP-9 humana contiene varios motivos de consenso para NF-kappa B, AP-1, y los factores de transcripción Sp-1 [30] - [32]. Pensamos que la MMP-9 expresión de IL-5, IL-20, e IL-28A podría ser correlacionada con el aumento de la actividad de NF-kappa B, AP-1, y Sp-1 en el núcleo. Con este fin, hemos realizado un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) utilizando extractos nucleares de células de cáncer de vejiga inducidas por IL-5, IL-20 e IL-28A. IL-5, IL-20, e IL-28A aumento significativo inducida en NF-kB y AP-1 actividades de unión en líneas celulares de 253J (Figura 11). No se observaron complejos de unión específicos en Sp-1 en las células tratadas con cualquiera de las interleucinas (Figura 11). Sin embargo, en el caso de células EJ, tanto IL-5 e IL-28A estimularon la actividad de unión de NF-kappa B (Figura 12). Aumento de NF-KB y se detectaron AP-1 actividades de unión en las células EJ-20 tratadas con IL (Figura 12).
Las células (A) se cultivaron hasta 70% de confluencia en DMEM suplementado con 10% de FBS y la medio se cambió a un medio libre de suero. Las células se trataron con diferentes concentraciones de IL-5, IL-20, e IL-28A para 24 h. (B) en función del tiempo MMP-9 expresión en células de cáncer de la vejiga inducidas por IL-5, IL-20, e IL-28A. Las células en medio libre de suero se incubaron con IL-5, IL-20, e IL-28A (100 ng /ml) durante diversos tiempos. Los medios acondicionados a partir de (A) y (B) se analizaron por la actividad MMP zymographic. Expresión de proteínas de MMP-2, MMP-9 y GAPDH se determinó mediante análisis de inmunotransferencia.
células confluentes (A) se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS, y se cambió el medio a un suero medio exento. Las células se estimularon con concentraciones indicadas de IL-5, IL-20, e IL-28A para 24 h. (B) La inducción de la expresión de MMP-9 dependiente del tiempo en IL-5, IL-20, y las células de cáncer de vejiga tratados con IL-28A. Las células en medio libre de suero se estimularon con IL-5, IL-20, e IL-28A (100 ng /ml) durante los tiempos indicados. actividad zimográfico MMP se analizó mediante medios acondicionados a partir de (A) y (B). Expresión de proteínas de MMP-2, MMP-9 y GAPDH fue objeto de análisis de inmunotransferencia.
Las células se cultivaron con medio libre de suero que contiene las concentraciones indicadas de IL-5, IL-20, e IL -28A. Después de 24 h, los extractos nucleares de las células se analizaron por EMSA para activado NF-kappa B, AP-1, y Sp-1 usando sondas de oligonucleótidos radiomarcados.
Las células se incubaron con medio libre de suero durante las concentraciones indicadas de IL-5, IL-20, e IL-28A para 24 h. Después, los extractos nucleares de las células se sometieron a EMSA para probar NF-kappa B, AP-1, y Sp-1 actividad de unión usando sondas de oligonucleótidos radiomarcados.
Inducción de la MAPK y la señalización Jak-Stat Camino en las células del cáncer de vejiga inducida por la IL-5, IL-20 e IL-28A
Debido a la señalización de citocinas principalmente activa el Jak /Stat y las vías de transducción de señal MAPK [8], el próximo investigó las cascadas de señalización inducida por IL-5, IL-20, e IL-28A en las células de cáncer de vejiga. experimentos de tiempo se llevaron a cabo en las células 253J y EJ. IL-5 tratamiento indujo la activación de ERK1 /2, JNK, JAK1, JAK2, Stat1, Stat2, Stat3 y en las células 253J (Figura 13A y 14A). La estimulación de células EJ con IL-5 dio lugar a la activación de ERK1 /2, p38MAPK, JAK1, JAK3, Stat1 y Stat3 (Figura 13B y 14B). Además, la IL-20 aumentó la activación de ERK1 /2 en células EJ (Figura 13A y 13B) y 253J. Se detectó la activación de JAK2, JAK3, Estad2, y STAT5 en células 253J IL-20 tratadas (Figura 14A). El tratamiento con IL-20 estimula la activación de la JAK1, JAK2, Stat1, Stat2, y Stat5 en células EJ (Figura 14B). En el caso de la IL-28A, se observó la activación de ERK1 /2 en las células 253J (Figura 13A), la activación de p38MAPK fue hasta reguladas en las células EJ (Figura 13B). El tratamiento de células 253J con IL-28A induce la activación de JAK2, JAK3, Stat3 y Stat5 (Figura 14A). Por otra parte, la activación de JAK2, Stat1 y Stat3 fue inducida por el tratamiento con IL-28A en las células EJ (Figura 14B). Sin embargo, la activación de AKT no fue influenciada en células de cáncer de vejiga tratados con IL-28A de IL-5, IL-20, y (Figura S5A y B).
(A, B) Las células se incubaron en IL -5, IL-20, e IL-28A (100 ng /ml) durante los tiempos indicados, y se recogieron a continuación, se lisaron y se sometieron a análisis de inmunotransferencia de los niveles de activación de MAPK utilizando anticuerpos específicos.
(a, B) las células fueron tratadas con IL-5, IL-20, e IL-28A (100 ng /ml) durante los tiempos indicados, y luego se cosecharon. Los niveles de activación de Jak-Stat fueron detectados por análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos.
Discusión
Muchos estudios han utilizado perfiles de expresión génica de cáncer de vejiga urinaria utilizando microarrays. Estudios previos que implican el análisis de perfiles de expresión génica se han centrado en la proliferación celular, la regulación del ciclo celular, la replicación y reparación del ADN, la apoptosis, la transducción de señales, factores de transcripción, la angiogénesis, la adhesión celular, las heridas sanan, y el citoesqueleto. En el presente estudio, los patrones de expresión de un número de genes clásicos relacionados con el tumor (por ejemplo, VEGF, PGF, FGF18, AKT, E2F1, ATF5) dentro de nuestro conjunto de datos de microarrays se detectaron como se predijo. El análisis de agrupamiento jerárquico sugirió que muchos genes pueden participar en redes reguladoras que afectan a los múltiples sistemas biológicos que son necesarios para el desarrollo de cáncer de vejiga. Sin embargo, poco se sabe acerca de las citocinas inmunológicas o inflamatorias asociadas a implicados en el desarrollo de cáncer de vejiga urinaria humana.
A partir de los resultados de este conjunto de datos de microarrays, hemos determinado las diferencias en los patrones de expresión de genes de respuesta inmune entre lo normal y MIBC. Diez (10) genes (Tabla 2) fueron hasta reguladas en base a sus patrones de expresión génica en MIBC, en comparación con las muestras de mucosa normal, lo que sugiere que estos genes regulados están estrechamente relacionadas con el desarrollo de cáncer de vejiga. En la primera etapa del estudio, a partir de estos 10 genes que encontramos 3 principales citoquinas, IL-5, IL-20, e IL-28A, que participan en la migración, invasión, y la expresión de MMP sin afectar a la proliferación celular, lo que indica un programa coordinado clúster para permitir la progresión de la TCC como se determina por la migración de cicatrización de heridas, ensayo de invasión, zimografía, los niveles de proteína, y los niveles de actividad de EMSA. Además, también identificó que MAPK y la señalización Jak /Stat se activan en las células de cáncer de vejiga tras el tratamiento con IL-5, IL-20, e IL-28A.
IL-5 se identificó originalmente como una camiseta células beta en sustitución de los factores (TRF), y fue encontrado posteriormente para regular la activación, proliferación y supervivencia de los eosinófilos [33]. IL-5 también ha demostrado ser un importante regulador de la diferenciación de células B de ratón [34]. IL-5 receptor es un heterodímero compuesto de alfa y beta subunidades. La α-subunidad es ligando específico (IL-5Rα), mientras que la β-subunidad (βc) es común a la IL-3 e IL-5 [33], [34]. Estudios anteriores han demostrado que la IL-5 activa Lyn [35], Jak2 /Stat1 [36], MAPK [35], Syk [37], y PI3K [38] en los eosinófilos. La activación de JAK2, tirosina quinasas Btk, PI3K, Shc, Vav, y HS1was asociado con la proliferación inducida por IL-5 de las células B [39]. El promotor de IL-5 contenía factores de transcripción Sp1 esenciales, incluyendo, E12 /E47, Oct-2 y C /EBPb en las células B y eosinófilos [40]. El uso de vacunas rBCG para el tratamiento de carcinomas de la vejiga no se producen citoquinas de tipo TH-2, incluyendo IL-5 [41]. En el presente estudio, tanto IL-5 e IL-5Rα fueron detectados por RT-PCR y de inmunotransferencia en células de cáncer de vejiga. También hemos identificado la activación de ERK1 /2, p38MAPK, JNK, JAK1, JAK2, JAK3, Estad1, Estad2, y STAT3 en células de cáncer de vejiga. Nuestra observación en este experimento es coherente con un informe reciente que muestra que los niveles circulatorios de IL-4, IL-5 e IL-10 fueron significativamente mayores en el suero del paciente de cáncer de vejiga que en las muestras normales [19]. Por lo tanto, los aumentos en los niveles de IL-5 en este estudio pueden ser responsables de desarrollo aumentada de las células tumorales de la vejiga y su incapacidad para ser reconocido por inflamatoria.
IL-20, la citoquina inflamatoria pleiotrópica, se encuentra en los queratinocitos y identificado como un miembro de las citoquinas de la familia IL-10, que incluye IL-10, IL-29, IL-20, IL-22, IL-24 e IL-26 [42], [43]. IL-20 estimula señales a través de 2 complejos heterodiméricos alternativos, que consisten en cualquiera de IL-20R1 e IL-20R2 o IL-22R1 e IL-20R2 [42], [43]. Los resultados del presente estudio mostraron expresión de IL-20 y IL-20R1 en células de cáncer de vejiga. Con respecto a la señalización de activación de Stat3, IL-20 inducida en los queratinocitos [42]. Un informe anterior mostró la activación de MAPK, tales como ERK1 /2, p38 MAPK y JNK, en células HUVEC tratadas con IL-20 [44]. tratamiento con IL-20 también indujo la activación de JAK2 /Stat3 y la vía ERK1 /2 en células de glioblastoma GBM8901 [45]. Nuestros resultados de las células de cáncer de vejiga indican que la IL-20 inducida por la activación de ERK1 /2 y Jak1, Jak2, Jak3, Stat1, Stat2, y Stat5. Además, la IL-20 se asocia con múltiples enfermedades inflamatorias [45], [20], incluyendo psoriasis, artritis reumatoide, insuficiencia renal, lesión cerebral, y aterosclerosis.