Extracto
Antecedentes
El cáncer de próstata es el cáncer más común entre las hombres de edad avanzada en los EE.UU., y la inmunoterapia ha demostrado ser una estrategia prometedora para el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración. Los esfuerzos para identificar antígenos tumorales específicos novela de próstata facilitarán el desarrollo de vacunas contra el cáncer eficaz contra el cáncer de próstata. G-proteína específico de la próstata receptor acoplado (PSGR) es un nuevo antígeno que se ha demostrado ser específicamente sobre-expresado en tejidos de cáncer de próstata humano. En este estudio, se describe la identificación de epítopos de péptidos derivados de PSGR reconocidos por las células CD8
+ T de una manera dependiente de HLA-A2.
Metodología /Principales conclusiones
Veintiún péptidos derivados de PSGR fueron predichas por un enfoque inmuno-informática basada en el motivo de unión a HLA-A2. Estos péptidos se examinaron para su capacidad de inducir respuestas de células T específicas de péptido en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas a partir de cualquiera de HLA-A2
+ de donantes sanos o pacientes HLA-A2
+ cáncer de próstata. El reconocimiento de las células LNCaP HLA-A2 positivos y PSGR expresar también fue probado. Entre los 21 péptidos derivados de PSGR, tres péptidos, PSGR3, PSGR4 y PSGR14 con frecuencia inducen respuestas de células T específicas de péptido en PBMCs de dos donantes sanos y pacientes con cáncer de próstata. Es importante destacar que estas células T específicas de péptido reconocidos y mataron a las células de cáncer de próstata LNCaP en una forma de HLA de clase I restringidos.
Conclusiones /Importancia
Hemos identificado tres nuevos PSGR restringidos por HLA-A2 péptidos derivados reconocidos por las células CD8
+ T, que, a su vez, reconoce HLA-A2
células tumorales
+ y + PSGR. Los péptidos derivados de PSGR identificados se pueden utilizar como marcadores de diagnóstico, así como los objetivos inmunes para el desarrollo de vacunas contra el cáncer
Visto:. Matsueda S, Wang M, Weng J, Li Y, Yin B, Zou J, et Alabama. (2012) Identificación de los prostático específico G-receptor acoplado a proteína como un antígeno tumoral reconocido por CD8
+ células T para inmunoterapia del cáncer. PLoS ONE 7 (9): e45756. doi: 10.1371 /journal.pone.0045756
Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de mayo de 2012; Aceptado: August 24, 2012; Publicado: 20 Septiembre 2012
Copyright: © Matsueda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer, Instituto Nacional de Salud y el Instituto de Investigación del cáncer, y el Instituto de Investigación del hospital Metodista. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata se ha convertido en el cáncer más común entre los hombres en los EE.UU. y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses [1]. El tratamiento estándar para la mayoría de los pacientes con cáncer de próstata es la cirugía y /o radioterapia. Sin embargo, recurrencia de la enfermedad después de la cirugía o la radiación todavía tiene lugar hasta en el 30% de los pacientes. Aunque la terapia de privación de andrógenos es un tratamiento efectivo contra la enfermedad recurrente, la mayoría de estos pacientes eventualmente desarrollan cáncer de próstata refractario a los andrógenos, que es insensible al tratamiento tradicional. Por lo tanto, se necesitan urgentemente terapias más eficaces y menos tóxicos. La inmunoterapia ha demostrado ser un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer de próstata, especialmente para pacientes con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración [2] - [4]. Aprovechar el sistema inmunológico para erradicar las células malignas es un enfoque prometedor para la terapia del cáncer, pero hasta hace poco se ha tenido un éxito clínico esporádico [4] - [6]. Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los recientes aprobaciones vacuna basada en la inmunoterapia /quimioterapia sipuleucel-T
(
Provenge) y ipilimumab (Yervoy) representan hitos en el campo de la inmunoterapia del cáncer [7], [8]. Los resultados clínicos altamente alentadores Por otra parte, un ensayo clínico de fase III del péptido gp100 de melanoma también produjo [9]. Sin embargo, los beneficios clínicos reportados para estos agentes han sido muy inferiores a las respuestas completas y curas permanentes. En el caso de sipuleucel-T, el beneficio de supervivencia para los pacientes fue de sólo 4,1 meses, sin regresión del tumor objetivo o cambios sustanciales en los niveles de antígeno específico de la próstata (PSA). Un estudio reciente utilizando modelos animales más revela la importancia de los antígenos específicos de tumores en la provocación de respuestas inmunes contra un tumor en desarrollo [10], estimulando más esfuerzos para identificar tales antígenos para la inmunoterapia del cáncer. Además, dado que algunos antígenos principales de rechazo pueden perderse o alterarse debido a la selección de las células T y la matanza [11], la mejor estrategia es apuntar a múltiples antígenos tumorales que están presentes en los tumores individuales para la inmunoterapia.
Hasta la fecha, un número de antígenos tumorales específicos de la próstata han sido bien definidos, incluyendo PSA [12], [13], prostein [14], [15], el antígeno de células madre de próstata (PSCA) [16], antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA ) [17] - [19], la fosfatasa ácida prostática (PAP) [20] y receptor transitorio p8 potencial (trp-p8) [21]. Además, se han descrito los epítopos de HLA de clase I restringido-derivados de estos antígenos tumorales [22]. Una desventaja de la inmunoterapia basada en un solo antígeno tumoral es que se puede producir escape inmune. Por lo tanto, es necesaria la identificación de los antígenos específicos del cáncer de próstata adicionales para el desarrollo de vacunas más eficaces y específicas de antígeno para los pacientes con cáncer de próstata metastásico. G-proteína específico de la próstata receptor acoplado (PSGR) es un miembro de la proteína G acoplada familia de receptores de odorizantes, y es altamente expresado en células de cáncer de próstata en comparación con las células normales de la próstata [23] - [25], lo que sugiere que PSGR puede haber objetivo para el desarrollo de nuevas estrategias inmunoterapéuticas contra el cáncer de próstata.
En un intento de determinar si PSGR puede ser reconocido por las células T, se describe la identificación de epítopos de células T derivados de PSGR para el reconocimiento de células T por una inmuno -bioinformatics enfoque. Se seleccionaron y sintetizaron Veintiún péptidos que se predijeron para unirse a la molécula HLA-A2. Se evaluaron todos estos péptidos
in vitro
por su capacidad para estimular a las células T en PBMC de ambos sujetos sanos y pacientes de próstata sobre la base de interferón-γ (IFN-γ) de liberación medido por ELISA o ensayos de ELISPOT. Se encontraron tres péptidos para inducir la liberación de IFN-γ en células T periféricas de ambos sujetos sanos y pacientes con cáncer de próstata. Es importante destacar que estas células T específicas de péptido podían reconocer HLA-A2
+, PSGR que expresan las células LNCaP en un HLA de clase I de manera dependiente.
Materiales y Métodos
donantes sanos Los pacientes de cáncer de próstata y
Ten HLA-A2
+ pacientes con cáncer de próstata y diez HLA-A2
+ sujetos sanos se inscribieron en este estudio después se obtuvo el consentimiento informado por escrito. Todos los protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Facultad de Medicina Baylor antes de comenzar los estudios. 20 ml de sangre periférica se obtuvo de cada persona, y las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega). Las PBMCs recién aisladas se crioconservaron para su uso posterior en 1 ml de medio de congelación que contiene 90% de sulfóxido de FCS y 10% de dimetilo (DMSO) a -140 ° C. La expresión de moléculas HLA-A2 en PBMCs obtenidas de pacientes con cáncer y los sujetos sanos se verificó mediante citometría de flujo con marcado con FITC HLA-A2 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.).
Líneas celulares
células T2 (HLA-A2
+ deficiente en TAP línea celular), células PC3 (una línea celular de cáncer de próstata HLA-A2-negativo), y las células LNCaP (una HLA-A2 positivo de próstata línea celular de carcinoma) fueron todos adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI-1640 (Mediatech; Manassas, VA, EE.UU.), suplementado con 10% FBS, 1% de L-glutamina, y 1% de penicilina y estreptomicina
péptidos
Veintiún péptidos derivados de PSGR (Tabla 1) se prevé utilizar BIMAS (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/), y Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) basado en el motivo de unión a HLA-A2. Sólo se seleccionaron epítopos que se prevé por lo menos dos de estos algoritmos para la prueba adicional. Los péptidos fueron sintetizados por un método en fase sólida usando un sintetizador de péptidos (AApptec, Inc .; Louisville, KY, EE.UU.), se purificó por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa y validada por espectrometría de masas. Los péptidos sintetizados se disolvieron en DMSO a una concentración de 10 mg /mL y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso posterior.
de estimulación del péptido específico de células T in vitro en PBMCs
PBMCs (1 × 10
5 células /pocillo) a partir de sujetos sanos o pacientes con cáncer de próstata se incubaron con concentraciones de péptido estándar de 20 mg /ml por péptido [26] - [28] en 96 pocillos de fondo en U microplacas (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) en 200 l de medio de linfocitos T (TCM), que consiste en RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, EE.UU.), 10% de suero humano AB (Valle biomédica, Winchester, EE.UU.), 50 mM de 2-mercaptoetanol, 100 U /ml de interleucina-2 (IL-2), y la solución de aminoácido no esencial MEM 0,1 mM (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.). La mitad de la TCM fue removido y reemplazado con la medicina tradicional china que contiene péptidos frescas (20 g /ml) cada 5 días. Después de 14 días de cultivo, se recogieron y se ensayaron para determinar su capacidad de producir IFN-γ en respuesta a células T2 las células (1 × 10
4 células /pocillo), que se pre-cargado con el péptido PSGR (5 g /ml) o un péptido control (un péptido de unión a HLA-A2 irrelevantes: NLLTHVESL) como un control negativo. Después de 18 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes, y la liberación de IFN-γ se determinó mediante ensayo ELISA.
Protocolo Rapid Expansion (REP) para PSGR péptido-células T específicas
péptido PSGR específica Las células T se expandieron por un protocolo de rápida expansión (REP) como se describe anteriormente [29] con una ligera modificación. Brevemente, en el día 0, 0,1-0,5 × 10
6 células T específicas de péptido PSGR se cultivaron en un matraz T25 con 20 ml de RPMI-1640 suplementado con suero AB humano al 10%, 50 mM de 2-mercaptoetanol, y 30 ng /ml de anticuerpo OKT3 (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ), junto con 20 × 10
6 irradiados PBMCs alogénicos y 5 × 10
6 irradió el virus de Epstein Barr (VEB) B-células transformadas como células alimentadoras. Los matraces se incubaron en posición vertical a 37 ° C en 5% de CO
2. Se añadió IL-2 (300 UI /ml) en el día 1, y en el día 5, la mitad del sobrenadante del cultivo celular se retiró y se repone con medio fresco que contenía 300 UI /ml de IL-2. 14 días después del inicio de la REP, se recogieron las células y criopreservados para futuros experimentos
Ensayo ELISA
La liberación de citoquinas se midió mediante el recubrimiento de placas de 96 pocillos de ELISA (Thermo Fisher Scientific;. Rochester, NY , EE.UU.) con 1 mg /ml de IFN-γ anti-humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C. La placa se lavó seis veces con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (solución de lavado) para eliminar el anticuerpo no unido de revestimiento, y se bloqueó con 1% de BSA /PBS a temperatura ambiente durante 2 horas. Después, se añadieron 50 l sobrenadante a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hr, a continuación, 50 l de 0,5 mg /ml biotinilado IFN-γ anti-humana (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.) se añadió y se incubaron las placas durante 1 h adicional a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavaron y se incubaron durante 30 min con poli-HRP-estreptavidina (Thermo Fisher Scientific; Rochester, NY, EE.UU.) diluido 1:5000 en PBS /1% BSA. Las placas se lavaron y se añadieron 100 l de solución de sustrato TMB (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, EE.UU.) por pocillo. La reacción colorimétrica se dejó de usar 2N H
2SO4 y las placas se leyeron a 450 nm usando un lector de placas de ELISA.
Ensayo ELISPOT
El ensayo ELISPOT de IFN-gamma se realizó IFN-? como se describe anteriormente [27] para cuantificar los linfocitos T citotóxicos específicos del péptido (CTL) después de
in vitro
expansión. Brevemente, placas de 96 pocillos de ELISPOT (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) se recubrieron durante la noche a 4 ° C con 7,5 mg /ml de IFN-γ anti-humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.). Las placas se lavaron seis veces con PBS estéril para eliminar el anticuerpo de recubrimiento no unido. Las células T se sembraron a 1 x 10
5 células por pocillo y se incubaron con células T2 solamente, las células T2 pulsadas con un péptido PSGR (5 mg /ml) o un péptido irrelevante como control negativo. Las células estimuladas con anticuerpo /ml de OKT3 5 mg (Ortho Biotech; Bridgewater, NJ, EE.UU.) se utilizaron como control positivo. Después de incubar las muestras durante 18 - 20 horas a 37 ° C y 5% de CO
2, las placas se lavaron con solución de lavado. se añadió, y las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente; 0,75 g /ml de IFN-γ biotinilado anti-humano (Rockford, IL, EE.UU. Pierce Biotechnology). Después de la incubación, las placas se lavaron con solución de lavado y se incubaron adicionalmente con poli-HRP-estreptavidina (Thermo Fisher Scientific; Rochester, NY, EE.UU.) diluido 1:1000 en PBS /1% de BSA durante 1 hr. Las placas se lavaron y se añadieron 200 l de sustrato 4-cloro-1-naftol (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, EE.UU.) a cada pocillo. Finalmente, las placas se lavaron con agua corriente y se secaron a temperatura ambiente. las células formadoras de puntos de IFN-gamma (SFC) se enumeraron usando un lector de ELISPOT (CTL Technologies, Minneapolis, MN, EE.UU.).
La extracción de RNA y RT-PCR
La extracción de RNA y RT- PCR se llevó a cabo como se informó anteriormente [30]. En pocas palabras, el ARN total fue extraído de células de cáncer de próstata con 1 ml de reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Tres microgramos de ARN se transcrito de forma inversa en ADNc en 30 volumen l y se utilizó 1 l de cada cDNA en la posterior reacción de PCR con un par de cebadores específicos PSGR: Cebador 1: 5'-GAAGATCTATGAGTTCCTGCAACTTC-3 ', el cebador 2: 5' -CCCAAGCTT TCACTTGCCTCCCACAG-3 '. β-actina se utilizó como control de carga: Cebador 1: 5'-CATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3 '; Primer 2: 5'-CAGACTATGCTGTCCCTGTACGC-3 '. La reacción de PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 94 ° C durante 2 min, 94 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min 20 s, el total de 35 ciclos, 72 ° C durante 10 min, y β-actina se realizó durante 25 ciclos. Igual cantidad de productos de la PCR se cargaron y se detectaron por electroforesis en gel.
Ensayo de citotoxicidad
Las células T específicas de péptido derivado PSGR se ensayaron para determinar la citotoxicidad contra de ambos PC3 y LNCaP por una lactato deshidrogenasa (LDH ) ensayo (Promega, Madison, WI, EE.UU.). El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la liberación de LDH se calculó en base a la siguiente fórmula:
La citotoxicidad (%) = (experimental - efector espontáneo - Objetivo LDH liberación espontánea) /(meta máxima - liberación espontánea de destino LDH) × 100.
la liberación espontánea se determinó usando el sobrenadante de las células diana solas o células efectoras solo, y la liberación máxima se determinó usando el sobrenadante de las células diana incubadas con una solución de lisis incluido en el kit LDH. Para determinar si el reconocimiento de células T es HLA-I Restringido, anti-HLA-I, se añadieron anti-HLA-II, o anti-CD19 mAb (todos de ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) en los pozos en el inicio del cultivo .
intracelular de IFN-γ citoquinas tinción
Las células T específicas de péptido derivado de PSGR (0.5-1 × 10
6) se cultivaron con 0,5 × 10
6 células T2 pulsadas con o sin péptido (5 mg /ml) en presencia de GolgiStop (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) en una placa de 48 pocillos durante 4 horas a 37 ° C. Las células fueron teñidas con anti-CD8 y anti-IFN-γ y se analizaron usando una máquina citómetro.
Estadísticas
Se utilizó la prueba t de Student para analizar las diferencias cuantitativas entre los pozos experimentales y controles ELISA y ELISPOT ensayos. P & lt; 0,05 se consideró significativo un
Resultados
La inducción de CTL PSGR Derivado de péptido-específicas en donantes sanos
Para determinar si los precursores de células T PSGR reactivos están presentes en saludable. los sujetos, se obtuvo PBMCs de HLA-A2 10
+ donantes sanos y les estimularon
in vitro
con cada uno de los 21 péptidos PSGR derivados que contienen motivos de HLA-A2 vinculante (Tabla 1). Después de 2 semanas de estimulación péptido, los sobrenadantes de las células T péptido-estimulado se analizaron mediante el ensayo ELISA para detectar la liberación de IFN-γ en respuesta a células T2 pulsadas con o sin péptidos correspondientes. Como se muestra en la Tabla 2, 13 péptidos PSGR derivados fueron capaces de inducir respuestas de células T específicas de péptido en al menos uno de los 10 sujetos sanos. Es importante destacar que, PSGR3, PSGR4 y PSGR14 podrían inducir respuestas de células T en 7 de cada 10 sujetos sanos, lo que indica que estos 3 péptidos son inmunogénicas y potencialmente capaz de expandir las células T específicas de antígeno en sujetos sanos.
La presencia de CTL específicos de péptidos derivados de PSGR en pacientes con cáncer de próstata
Dado que se encontraron células T específicas de péptido contra PSGR3, PSGR4 y PSGR14 en más del 70% de los sujetos sanos, razonó que los precursores de CTL que reconocen estos 3 péptidos también pueden ser altos en PBMCs de pacientes con cáncer de próstata. Para probar nuestra hipótesis, se examinó si estos tres péptidos candidatos pueden inducir CTL específicos del péptido de las PBMCs de HLA-A2 pacientes
+ cáncer de próstata. Se recogieron y se estimularon PBMCs de pacientes con cáncer de próstata
in vitro
con PSGR3, PSGR4 o péptidos PSGR14. Como se muestra en la Tabla 3, PSGR3, PSGR4 y PSGR14 hecho indujeron CTL específicos del péptido a partir de PBMCs de pacientes con cáncer de próstata.
Reconocimiento de cáncer de próstata líneas celulares de la PSGR Derivado las células T específicas de péptido-
para obtener un gran número de células T específicas de péptido PSGR para su posterior análisis, hemos ampliado las células T específicas de péptido PSGR identificados en las Tablas 2 y 3. para determinar una concentración eficaz de péptido para las células de carga T2 para el reconocimiento de células T , hemos realizado experimentos de titulación de péptidos. Como se muestra en la Figura 1A, para todos los 3 péptidos una concentración de péptido de 5 mg /ml era suficiente para saturar los sitios de unión de moléculas HLA-A2 en las células T2 para el reconocimiento de células T. Por lo tanto, se utilizó sistemáticamente esta concentración de péptido de células T2 pre-carga en ELISA y /o ensayos de ELISPOT. Las células T expandidas mantienen especificidad de antígeno y se secretan cantidades significativas de IFN-γ después de la estimulación con células T2 pulsadas con los péptidos correspondientes, pero no con un péptido de control (figuras 1A, B, C, D). ensayo ELISPOT confirmó además la presencia de células T específicas de péptido en PSGR ampliado células T (Figuras 1E, F, G)
El reconocimiento de las células T2 cargadas previamente con concentraciones valoradas de péptidos (0-20 mg /ml) por las células T específicas de péptido PSGR expandido se ensayó por ELISA de ensayo (A). Las células PSGR3 T expandido (B y E), las células PSGR4 T (C y F) y células PSGR14 T (D y G) fueron, respectivamente, co-incubaron con células T2 (1 × 10
4 células /pocillo) solo en medio completo (CM), o con T2 células pre-cargadas, ya sea con un péptido correspondiente (5 mg /ml) o un péptido de control como control negativo. Las células se incubaron durante 18 -24 horas, la secreción de IFN-γ en el sobrenadante se determinó por ELISA de ensayo (B, C y D). las células formadoras de puntos de IFN-gamma (SFC) fueron enumerados por ensayo ELISPOT (E, F y G). Los datos se representan como la media ± SD. Los resultados representan al menos tres experimentos independientes. *
P
& lt; 0,05, **
P
& lt; 0,01, ***
P
& lt; 0,001 frente a los controles (células T2 solos o células T2 pulsadas con una péptido de control).
para determinar si las células T específicas de péptido derivado de PSGR fueron capaces de reconocer y matar a HLA-A2
+, las células del cáncer de próstata que expresan PSGR, hemos utilizado un HLA PC3 línea celular negativa A2 y una línea celular de cáncer de próstata LNCaP positivo HLA-A2. La expresión de PSGR en estas dos líneas celulares se examinó por RT-PCR. De acuerdo con un informe anterior [31], PSGR fue altamente expresado en LNCaP, pero no en PC3, DU145 o una línea normal de células de próstata PNT1A (Figura 2 A). Como se muestra en la Figura 2B, PSGR3-, PSGR4-, o células T-PSGR14 específica tanto de donantes sanos y pacientes capaces de reconocer y matar a HLA-A2 positivo, expresando PSGR LNCaP, pero no en células PC3 negativo HLA-A2. Estos resultados sugieren que las células T-PSGR específica reconocen epítopos de células T que son procesados y presentados de forma endógena por las células de tumor de próstata.
La expresión de mRNA PSGR en diferentes líneas celulares se determinó por RT-PCR (A). Se probaron las células T específicas de péptido derivados PSGR para citotoxicidad contra tanto PC3 y LNCaP por el ensayo de LDH (B). Los datos de B se representan como media ± desviación estándar. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, frente al control
T células reconocen péptidos derivados de PSGR en un HLA-I restringido Manner
Para probar si las respuestas inducidas. por péptidos derivados de PSGR dependen de CD8
+ células T, que co-cultivadas las células T específicas de péptido PSGR derivados con células T2 pulsadas con o sin péptidos correspondientes en presencia de GolgiStop durante 4 h. Posteriormente se realizó la tinción de las moléculas CD8 y intracelular IFN-γ. Sólo CD8
+ células T fueron encontrados para producir IFN-γ en respuesta a células T2 pulsadas con correspondientes péptidos (Figura 3A), mientras que CD4
+ células T no produjo IFN-γ (datos no mostrados).
células T específicas de péptido PSGR derivados fueron co-cultivadas con células T2 pulsadas con o sin un péptido dado en presencia de GolgiStop en una placa de 48 pocillos durante 4 horas a 37 ° C. Las células se tiñeron con anti-CD8 y anti-IFN-γ, a continuación, se analizaron en un citómetro de la máquina (A). las células T específicas de péptido PSGR derivados se co-incubaron con células LNCaP solo en medio, o con células LNCaP en presencia de anticuerpos anti-HLA-I mAb (W6 /32), HLA-II mAb o un mAb de control (anti -CD19 mAb). Después de 4 horas de incubación, la citotoxicidad contra LNCaP se determinó por el ensayo de LDH (B). Los datos de B se representan como media ± desviación estándar. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. *
P
. & Lt; 0,05, frente a los controles
Para determinar si el reconocimiento de las células LNCaP por las células T específicas de péptido derivado de PSGR es HLA-I Restringido, que CO- células LNCaP cultivadas con las células T específicas de péptido PSGR derivados en presencia de o bien anti-HLA-I mAb (W6 /32) o mAb de control (HLA II-mAb CD19 o anti-mAb). Como se muestra en la Figura 3B, la citotoxicidad de estas células T específicas de péptido fue completamente inhibida por la adición de anti-HLA-I mAb, pero no por anti-HLA-II (HLA-DR) o un mAb control (anti-CD19 ), lo que sugiere que el reconocimiento de las células LNCaP por las células T específicas de péptido derivado de PSGR es HLA-I restringido.
Discusión
está bien establecido que las células CD8
+ T jugar un papel crítico en el control del desarrollo y progresión del tumor. epítopos de péptidos derivados de antígenos asociados a tumores (TAA) pueden ser reconocidos como antígenos por las células T en el contexto de moléculas MHC-I [32], [33]. La identificación de los AAT y sus péptidos que son reconocidos por las células T son esenciales para el desarrollo de vacunas eficaces contra el cáncer
.
El objetivo del presente estudio fue identificar epítopos HLA-A2 PSGR derivados reconocidos por CD8
+ células T en PBMC de sujetos sanos y pacientes con cáncer de próstata. Tres algoritmos de predicción basados en computadoras diferentes, incluyendo BIMAS, SYFPEITHI, y Rankpep se utilizaron para analizar la secuencia de la proteína PSGR para HLA-A2 péptidos basados en el motivo de unión a HLA-A2 de unión. Sólo se incluyeron los péptidos que se predijeron con éxito en al menos 2 de cada 3 de los diferentes algoritmos de predicción basados en computadoras. Veintiún 9mer o 10mer péptidos fueron seleccionados en este estudio de acuerdo con este criterio. Todos estos péptidos se ensayaron para determinar su capacidad para estimular PBMC de sujetos sanos o pacientes con cáncer de próstata para liberar IFN-γ. De los 21 péptidos, tres péptidos inducidos con frecuencia respuestas específicas de células T en PBMCs obtenidas de sujetos sanos o pacientes de cáncer, y estas células T específicas de péptido también reconocieron HLA-A2
+ PSGR-expresión de las células LNCaP, lo que sugiere que estos péptidos son naturalmente procesados por las células de cáncer de próstata
PSGR es un gen específico de tejido de próstata con homología con la familia de genes de receptores de odorizantes acoplado a proteína G y se expresa específicamente en los tejidos de próstata humanos [23] - [25].. La expresión de PSGR es significativamente mayor en los tumores de la neoplasia intraepitelial de próstata y la próstata humana que los tejidos normales [25]. Curiosamente, aunque PSGR ha sido considerada como un objetivo novedoso para la inmunoterapia del cáncer de próstata, no se han identificado epítopos de células T derivadas de PSGR. Esto es, a nuestro entender, el primer informe para identificar y caracterizar los epítopos PSGR derivados reconocidos por CD8 + células T
. La identificación de epítopos PSGR derivados reconocidos por las células T valida aún más PSGR como un objetivo prometedor para el desarrollo de vacunas contra el cáncer.
La mayoría de los AAT son autoantígenos [34], por lo tanto, la auto-tolerancia puede producirse en una tratar de proteger al individuo del desarrollo de la autoinmunidad. Esto se considera que es un obstáculo importante en la inducción de TAA células T específicas capaces de erradicar tumores
in vivo.
Sin embargo, en nuestro estudio, aunque PSGR se expresa en el tejido normal de la próstata, la tolerancia inmune contra PSGR puede se parten, lo que las respuestas de células T contra epítopos PSGR derivado con frecuencia eran detectables en PBMCs de sujetos sanos o pacientes con cáncer de próstata.
Un gran número de ensayos clínicos de inmunoterapia basada en vacunaciones con lisados tumorales, proteínas, TAA TAA ya se han realizado péptidos y ARN o ADN que codifica TAA. Sin embargo, la mayoría de estos ensayos no han logrado los resultados deseados. Una de las razones es que la expresión de estos TAA es heterogénea entre tumores de diferentes pacientes y puede variar incluso entre las metástasis obtenidas de un paciente [35], por lo tanto se puede producir [36] escape inmune cuando el enfoque inmunoterapéutico se basa únicamente en un TAA. Para evitar el escape inmunológico, estrategias inmunoterapéuticas basadas en vacunas que se dirigen a varios antígenos tumorales son esenciales para el desarrollo de vacunas contra el cáncer con éxito. inmunoterapia lo tanto la identificación de antígenos de tumor de próstata específico adicionales, tales como PSGR, basado en células T para todavía se necesita, a pesar de que un número de antígenos tumorales específicos de la próstata incluyendo PSA [12], [13], PSCA [16], PSMA [ ,,,0],17] - [19]., PAP [20], Prostein [14], [15] y tRP-P8 [21], se han identificado en los últimos años
La FDA ha aprobado recientemente un cáncer vacuna, Sipuleucel-T, para el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata avanzado basado en un estudio de fase III [8]. Sipuleucel-T se prepara a partir de PBMCs autólogas que contienen células presentadoras de antígeno que se incuban con una proteína recombinante compuesta por una PAP vinculado a granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF). Sipuleucel-T, presumiblemente funciona en parte mediante el aumento de la PAP-específica CD8
+ T cell respuestas, lo que demuestra aún más la importancia de tumor específico de antígeno CD8
+ células T inducidas por vacunas contra el cáncer. Hasta el momento, Sipuleucel-T es el primer agente inmunoterapéutico celular aprobada por la FDA para ser utilizado para el tratamiento de pacientes con cáncer. La aprobación de la FDA de Sipuleucel-T como una vacuna contra el cáncer terapéutica no sólo valida la eficacia de la inmunoterapia del cáncer, sino que también proporciona un fuerte impulso en el campo de la inmunología del cáncer [37]. Por lo tanto, la identificación y el desarrollo de más novela TAA incluyendo PSGR y de péptidos derivados reconocido por CTLs es sin duda esencial para facilitar el desarrollo de vacunas contra el cáncer eficaces contra los cánceres de próstata, así como otros tipos de cáncer en el futuro.
Además, los epítopos reconocidos por CD8
+ células T se pueden utilizar como herramientas de diagnóstico para monitorear específicas de péptido CD8
+ células T en individuos en el curso de la inmunización, identificando así los marcos de tiempo óptimos para la inmunización durante el tratamiento, incluyendo si subsiguiente se necesitan vacunas en los individuos cuando la inmunidad anti-tumoral disminuye.
en resumen, se han identificado tres nuevos epítopos de CTL PSGR derivados. Dado que la expresión PSGR es fuertemente hasta reguladas en los cánceres de próstata humanos, los péptidos derivados de PSGR pueden servir como herramientas de diagnóstico o dianas inmunoterapéuticas de vacunas contra el cáncer solos o en combinación con otros epítopos que se derivan de otros antígenos específicos de la próstata.
Reconocimientos
Nos gustaría agradecer a los Dres. Adebusola Alagbala Ajibade y Audrea M. Burns para la lectura crítica de este manuscrito y Hui Una de asistencia en la figura de preparación.