Extracto
Antecedentes
La glicosilación de proteínas es una importante modificación post-traduccional demostrado ser alterado en todos los tipos de tumores estudiados hasta la fecha. glicoproteínas de mucina se han establecido como portadores importantes de
O-
glucanos unidos pero otras glicoproteínas que presentan alterados los repertorios de glicosilación aún no han sido identificados, pero ofrecen un potencial como biomarcadores para el cáncer metastásico.
Metodología
en este estudio se utilizó un enfoque glycoproteomic para identificar glicoproteínas que presentan alteraciones en la glicosilación en el cáncer colorrectal y para evaluar los cambios en
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de glicosilación unido en el contexto de la p53 y KRAS (codón 12/13 ) estado de la mutación. La purificación por afinidad con la proteína de unión a carbohidratos de
Helix pomatia
aglutinina (HPA) se acopló a electroforesis en gel de 2 dimensiones con espectrometría de masas para permitir la identificación de baja abundancia
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glicoproteínas enlaces desde humana especímenes de cáncer colorrectal.
resultados
aberrante
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glicosilación unida se observó que era un evento temprano que se produjo con independencia de la p53 y el estado de KRAS y correlacionar con cáncer colorrectal metastásico . La purificación por afinidad usando el HPA lectina seguido de análisis proteómico reveló anexina 4, 5 y anexina CLCA1 a incrementarse en los especímenes de cáncer colorrectal metastásico. Los resultados fueron validados utilizando un conjunto independiente con otras muestras y esto mostró una asociación significativa entre la puntuación de tinción de anexina 4 y HPA y el tiempo para la metástasis; independientemente (A4 anexina: Chi cuadrado 11,45; p = 0,0007; HPA: Chi cuadrado 9,065, p = 0,0026) y en combinación (anexina 4 y HPA combinado: Chi cuadrado 13,47; P = 0,0002)
Conclusión
Las glicoproteínas muestran los cambios en
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glicosilación ligada en el cáncer colorrectal metastásico han sido identificados. Los cambios de glicosilación eran independientes de p53 y el estado de KRAS. Estas proteínas ofrecen un potencial para una mayor exploración como biomarcadores y dianas potenciales para el cáncer colorrectal metastásico
Visto:. Peiris D, Ossondo M, S Fry, Loizidou M, Smith-J Ravin, Dwek MV (2015) Identificación de
O = Conectado
glicoproteínas de unión a la lectina
Helix pomatia
aglutinina como marcadores de cáncer colorrectal metastásico. PLoS ONE 10 (10): e0138345. doi: 10.1371 /journal.pone.0138345
Editor: Lu-Yu Gang, de la Universidad de Liverpool, Reino Unido
Recibido: 15 de Junio, 2015; Aceptado: 28 Agosto 2015; Publicado: 23 de octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Peiris et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por contra cáncer de pecho, Número de registro de la Caridad 1.121.258 (DP financiado y SF). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Antecedentes
la glicosilación es una importante modificación post translacional que se ha demostrado ser alterado en todos los tipos de cáncer estudiados hasta la fecha. Los genes que codifican para enzimas implicadas en reacciones de glicosilación representan aproximadamente el 1% del genoma humano que explica la gran cantidad de cambios de glicosilación reportados en el cáncer. La metástasis, la difusión de las células de tumor primario a órganos distantes, es un problema importante que afecta a pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal (CRC) [1]. De acuerdo con ello, el diagnóstico precoz del CCR metastásico es un objetivo importante y se necesitan nuevos marcadores de pronóstico para identificar a los pacientes en mayor riesgo de desarrollar metástasis para permitir oncólogos para adaptar las estrategias de tratamiento para grupos de alto riesgo de patients.Alterations en la glicosilación se han demostrado estar asociados con el comportamiento metastásico de las células tumorales [2,3] y puede ser identificado utilizando proteínas de unión a carbohidratos, lectinas, aislado de una amplia variedad de organismos incluyendo bacterias, plantas, invertebrados y vertebrados [4]. La lectina
Helix pomatia
aglutinina (HPA) reconoce
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estructuras vinculadas glicanos [5,6] y se demostró primero en unirse preferentemente al cáncer de mama de pacientes con mal pronóstico [2] [ ,,,0],7]. La utilidad de HPA para detectar cáncer metastásico ya se ha demostrado para una variedad de tumores sólidos, incluyendo los del tracto gastrointestinal, por ejemplo, colorrectal, gástrico y tumores esofágicos [8-11]. Las glicoproteínas reconocidos por HPA se han investigado en líneas celulares de CRC derivada y esto reveló que la utilidad de HPA reside en su capacidad para unirse de forma simultánea a muchas glicoproteínas que participan en una amplia gama de funciones de pro-metastásicas, incluyendo la migración celular, anti-apoptosis y la señalización celular [12]. HPA se ha demostrado que se unen las mismas glicoproteínas en el cáncer de mama como los detectados en las células HT29 sugerente que HPA reconoce los cambios en la glicosilación que son comunes en todos los tipos de tumores sólidos. HPA reconoce glicoproteínas modificadas por la unión de
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ligado
N
-acetylgalactosamine (
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GalNAc) y
N
acetilglucosamina (
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GlcNAc) [13]. cambios asociados con cáncer en
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glicosilación ligada han sido reconocidos desde hace algún tiempo, pero ha habido relativamente pocos estudios que se ocupan de la cartografía de las proteínas a las que están alterados los glicanos attached.In el presente estudio, se utilizó la lectina HPA para identificar
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glicoproteínas enlaces de tejidos de CRC que eran metastásica a los ganglios linfáticos. Las proteínas se pre-enriquecidos mediante cromatografía de afinidad de lectina y se separaron por electroforesis bidimensional en gel (2-DE), seguido de identificación utilizando espectrometría de masas (MS). Verificación de las glicoproteínas identificadas se realizó mediante técnicas de inmunohistoquímica y transferencia Western. La correlación entre HPA vinculante; P53 mutado en KRAS y el estado de CEA de las muestras de tejido se evaluó con el propósito de la comprensión
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vinculado glicosilación en el contexto de otros marcadores de CRC. Un estudio de validación con una colección de más de CRC especímenes independiente de la cohorte inicial de la muestra mostró que los cambios en la
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glicosilación ligada reconocido por HPA permanecerá asociada con un mal pronóstico CRC.
Materiales y Métodos
Productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, Reino Unido, a menos que se indique lo contrario.
Las muestras de pacientes
El estudio proteómico incluyó a 27 pacientes con CCR primaria, que se sabe estar libre de metástasis hepáticas, todos los cuales fueron sometidos a resección quirúrgica en el hospital Universitario, Martinica (S1 Tabla). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Martinica y el Comité de Ética de Investigación de la Universidad (UREC) de la Universidad de Westminster. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para sus muestras que se utilizan en la investigación. Las muestras se congelaron instantáneamente después de la cirugía y las muestras equivalentes se fijaron en formol e incluidos en parafina para estudios histopatológicos. Para cada muestra de tejido de cáncer, se recogió el tejido normal de áreas libres de tumor en la mucosa vecina en un radio de 4 cm del tumor. Los pacientes se clasificaron en dos grupos basados en el grado de la implicación de los ganglios linfáticos regionales. Todos los tejidos utilizados en la investigación se examinaron y verificaron la presencia de células tumorales utilizando hematoxilina y eosina diapositivas. El trabajo de validación se llevó a cabo utilizando bloques de parafina-incrustados fue de tejido CRC recogido en el University College London Hospitals (antes de 2006) y utilizado de acuerdo con la Ley de Tejidos Humanos (2008).
histoquímica
la inmunohistoquímica utiliza el sistema de detección de peroxidasa de rábano picante (HRP) (kit EnVision además de doble enlace complejo sistema-HRP, anti-ratón /conejo-HRP, Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 4 micras de grosor de la cera de parafina fijado con formalina incorporado (FFPE) tejidos de colon de archivo (tumores y homólogos normales) se de-con parafina en xileno y se rehidratan a través de una serie de alcoholes graduados (70% - 100%). La recuperación del antígeno se realizó mediante la solución de recuperación de destino o tampón citrato siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad peroxidasa endógena se inactivó mediante la incubación con el bloque Dual endógena de la enzima (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.). Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario respectivo: monoclonal anti-p53 (clon DO1; Immunotech, dilución 1:50) o anticuerpo policlonal de conejo contra la anexina 4 y 5 (dilución 1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) . Las condiciones utilizadas para cada anticuerpo fueron como se describe por el fabricante. La tinción sin el anticuerpo primario se realizó como un control negativo. El sistema Envision, HRP, se utilizó anti-ratón o anti-conejo para la detección de los anticuerpos primarios (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) y tinción de tejidos se visualizó con diaminobencidina (DAB) solución de cromógeno (Dako, Carpinteria, CA, ESTADOS UNIDOS). Los núcleos se contratiñeron con hematoxilina durante 5 min. Las secciones se deshidrataron a través de una serie de alcoholes graduados despejadas en xileno y se montaron en ftalato de di-n-butilo en xileno (DPX) medio de montaje. Histoquímica para detectar HPA utilizado lectina biotinilada 10 mg /ml de unión en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 5% w /v albúmina de suero bovino (BSA) aplicado a los portaobjetos durante 1 h, se lavaron en tres cambios de PBS con 0,01% v /v de Tween-20 y se incubaron con 5 mg /ml de estreptavidina-HRP durante 30 min. Las secciones se lavaron de nuevo en cambios de PBS con 0,01% v /v de Tween-20 y la lectina de unión se reveló mediante incubación con 1% w /v DAB y 0,3% v /v H
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2. Las células fueron contrastados y se montaron como anteriormente.
Las diapositivas fueron evaluados bajo un microscopio de luz y fueron anotados por dos individuos independientes en una forma ciega. En los casos en que existe un desacuerdo inicial, se obtuvo un consenso después de una discusión. P53 se registró como positivo cuando los núcleos de las células del tumor se tiñeron, independientemente del porcentaje de células positivas. Se determinó la puntuación global inmunorreactiva (por P53) de acuerdo con el método utilizado previamente [6]. IRS es el valor acumulativo de la intensidad de la inmunotinción (0 (-) sin tinción; 1 (+) para la tinción débil; 2 (++) para la tinción moderada y 3 (+++) para una fuerte tinción) y el porcentaje de las células tumorales positivas & lt; 5% = 0; 20% = 1; 20 a 50% = 2; 50 a 80% = 3 y & gt; 80% = 4. Para HPA y anexina 4, se utilizaron los mismos criterios. En primer lugar, el porcentaje de células de cáncer de tinción se evaluó y esto se añadió a la puntuación de intensidad para dar una puntuación final de entre 0 y 8. Con el fin de determinar el punto de corte óptimo, los resultados de todas las muestras fueron analizadas en términos de su puntuación de tinción. La puntuación que dio la mayor discriminación entre los pacientes que desarrollaron la enfermedad metastásica y los que permanecieron libres de enfermedad (5 años de datos de supervivencia) se utilizó como punto de corte.
Extracción de ADN
Las muestras de tejido tumoral y el tejido normal de cada paciente se utilizaron para la extracción de ADN. Secciones de 1 mm
tejido 3 se cortaron y se trituraron inmediatamente en 200 l de tampón de lisis de pH 7,5 que contiene Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,5% v /v de SDS, se realizaron 100 mg /ml de proteinasa K. extracciones fenol y el ADN se precipitó con etanol a -20 ° C. El precipitado resultante se secó a temperatura ambiente y se re-suspendió en tampón estéril Tris-EDTA (TE) a una concentración de aproximadamente 1 mg /ml. La concentración de ADN se determinó utilizando un espectrofotómetro GeneQuant Pro (GE Healthcare, Bucks, Reino Unido). Las muestras se almacenaron a + 4 ° C hasta su uso.
amplificación de ADN
La reacción de amplificación del ADN extraído a partir de tejido normal y tumoral se realizaron con 1 l de la muestra de ADN en un volumen de reacción total de 50 l que contenía Promega Master Mix (Ref. M7502) y cebadores generados por el Dr. E. Jullian del hospital Cochin. La reacción de amplificación se llevó a cabo en dos etapas, con 24:00 de cada cebador. La primera reacción de PCR (KRAS1) se realizó con los siguientes cebadores: KRN5 '(5'-TAAGGCCTGCTGAAAATGAC-3') y KRN3 '(5'-TGAAAATGGTCAGAGAAACC-3') con el siguiente ciclo de amplificación: 95 ° C durante 10 min, 55 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min, luego 43 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 minuto, y una extensión final a 95 ° C durante 30 seg , 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 10 min. La observación de una banda débil de baja intensidad o de la falta de la banda, después de 1,5% w electroforesis en gel /v de agarosa dio lugar a una segunda reacción de amplificación. Esta segunda reacción de PCR (KRAS2) se llevó a cabo usando 2 a 10 l de la primera reacción KRAS1 y los siguientes cebadores: KRS5 '(5'-AACTTGTGGTAGTTGGAG -3') y KRS3 '(5' - GTTGGATCATATTCGTCC -3 ') con el siguiente ciclo de amplificación: 95 ° C durante 12 min, 52 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min, luego 43 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 52 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min y un ciclo final a 95 ° C durante 30 seg, 52 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR a partir de tejido tumoral se secuenciaron para y las mutaciones en los codones 12 y 13 del gen KRAS se identificaron (Millegen, Francia).
Preparación de muestras para el análisis de proteínas
Antes de la selección de muestras para estudios de proteómica, se cortaron 7 micras secciones congeladas y la presencia de células cancerosas se confirmó por tinción con hematoxilina y eosina. Se seleccionaron las células de cáncer de 60% y la hemólisis libre; & gt muestras que contienen. Se prepararon cuatro piscinas de proteínas: LN positivo (n = 6) CRC (LN +), tejido sano adyacente (ADLN +); LN negativo (n = 5) CRC (LN-) y los correspondientes tejidos sanos (AdLN-). Las características patológicas clínicas de las muestras se muestran en la Tabla S1. Las proteínas se extrajeron de cada muestra mediante el lavado de 50 mg de tejido tres veces con PBS enfriado, homogeneización en tampón de lectina: 0,05 M TBS, mM CaCl 1
2, mM MgCl 1
2, pH 7,6 utilizando una de mano homogeneizador durante 5 min con enfriamiento intermitente en hielo. El homogeneizado se centrifugó a 15.000 x
g
para recoger el sobrenadante. La cuantificación de proteínas se llevó a cabo utilizando el sistema de Qubit (Qiagen, Reino Unido). Los rendimientos de proteína varió de 5% a 7% del peso húmedo de tejido. Cada una de las piscinas comprendía 100 g de cada una de las preparaciones de proteínas de cáncer /normal de las muestras apropiadas.
SDS-PAGE y Western Blot
Las proteínas fueron separadas por 1-DE dodecil sulfato de sodio poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE) utilizando un gel de 12% a 120 V durante 1,5 h [14] y se tiñeron con azul de Coomassie coloidal G-250 [15]. Las muestras separadas por SDS-PAGE se transfirieron a nitrocelulosa usando un sistema de transferencia húmedo durante 1,5 horas a 110 V en tampón de transferencia: Tris 25 mM, glicina 192 mM, 20% v /v de metanol, se bloquearon con 2% w /v de BSA en TBS Tween 0,05% v /v durante la noche y se incubaron con 5 mg HPA biotinilado /ml durante 2 h seguido de 1 h de incubación con 2 mg /ml de estreptavidina-HRP y se sondaron con el DAB /h
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2. Para el análisis de los niveles de CEA un anti-CEA anticuerpo monoclonal murino (sc-55547, Santa-Santa-Cruz, CA, EE.UU.) se utilizó en 5 mg /ml de anticuerpo anti-CEA durante 2 h, se incubaron con 2 mg /ml de peroxidasa conjugado anti-IgG de ratón durante 1 h y se visualizó como anteriormente. Para verificar los niveles de anexina 4 y 5 muestras de proteínas fueron separadas y se transfirieron como antes y probaron con monoclonal murino anti-anexina 4/5 anticuerpos (sc-46693 /sc-74438, Santa Cruz, CA, EE.UU.) a 5 mg /ml durante la noche seguido por incubación con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (1 mg /ml) y se desarrolló con el sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL). La señal fue capturado en una placa de rayos X utilizando un tiempo de exposición de 1 min.
El enriquecimiento de HPA glicoproteínas de unión
cromatografía de afinidad HPA se utilizó para enriquecer y purificar las glicoproteínas de unión HPA de los extractos de tejidos . Esto permitió que las alteraciones cualitativas en la glicosilación y los cambios cuantitativos en los niveles de proteína que deben evaluarse. Además, este paso elimina las proteínas de alta abundancia. Una columna de cromatografía de afinidad de 5 ml HPA se preparó por acoplamiento de 10 mg de HPA a una columna de Sepharose activada con NHS HiTrap (GE Healthcare, Bucks, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. 2 mg de muestra de proteína combinada se cargó en la columna y se eluyó con 0,25 M GlcNAc recién preparada en tampón de lectina. Las muestras fueron dializados durante la noche contra TBS y se liofilizó. muestras liofilizadas se reconstituyeron en tampón de urea 100 l: 7 M urea, tiourea 2 M, 2% v /v anfolitos 4-7 (GE Healthcare, Bucks, Reino Unido), 4% w /v CHAPS y 1% w /v TDT. La cuantificación de proteínas se llevó a cabo como antes. El rendimiento de proteína purificada por afinidad fue de 1% a 2% de la reserva total de proteína.
electroforesis bidimensional (2-DE)
glicoproteínas purificados por afinidad se separaron por 2-DE. 50 g de cada muestra de proteína combinada se mezcló con tampón de rehidratación: 6 M urea, 2 M tiourea, 0,5% v /v CHAPS, 0,4% v /v de DTT, 0,5% v /v anfolitos pH 4-7, para dar un volumen final de 120 l. La mezcla se cargó en una tira de gradiente de pH Immobiline 11 cm, pH 4-7L (GE Healthcare, Bucks, Reino Unido) de acuerdo con el método descrito por [16]. Isoelectroenfoque se realizó con un Multiphor II (GE Healthcare, Bucks, Reino Unido) 10.000 Vh (GE Healthcare, 2004). Después de enfocar, la tira de IPG se almacenó a -80 ° C hasta la separación por SDS-PAGE como se describe anteriormente. Tres repeticiones de cada uno de los purificados por afinidad piscinas de glicoproteína se separaron por 2-DE y se visualizaron por tinción con Coomassie coloidal azul G-250 [15]. Gel imágenes fueron capturados utilizando un densitómetro GS-800 (BioRad, Reino Unido).
Análisis de 2-DE separaciones
Se analizaron las separaciones 2-DE para identificar glicoproteínas presentes en diferentes niveles de la especímenes de CRC de los pacientes con enfermedad LN positivo. archivos de imágenes escaneadas se analizaron usando el software progénesis PG240 SameSpots (Nonlinear Dynamics, Reino Unido), la cantidad relativa de proteínas en un punto dado se infiere a partir del valor de intensidad de píxel y convierte a un porcentaje de la intensidad total de todas las manchas de proteínas en el gel. Glicoproteínas que muestran niveles alterados se clasifican de acuerdo con el valor de p (ANOVA de una vía) y los valores de factor de cambio.
Matrix asistida por láser de desorción espectrometría de masas de ionización (MS) análisis
Identificación de proteínas era llevado a cabo mediante un acuerdo comercial con el Dr. Kevin Bailey, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad de Nottingham. manchas de proteínas se escindieron de la 2-DE geles separados; desalado utilizando C18ZipTips fase reversa (Millipore, Reino Unido). 2 l de muestra de péptido desalado fue descubierto en un solo objetivo bien en una matriz de desorción láser asistida por ionización de placa de acero inoxidable (MALDI) con ácido 4-ciano-hydroxycinnaminic alfa 1 l que contiene patrón interno (hormona corticotropina adeno, ACTH). El objetivo se dejó secar al aire y analizados utilizando en un MALDI-MS (M @ MicroMass LDI, Waters Corp) Resolución operativo & gt; 10.000 anchura a media altura) en el modo de reflexión. Los espectros se adquirieron a 5 Hz usando un láser de nitrógeno (λ 337 nm) con 10 disparos sumadas por espectros. Los datos fueron adquiridos mediante un muestreo al azar de la tablilla de puntería y los archivos de lista de pico péptido se genera de forma manual y automática. Los picos de fondos de la tripsina y la queratina fueron excluidos y las listas de pico se cargaron en el MASCOTA PMF (http://www.matrixscience.com/) motor de búsqueda de base de datos con los parámetros establecidos de la siguiente manera: la tolerancia péptido 0,2 Da; modificaciones durante el proceso de digestión, como la metionina oxidada y la CAM se tuvieron en cuenta y se perdió divisiones se pone a 1.
Predicción de modificaciones post-traduccionales (PTM) guía
El análisis bioinformático se llevó a cabo utilizando el NetNGlyc ; NetOGlyc; YinOYang; herramientas NetPhos en http://www.cbs.dtu.dk/services para identificar potenciales ligados a N, O-GalNAc, O-GlcNAc y O-fosfato sitios de modificación de las proteínas de unión HPA identificados anteriormente.
el análisis estadístico
las comparaciones entre los 2 grupos (ganglios linfáticos positivos /negativos CRC) se realizaron utilizando muestras independientes t-test de Student para datos continuos y ANOVA para las variables categóricas. También se utilizó el coeficiente de Pearson para determinar si los niveles de HPA o anexina de unión se asocian con un intervalo libre de enfermedad. Las curvas de supervivencia se trazaron de acuerdo con el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank; para todas las pruebas realizadas, los valores de p de & lt; 0,05 se tomaron como estadísticamente significativas. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 19 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU., IBM Company).
Resultados y Discusión
El análisis proteómico de
O-
glicoproteínas relacionadas en el CCR
proteínas agrupados de tejidos de CRC se fraccionaron mediante cromatografía de afinidad HPA, separados por 1-dE y 2-dE y se identificó el uso de MS, en un enfoque proteómico el objetivo de caracterizar la
O-
glicanos ligados elevados en CRC metastásico a los ganglios linfáticos (Fig 1 y S1 FIG). Siete glicoproteínas se identificaron utilizando este enfoque (Tabla 1), incluyendo las proteínas de la membrana celular anexina 4, anexina 5 y el canal de cloruro activado de calcio proteína 1 (CLCA1). Anexina 4 ha sido previamente identificado como una glicoproteína de unión HPA en la línea celular de cáncer colorrectal HT29 [12]. Junto con el aumento de los niveles de
O-
glicosilación ligada, se identificó también un aumento de los niveles de ACE (S1 figura) sugieren que
N-
glicosilación ligada también aumentan en el cáncer metastásico CRC.
Las proteínas agrupados de LN + ve muestras de tejido de CRC fueron purificados por afinidad con HPA y separados por enfoque isoeléctrico en un IPG tira de pH 4-7 y luego por SDS-PAGE (12%) y se visualizaron usando coloidal Coomassie azul. Recuadro: anexina 4/5 como se indica en LN + ve comparado con LN-ve CRC muestra de tejido piscinas de proteínas. Las proteínas identificadas en el análisis de MALDI-MS se indican.
El número de acceso de proteínas, descripción, Mascota puntuación, la cobertura de secuencia, masa nominal y predijo pI se indican. De veces que cambia es la relación entre el volumen medio normalizado de la mancha separados por 2-DE de la LN + ve grupo y el grupo de la LN-ve.
O- glicosilación ligada
, p53 y
estado de la mutación KRAS
un enfoque histoquímica se utilizó con HPA como marcador de
O-
estado de glicosilación ligada. La mayoría de las muestras fueron reactivos con la lectina (n = 24, del total n = 27 casos) y exhibió tinción de la membrana celular intensa con un menor número de casos que muestran tinción citoplásmica granular, tal vez representa la unión de la lectina a glicoconjugados en tránsito a través del Golgi aparato (Fig 2). El microscopio de luz no proporciona suficiente resolución como para permitir una estrecha interrogatorio de los orgánulos intracelulares de los tejidos que delimitan HPA. Es posible que algunas de las glicoproteínas identificadas en este estudio son, por lo tanto, las proteínas en tránsito a través de la vía secretora, que incluye el aparato de Golgi, sin embargo, gran parte del HPA unión observada mediante inmunohistoquímica se asoció membrana celular. No hubo relación entre la intensidad de la tinción de HPA y la edad del paciente, el sexo, el grado del tumor o el estado LN pero esto puede reflejar los relativamente pocos ejemplos de este análisis inicial (datos no mostrados). El anticuerpo anti-p53 era fuertemente reactiva en 13 de los 29 casos y débilmente reactiva en otros 7 casos (Fig 2) y el
O-
estado de glicosilación ligada no se correlacionó con la coloración P53. Todos los casos positivos p53 (n = 15) unido HPA, así como algunos de los P53 casos negativos (n = 8). El
KRAS
estado de la mutación se evaluó utilizando un enfoque basado en la PCR y 8 de los 25 especímenes evaluables exhibidos mutado
KRAS
, ya sea en el codón 12 o 13 (el 26% de los casos), esto se compara favorablemente con la prevalencia en CRC de entre 30 a 40% [17]. De 8 muestras con mutado
KRAS
, cuatro eran al mismo tiempo positivo para la tinción HPA y todos estos eran P53 positivo. Tomados en conjunto estos resultados sugieren que
O-
cambios de glicosilación unidos ocurren temprano en la etiología de la CRC
A la izquierda:. Imágenes de microscopía de luz de las secciones de tejido colorrectal (5 M) se incubaron con HPA (10 g /ml) y estreptavidina-HRP (5 g /ml) o se incubaron con el anticuerpo anti-p53 (1: 200) y el conejo caballo biotinilado anti-IgG de ratón (1: 1000) como se indica. La coloración marrón indica la reacción de la peroxidasa con DAB /H
2O
2, los núcleos se counterstained con hematoxilina (azul). Ampliación X400. Derecha: Tabla que muestra los resultados de HPA, P53 y
KRAS
análisis
La validación de los resultados del análisis proteómico
fueron examinados Anexina 4 y 5 niveles de anexina. usando transferencia Western, Fig 3. Después de la normalización de los niveles de beta-actina, un aumento significativo en el nivel de anexina 4 (pero no anexina 5) se observó en las muestras de tejido de CRC que se había metastatizado a los ganglios linfáticos en el momento del diagnóstico (test t de Student, P = 0,05). Del mismo modo, las transferencias Western se sondaron con HPA y se observó un aumento en las glicoproteínas de unión HPA en muestras de pacientes positivos de ganglios linfáticos (datos no mostrados). Esto es consistente con los hallazgos de otros estudios que informan de un aumento de
O-
glicosilación unido mal pronóstico en el cáncer metastásico CRC. Para determinar si la anexina 4 y HPA unión correlacionan con un mal pronóstico CRC una serie adicional de 35 muestras de CRC con el seguimiento de los pacientes fueron evaluados utilizando los datos de inmunohistoquímica. Cuando el porcentaje de células con tinción (0-100%) y la puntuación de tinción agregada (escala 0-7) se consideraron, ambos fueron significativamente correlacionada inversamente con la supervivencia del paciente, la figura 4. Por ejemplo, cuando se tomó la puntuación de tinción agregado para HPA ≥5 como la mediana de supervivencia fue de 13 meses en comparación con 68 meses para un corte ≤5 (Chi cuadrado 9.065; valor de p = 0,0026); para anexina 4: cuando un punto de corte para la puntuación de tinción agregado de ≥5 fue tomada la mediana de supervivencia fue de 17 meses; por el contrario una puntuación de ≤5 se asoció con una supervivencia media de 59,6 meses (prueba Chi cuadrado 11,45; valor de p = 0,0007). Cuando se combinaron los resultados tanto para anexina 4 y HPA éstos permanecieron significativamente inversamente asociados con la supervivencia después de la CRC, la figura 4. Para anexina 4: tomar un punto de corte de ≥60% de las células de la tinción, la mediana de supervivencia fue de 11 meses en comparación con 58 meses ≤60% de las células de la tinción (Chi cuadrado 7.466; P = 0,0063 valor) ;. Para HPA: ≥50% tinción celular resultó en una supervivencia media de 11,5 meses; pero cuando fue tomada la tinción de células ≤50% mediana de supervivencia fue de 60 meses (prueba Chi cuadrado 11,74; valor de p = 0,0006), datos no mostrados. Estos resultados ilustran que la unión de HPA y anti-anexina 4 anticuerpos de secciones de tejido de CRC son indicadores de mal pronóstico. Tanto el
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vinculado en glicosilación como se mide por tinción HPA-y los niveles de anexina 4 son marcadores de CRC pobre pronóstico. La complejidad del proteoma hace marcador tumoral trabajo descubrimiento desafiante; sin embargo, hay una necesidad para la identificación de biomarcadores y nuevos objetivos para el tratamiento de la CRC. De las muchas modificaciones post traduccionales que se producen en las proteínas, la glicosilación es el más abundante y diversos [18] y las aberraciones en la glicosilación de proteínas reportados en el cáncer [19] ofrecen un potencial para la identificación de los cambios específicos de cáncer. Carbohidratos proteínas de unión, lectinas, han sido previamente descrito para la captura por adelantado de glicoproteínas asociadas al cáncer [20, 21]. Ha habido un considerable interés en las glucoproteínas reconocidos por la lectina HPA como la participación de los epítopos de unión de HPA en el proceso metastásico se ha establecido el uso de líneas celulares de cáncer derivadas de tejidos de tumores humanos [22]. α5 y α6 y anexina 2 y 4 integrina previamente han sido identificados como los principales componentes de unión HPA en la línea metastásico de células HT29 CRC [12]. En este estudio proteínas a partir de muestras de tejidos de CRC se pre-fraccionaron mediante cromatografía de afinidad HPA permitiendo de este modo las proteínas de baja abundancia a ser aislados e identificados. Las diferencias en el HPA glicoproteínas de unión en muestras que habían metástasis a los ganglios linfáticos en el momento del diagnóstico fueron evidentes cuando las glicoproteínas fueron separados por 1-DE y se transfirieron a nitrocelulosa de indicación de un aumento global de
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vinculados glicosilación; probable que se asocie con Tn y la expresión del antígeno sialil-Tn en el cáncer [23]. Cuando se utilizó HPA para sondar transferencias Western de las preparaciones de proteína de cáncer, el número de bandas y su intensidad variaron en comparación con cuando las proteínas habían sido pre-fraccionó mediante cromatografía de afinidad de lectina (S1 Fig). Esto puede reflejar diferencias sutiles en la unión cuando HPA se inmovilizó covalentemente a una matriz de afinidad en comparación con cuando la lectina fue en solución libre. La identificación de las glicoproteínas de unión HPA de CRC era un objetivo importante de este trabajo, estos se compararon con los niveles de CEA de las mismas muestras de tejido y se confirmó para ser independiente de los niveles de CEA (S1 FIG). Mientras que el estudio de las mucinas estaba más allá del alcance de este trabajo actual, claramente los niveles de MUC1 y MUC2 y sus propiedades de unión HPA es una cuestión de algún interés. Del mismo modo, la localización intracelular de las proteínas de unión de HPA es de interés. No es técnicamente viable para fraccionar los orgánulos celulares cuando se utilizan muestras de tejido de cáncer congelada como material de partida y así que no hayan podido determinar si las glicoproteínas del aparato de Golgi se purificaron usando la etapa de cromatografía de afinidad. El objetivo principal fue identificar las proteínas que se unen al HPA lectina y que se alteran en metastásico y no metastásico CRC. A medida que el tejido-tinción usando HPA mostró tinción de membrana tanto intracelular e intenso, que la hipótesis de que las glicoproteínas de unión HPA identificados en este estudio son susceptibles de ser derivada de la membrana celular, el citosol y potencialmente, desde el aparato de Golgi. El análisis proteómico de las proteínas de unión purificados por afinidad HPA reveló siete glicoproteínas incluyendo anexina 4 y 5 y CLCA1 que se incrementó en los preparativos de los tejidos de cáncer metastásico. Anexina 4 ya se ha demostrado en un estudio separado de ser reconocidos por HPA en la línea celular HT29 CRC [12]. Los tres de estas proteínas han sido previamente descritos en relación con CRC pero las proteínas no han sido previamente identificados a través de pre-enriquecimiento a través de
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moeities glicanos ligados. Las anexinas son una familia de fosfolípido y de hidratos de carbono regulada por calcio proteínas de unión con diversas funciones intra y extracelulares en gama de procesos celulares, incluyendo la señalización, transporte de iones, la división celular y la apoptosis [24].