Extracto
Bmi1 se sobreexpresa en una variedad de cánceres humanos incluyendo cáncer gastrointestinal. El alto nivel de expresión de la proteína Bmi1 se asocia con un mal pronóstico de los pacientes con cáncer gastrointestinal. Por otro lado, los macrófagos asociados al tumor (TAM) contribuyen al crecimiento tumoral, la invasión y la metástasis mediante la producción de diversos mediadores en el microambiente tumoral. El objetivo de este estudio fue investigar la regulación mediada por TAM de expresión Bmi1 en el cáncer gastrointestinal. La relación entre TAM y la expresión Bmi1 se analizó mediante inmunohistoquímica y cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR), y los resultados mostraron una correlación positiva con los macrófagos infiltrantes de tumor (CD68 y CD163) y la expresión Bmi1 en células de cáncer. Co-cultivo con TAM desencadena la expresión Bmi1 en líneas celulares de cáncer y mejorar la capacidad de formación de esferas. Se llevó a cabo el análisis de microarrays miARN de una línea celular de cáncer gástrico co-cultivadas con macrófagos, y el uso de
in silico
métodos para analizar los resultados, se identificaron miR-30e * como un regulador potencial de expresión Bmi1. Los ensayos de luciferasa utilizando el miR-30e * imitan revelaron que Bmi1 era un objetivo directo de miR-30e * por la interacción con la supuesta miR-30e * sitios de unión en la región no traducida Bmi1 3 '. QRT-PCR análisis de las muestras de cáncer de resecados mostró que el miR-30e * expresión se downregulated en las regiones del tumor en comparación con las regiones no tumorales, y la expresión Bmi1 fue inversamente correlacionada con la expresión de miR-30e * en tejidos de cáncer gástrico, pero no en tejidos de cáncer de colon . Nuestros hallazgos sugieren que los TAM pueden causar un aumento de la expresión de miR-Bmi1 través 30e * supresión, que conduce a la progresión del tumor. La supresión de la expresión Bmi1 mediada por TAM puede así representar una posible estrategia como el tratamiento del cáncer gastrointestinal
Visto:. Sugihara H, Ishimoto T, Watanabe M, Sawayama H, Iwatsuki M, Baba Y, et al. (2013) Identificación de miR-30e * Regulación de la Expresión Bmi1 mediada por macrófagos asociados a tumores en el cáncer gastrointestinal. PLoS ONE 8 (11): e81839. doi: 10.1371 /journal.pone.0081839
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 4 Julio, 2013; Aceptado: 17 de octubre de 2013; Publicado: 28 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Sugihara y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo Memorial Okukubo para la Investigación médica de la Facultad de la Universidad de Kumamoto de Medicina, Premio Estímulo de Investigación médica de la Asociación médica de Japón y una Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (a TI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Bmi1 es un miembro del complejo polycomb-represiva 1 con un papel esencial en el mantenimiento de la cromatina silenciamiento [1,2]. Bmi1 desempeña una función en la auto-renovación de las células madre neuronales y hematopoyéticas mediante la represión de la INK4a /ARF locus [3-6]. Además, Bmi1 se expresa en células madre intestinales y implicado en el mantenimiento del intestino delgado epitelio [7]. Bmi1 se identificó primero como un oncogén que coopera con c-myc durante lymphomagenesis ratón, y se sobreexpresa en una variedad de cánceres humanos, incluyendo el cáncer gastrointestinal [8-10]. Además, el nivel de expresión de proteína Bmi1 se asocia con un mal pronóstico de los pacientes con cáncer gastrointestinal [9,10]. Sin embargo, el mecanismo subyacente de la regulación Bmi1 en células de cáncer es en gran parte desconocida.
Los tumores sólidos consisten en células de cáncer y varios tipos de células estromales, fibroblastos, células endoteliales y las células hematopoyéticas, principalmente macrófagos y linfocitos. Los macrófagos tienen plasticidad funcional y se describen por dos estados distintos de polarización: clásicamente activada por (M1) y activados alternativamente-(M2) fenotipos de macrófagos. Estudios previos revelaron que los macrófagos M2-M1-polarizados y juegan diferentes papeles funcionales en el microambiente tumoral [11,12]. macrófagos polarizadas-M1 en general han de antígeno que presentan funciones y actividad tumoricida. En contraste, los macrófagos polarizadas-M2 juegan un papel en la respuesta a los parásitos, la cicatrización de heridas, la remodelación de tejidos, y promueven el crecimiento y la vascularización de los tumores. En muchos cánceres humanos, macrófagos asociados a tumores (TAM) contribuyen al crecimiento del tumor, la invasión y la metástasis mediante la secreción de diversos mediadores, por lo que se propuso que los TAM fueron predominantemente polarizada a M2 macrófagos fenotipo [13-17]. Por otro lado, estudios más recientes demostraron que los macrófagos eran células muy plástico, y sus cambios epigenéticos reprogramed TAM de un M2 a un fenotipo M1-como en los tumores [17,18].
microARNs (miRNAs) son ARN (21-23 nucleótidos) que se unen de manera imperfecta a la región no traducida 3 '(UTR) de sus ARNm diana para reprimir su traducción no codificante. miRNAs se han encontrado para apuntar a los oncogenes y supresores tumorales diferentes, y la evidencia emergente sugiere que la desregulación de miRNAs está implicada en la patogénesis de muchos tipos de cáncer [19,20]
.
Para explorar la regulación de la expresión en células de cáncer Bmi1 , se analizó una posible correlación entre la expresión Bmi1 en células de cáncer gastrointestinal y macrófagos infiltrantes en el microambiente del tumor, y se investigó el mecanismo subyacente a la regulación de la expresión Bmi1. Aquí demostramos que el miR-30e * mediada por TAM regula directamente la expresión Bmi1 en el cáncer gastrointestinal.
Materiales y Métodos
cultivo de células y el tratamiento
Las líneas de células AGS, NUGC4 , COLO201, y THP-1 fueron cultivadas en 5% de CO
2 a 37 ° C en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). células HCT116 se cultivaron en 5% de CO
2 a 37 ° C en la mezcla-medio nutriente de Eagle modificado de Dulbecco F-12 (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% FBS. Las líneas celulares se obtuvieron de la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación Riken Cell Bank y de bio Centro de Banco de Células.
La inmunohistoquímica (IHC) y anotando
Se llevaron a cabo los procedimientos de procesamiento de muestras y de IHC como se describe anteriormente [ ,,,0],21]. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con 3% de peróxido de hidrógeno. Las secciones se incubaron primero con anticuerpos diluidos, seguido de incubación con polímero marcado con peroxidasa de rábano picante libre de biotina a partir del sistema de detección Envision Plus (Dako, Glostrup, Dinamarca). Las reacciones positivas se visualizaron utilizando solución de diaminobencidina, y por contraste con hematoxilina de Meyer. Como control negativo, los anticuerpos primarios de ratón se utilizan y no se observaron manchas positivas. Todo tinción IHC se puntuó de forma independiente por dos patólogos. Bmi1 nuclear y CD68 y CD163 expresiones citoplásmicos fueron interpretados de acuerdo con las directrices publicadas en el estudio anterior. Para Bmi1 nuclear y citoplasmática CD68 y CD163, anotamos los resultados de la tinción positiva en las categorías de 0 a 3+ de la siguiente manera: 0, sin manchas; 1+, 1 a 25% de la muestra teñidas; 2+, 26-50%; y 3+, & gt; 50%. . Una puntuación de 3+ se consideró un resultado positivo IHC
Los anticuerpos para IHC e inmunotransferencia
analiza
Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el análisis de IHC: un anticuerpo monoclonal de ratón específico para Bmi1 humana ( 1: 100 dilución; Abcam, Cambridge, Reino Unido), un anticuerpo monoclonal de ratón específico para CD68 humana (dilución 1: 100; Dako, Glostrup, Dinamarca), y un anticuerpo monoclonal de ratón específico para CD163 humano (dilución 1: 100; Novocastra, Newcastle, Reino Unido). Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el análisis de inmunoblot: a anticuerpos monoclonales de ratón a Bmi1 (1: 1000), y un anticuerpo policlonal de conejo para β-actina humana (1: 1000; Cell Signaling Technology).
ARN
y miRNA aislamiento
el ARN total, incluyendo miARN, fue aislado de líneas celulares utilizando un kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion, Austin, TX, EE.UU.), y se eluyó en 100 l de solución de elución climatizada, de acuerdo con el protocolo del fabricante. miRNAs fueron extraídos de tejidos fijados con formalina embebidos en parafina de cáncer gastrointestinal y sus epitelios gastrointestinales normales adyacentes emparejados usando un kit de aislamiento de RecoverAll total de ácido nucleico para FFPE (Ambion), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza y la concentración de todas las muestras de ARN fueron evaluados por su relación de absorbancia a 260/280 nm, determinados usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Rockland, DE, EE.UU.).
preparación THP-1 macrófagos y el co-cultivo de ensayo
THP-1 células fueron sembradas en los insertos transwell (3540, Corning) para placas de 6 pocillos (1 x 10
6 células /pocillo). Para la preparación de polarizadas-M1 macrófagos THP-1, se añadió 320 nM de acetato de forbol miristato (PMA) a las células THP-1 durante 6 h, seguido de PMA más 20 ng /ml de interferón (IFN) -γ y 100 lipopolisacárido ng /ml para las siguientes 18 h. Para la preparación de polarizadas-M2 macrófagos THP-1, se añadió 320 nM PMA a las células THP-1 para 6 h, seguido de PMA más 20 ng /ml de interleucina (IL) -4 /IL-13 por los siguientes 18 h. Después de tres lavados para eliminar las citoquinas, M1-M2-polarizado o macrófagos THP-1 se co-cultivaron en insertos superiores con AGS o células HCT116 en placas de 6 pocillos (1 x 10
5 células /pocillo) sin contacto directo, en cada medio sin FBS al 10% como se describió anteriormente. Después de 24 h de co-cultivo, se descartaron las inserciones superiores que contienen los macrófagos. AGS y células HCT116 se lavaron y se usaron para experimentos posteriores.
Esfera cultura
Como se describió anteriormente, se preparó M1- o polarizadas-M2 macrófagos THP-1. Después de tres lavados para eliminar las citoquinas, M1-M2-polarizado o macrófagos THP-1 se co-cultivaron en insertos superiores con AGS y células HCT116 (1 × 10
4 células /pocillo) no adhesiva en placas de 6 pocillos ( 3471, Corning) sin contacto directo, recubierta con agarosa delgada a una densidad de 2 × 10
4 /mm
3 en DMEM libre de suero /medio F12 (Invitrogen) que contiene 1% de N2 (Gibco), 2% B27 (Gibco), 20 ng /factor de crecimiento de fibroblastos humanos ml (FGF) -2 (Sigma, St. Louis, MO), y /factor de 20 ng ml de crecimiento epidérmico (EGF) (Sigma). Cada tratamiento se llevó a cabo por triplicado. El medio de cultivo se cambió cada dos días hasta que la formación esfera. Después de 10 días, se recogieron las esferas.
macrófagos cultura y el co-cultivo de ensayo
Las células mononucleares de sangre periférica se obtuvieron de donantes voluntarios sanos. + monocitos CD14 se aislaron utilizando microperlas CD14 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Los monocitos se sembraron en placas de 6 pocillos (1 x 10
5 /pocillo) y se cultivaron con granulocitos M-CSF (2 ng /ml) (Wako, Tokio, Japón) durante cinco días para inducir los macrófagos inmaduros. Después de lavados con PBS, las células fueron estimuladas con IFN-γ (1 ng /ml) (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.) para inducir los macrófagos M1. Los monocitos se colocaron en placas y se cultivaron con M-CSF (100 ng /ml) (Wako) durante cinco días para inducir los macrófagos inmaduros. Después de lavados con PBS, las células fueron estimuladas con IL-10 (10 ng /ml) (PeproTech) para inducir los macrófagos M2. Se recogieron los medios de M1- o cultivos de macrófagos polarizadas-M2 y se transfiere en placas de 6 pocillos que contienen AGS y células HCT116 (1 × 10
4 células /pocillo). Después de 24 h de co-cultivo, AGS y células HCT116 se lavaron y se usaron para experimentos posteriores.
miARN microarray
Cyanine-3 (Cy3) cRNA marcado, se preparó a partir de 100 ng de ARN usando miRNA de Agilent Labeling Kit completa y Hyb (p /n 5.190 a 0456) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agilent Humanos de 8 x 60K miARN matriz se realizó en los dos grupos de muestras. La hibridación se realizó según las instrucciones del etiquetado completa miARN de la Agilent y Kit Hyb. Las diapositivas fueron escaneados inmediatamente después del lavado en la Agilent DNA microarrays escáner (G2505C) usando una exploración ajuste de color para las diapositivas de matriz 8x60k (área de escaneado 61x21.6 mm, 5 um Resolución de escaneo, el canal de colorante se establece en verde y verde PMT se establece en 100% ). Las imágenes escaneadas fueron analizados con el software de extracción de características 10.7.3.1 (Agilent) usando los parámetros por defecto (protocolo miRNA_107_Sep09). sonda intensidades se normalizaron usando GeneSpring 12,0 través de la normalización de cambio percentil. MiRNAs diferencialmente expresados se identificaron a través del cambio de filtrado Fold. los datos de microarrays se han depositado en la órbita geoestacionaria (no la adhesión GSE50601;. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50601).
cuantitativa en tiempo real inversa-reacción en cadena de la polimerasa con transcripción (QRT-PCR)
los niveles de expresión de miR-30e * se determinaron mediante TaqMan QRT-PCR utilizando kits de ensayo TaqMan miARN (Ambion), de acuerdo con el protocolo del fabricante, como se describió anteriormente . miR-30e * expresión se normalizó a la expresión de RNU6B ARN nuclear pequeño. Los niveles de expresión de Bmi1 se cuantificaron por sondas Maestro QRT-PCR utilizando un LightCycler 480 Sondas Master (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y se normalizó para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Todas las reacciones de QRT-PCR se realizaron utilizando el sistema LightCycler 480 II (Roche Diagnostics). Las cantidades relativas de miR-30e * y Bmi1 se midieron con el método -ΔΔCT 2
. Todas las reacciones de QRT-PCR se realizaron por triplicado.
La transfección de genes miARN
Las células fueron transfectadas con 5 nM imitar o inhibidor de miR-30e * (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando reactivo Lipofectamine RNAiMax transfección (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La especificidad de la transfección se verificó utilizando un imitador control negativo (Applied Biosystems). Los niveles de expresión de miR-30e * Se cuantificaron 48 h después de la transfección, y las células fueron utilizados para experimentos posteriores.
Generación de mutantes Bmi1 3'UTR
Los vectores que contienen mutados miR-30e * secuencias diana en el ser humano Bmi1 3'UTR fueron introducidos por mutagénesis dirigida al sitio usando los siguientes cebadores de PCR: 5'-ccUAUGGACGU UAAUUGAAAa -3 'por financiación del tipo salvaje Luc Bmi1 y 5'-ccUAUGGACGU UAUGACUUUa -3' para Luc-Bmi1-mutante.
luciferasa ensayo
células AGS se sembraron en placas de 96 pocillos y se transfectaron con MultiFectam (Promega) usando el vector de expresión Reportero PMIR-INFORME ™ luciferasa de luciérnaga que contiene los genes miARN luciferasa bajo el control de un sistema promotor /terminador de mamífero. Una región de clonación de los genes miARN objetivo fue incluido corriente abajo de la secuencia de traducción de la luciferasa o el vector vacío (Invitrogen), y el control de imitar o imitar miR-30e * (Invitrogen). Reportero ensayos se realizaron 48 h después de la transfección con los (Applied Biosystems) Sistema Luc-Screen® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
análisis de transferencia de Western
Las células cultivadas recogidas de placas de 6 pocillos se lavaron una vez en PBS y se lisaron en tampón de radioinmunoprecipitación complementado con cóctel inhibidor de proteasa /fosfatasa (Thermo Scientific , Tokio, Japón). Las muestras de proteína se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, y la membrana se incubó con anticuerpos primarios. Se detectaron señales de incubación con anticuerpos secundarios utilizando el Sistema de Detección ECL (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido).
Pacientes y muestras de tejidos
tejidos de carcinoma primarios gastrointestinales y su epitelio gastrointestinal normal adyacente emparejado fueron obtenidos de 83 pacientes con cáncer gástrico y 49 pacientes con cáncer de colon que fueron sometidos a resección del cáncer gastrointestinal sin tratamiento preoperatorio en el Departamento de Cirugía de Gastroenterología, hospital de la Universidad de Kumamoto, de 2005 a 2008. Firmado el consentimiento para participar se obtuvo de todos los pacientes informados. Este estudio fue aprobado por el comité de ética médica de la Universidad de Kumamoto.
El análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los datos mostrados son representativos de los resultados observados constantemente. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD). pruebas de Chi-cuadrado se utilizaron para evaluar las diferencias en la proporción entre la expresión y la expresión Bmi1 CD68 /CD163. de Student independiente
t
-pruebas se utilizaron para comparar las variables continuas entre los dos grupos, y se utilizó el procedimiento de Tukey-HSD para comparar las variables continuas entre los tres grupos. Para el análisis estadístico, se utilizó el JMP (versión 9, SAS Institute) y los programas de software SAS (versión 9.1, SAS Institute). Un valor de p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
La expresión de Bmi1 se correlaciona con los niveles de TAM en tejidos de cáncer gastrointestinal
TAM contribuyen al crecimiento tumoral, invasión y metástasis en muchos tipos de cáncer mediante la producción de diversos mediadores [13-17]. Para determinar si la expresión de Bmi1 en células de cáncer se correlaciona con los niveles de TAM, se analizó la expresión Bmi1, CD68, CD163 y en tejidos de cáncer gastrointestinal usando IHC. CD68 tinción se utilizó para detectar pan-macrófagos, y la población M2 se evaluó usando CD163, tal como se describe anteriormente [22]. Los resultados mostraron una relación positiva con la expresión Bmi1 y CD68 /CD163 en el cáncer gástrico (Figura 1 A, C) y en el cáncer de colon (Figura 1 B, C). Estos resultados sugieren que los macrófagos en el estroma del tumor pueden estar involucrados en la expresión en células de cáncer Bmi1 gastrointestinales.
(A) La inmunohistoquímica de la expresión Bmi1, CD68, y CD163 en 83 tejidos de cáncer gástrico. Las barras de escala, 100um. (B) El porcentaje de CD68 /163 especímenes positivos en alta Bmi1 que expresan el cáncer gástrico. Hubo una correlación significativa entre la expresión de CD68 y Bmi1 /163 expresión (*
P Hotel & lt; 0,05, ***
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente). (C) La inmunohistoquímica de Bmi1, CD68, y la expresión de CD163 en 49 tejidos de cáncer de colon. Las barras de escala, 100um. (D) El porcentaje de CD68 /163 especímenes positivos en alta Bmi1 que expresan el cáncer de colon. Hubo una correlación significativa entre estos dos grupos (**
P Hotel & lt; 0,01, **
P Hotel & lt; 0,01, respectivamente).
expresión Bmi1 se aumentó en las líneas celulares de cáncer gastrointestinal co-cultivadas con M1-M2-polarizadas o macrófagos THP-1, lo que lleva a la capacidad adquirida de formación de esferas en 3D cultura y
a continuación realizó un
in vitro
ensayo de co-cultivo con M1- o polarizadas-M2 macrófagos THP-1 para examinar si los macrófagos afectan expresión Bmi1 en las células cancerosas y las funciones celulares de cáncer. Como se indica anteriormente, THP-1 células se diferenciaron en macrófagos polarizadas-M2 M1- o por tratamiento distinto citoquinas (Figura 2A) [23]. QRT-PCR análisis reveló que la expresión Bmi1 fue significativamente mayor en AGS y células HCT116 co-cultivadas con tanto M1-M2 y polarizados-macrófagos THP-1 (Figura 2 B, C). Bmi1 está implicada en la capacidad de auto-renovación a través de la represión del locus INK4a-ARF, por tanto, la hipótesis de que las células gastrointestinales co-cultivadas con TAM pueden poseer la capacidad de auto-renovación a través de la regulación positiva de la expresión Bmi1. Para investigar el fenotipo de las células gastrointestinales co-cultivadas con TAM, se realizó una cultura esfera 3D crecido en la cultura no adherente libre de suero en las células gastrointestinales co-cultivadas con M1-M2-polarizadas o macrófagos THP-1 (Figura 2 D, E ). La capacidad de formación de esferas de las células gastrointestinales co-cultivadas con TAM fue realzada (Figura 2F, G). Estos resultados sugieren que los TAM aumentó la expresión de Bmi1 y la formación de la esfera mejorada.
(A) La producción de citoquinas perfil de M1-M2-polarizados y macrófagos THP-1. (B) análisis de QRT-PCR de la expresión en células AGS Bmi1 co-cultivadas con M1- y polarizado-M2 macrófagos THP-1, en comparación con la expresión en células AGS Bmi1 sólo como un grupo de control. Es significativo que se ha detectado una mayor expresión Bmi1 en grupos co-cultivadas en comparación con el grupo control (***
P Hotel & lt; 0,001, ***
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente). análisis (C) QRT-PCR de la expresión Bmi1 en las células HCT116 co-cultivadas con M1- y polarizado-M2 macrófagos THP-1, en comparación con la expresión en células HCT116 Bmi1 sólo como un grupo de control. Es significativo que se ha detectado una mayor expresión Bmi1 en grupos co-cultivadas en comparación con el grupo control (***
P Hotel & lt; 0,001, ***
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente). (D) Imágenes microscópicas de la esfera 3D células AGS cultivadas co-cultivadas con los macrófagos, en comparación con la esfera 3D células AGS cultivadas solamente como un grupo de control. Las barras de escala, 100um. (E) imágenes microscópicas de células HCT116 cultivadas esfera 3D co-cultivadas con los macrófagos, en comparación con las células HCT116 cultivadas esfera 3D solamente como un grupo de control. Las barras de escala, 100um. se detectaron (F) números esfera significativamente mayor en los grupos co-cultivadas en comparación con el grupo control en células AGS (*
P
& lt; 0,05, *
P
& lt; 0,05, respectivamente). se detectaron (G) números esfera significativamente mayor en los grupos co-cultivadas en comparación con el grupo de control en las células HCT116 (*
P
& lt; 0,05, **
P
& lt; 0,01, respectivamente) .
identificación de miRNAs que regulan la expresión de los genes miARN Bmi1 usando detección por cáncer en células de cáncer gástrico
Varios miRNAs están implicados en la regulación de las actividades de las células madre del cáncer, incluyendo la auto-renovación y tumorigenicidad [19,20]. Por lo tanto, hemos probado la hipótesis de que la regulación de la expresión Bmi1 en células de cáncer gastrointestinal puede estar mediada por miRNAs utilizando el análisis de microarrays miARN. Se seleccionaron los diez mejores miRNAs más regulación a la baja en las células gastrointestinales co-cultivadas con M1-M2-polarizadas o macrófagos THP-1 en comparación con las células gastrointestinales solos (Tabla 1A, B). Utilizando varias bases de datos en línea (Miranda, Diana, TargetScan, TargetMiner, miRBase), miR-30e-3p (miR-30e *) fue el único candidato miARN entre todos los miRNAs identificados encontró que dirigirse directamente a la Bmi1 3 'UTR. Por lo tanto, nos centramos en el miR-30e * para su posterior análisis.
Un
B
cambio miRNAfold (M1 versus control) el cambio miRNAfold (M2 vs control)hsa-miR-36820.006816627hsa-miR-36820.005809477hsa-miR-30e-3p0.011009754hsa-miR-373-3p0.015210649hsa-miR-3350.013768308hsa-miR-192-3p0.015870558hsa-miR-335-3p0.016194038hsv1-miR-H6-3p0.016751566hsa-miR-373-3p0.017847616hsa-miR-1225-3p0.017139628hsa-miR-192-3p0.01862193hsa-miR-36760.017353492hsa-miR-296-5p0.019188985hsa-miR-7660.032502682hsa-miR-1225-3p0.020111009hsa-miR-335-3p0.324230407hsa-miR-7660.038137453hsa-miR-769-5p0.445738351hsa-miR-769-5p0.434152471hsa-miR-30e-3p0.54343376Table 1. Análisis de microarrays de 1360 miRNAs en líneas de células AGS co-cultivadas con macrófagos THP-1.
(A) Los diez mejores miRNAs downregulated en líneas de células AGS co-cultivadas con macrófagos polarizadas-M1 en comparación con los controles. (B) los diez mejores miRNAs downregulated en líneas de células AGS co-cultivadas con macrófagos polarizadas-M2 en comparación con los controles. Csv Descargar CSV
miR-30e * suprime la expresión Bmi1 en las células gastrointestinales y se dirige directamente a la Bmi1 3 'UTR
Para revelar la relevancia funcional de miR-30e * expresión, hemos examinado la expresión Bmi1 en las 6 líneas celulares de cáncer gastrointestinal a través de Western Blot (Figura 3A), y analizado la relación entre la expresión Bmi1 miR-30e * y de gran cáncer que expresa Bmi1 líneas celulares de cáncer de líneas celulares que expresan (AGS y HCT116) transfectadas con el miR-30e * imita, y baja Bmi1 (NUGC4 y COLO201) transfectadas con el miR-30e * inhibidores. Western blot reveló redujo significativamente los niveles de proteína Bmi1 en AGS y células HCT116 transfectadas con miR-30e * imita en comparación con los controles (Figura 3 B, C), y el aumento de los niveles en las células NUGC4 y COLO201 transfectadas con miR-30e * inhibidores comparación con los controles (Figura 3 D, e). Además, para investigar el fenotipo de las células cancerosas transfectadas con miR-30e * imita, se realizó una cultura esfera 3D crecido en la cultura no adherente libre de suero en las células AGS transfectadas con miR-30e * imita (Figura 4A). La capacidad de formación de esferas de células AGS transfectadas con miR-30e * imita fue inhibida (Figura 4B), por lo que confirmó que la regulación a la baja de miR-30e * provocó un aumento de formación de esferas.
(A) Western blot Bmi1 de expresión en 6 líneas celulares de cáncer gastrointestinal. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión Bmi1 en líneas celulares que expresan altos Bmi1-AGS transfectadas con el control negativo (CN) y miR-30e * imita. (C) Análisis de transferencia Western de la expresión Bmi1 en líneas de alta Bmi1 que expresan HCT116 células transfectadas con NC y miR-30e * imita. (D) Análisis de transferencia Western de la expresión Bmi1 en líneas celulares que expresan NUGC4 Bmi1 bajas transfectadas con NC y miR-30e * inhibidores. (E) Análisis de transferencia Western de la expresión Bmi1 en Bmi1 que expresan las líneas celulares de baja COLO201 transfectadas con NC y miR-30e * inhibidores.
(A) esfera 3D cultivo desarrollado en suero libre no adherente cultivo con células AGS co-cultivadas con macrófagos y transfectadas con imitador miR-30e *, en comparación con la cultura esfera 3D con células AGS co-cultivadas con macrófagos y transfectadas con imitador NC como grupo de control. Las barras de escala, 100um. se detectaron (B) números significativamente baja esfera en imitador miR-30e * grupos transfectadas en comparación con el grupo control (* P & lt; 0,05, * P & lt; 0,05, respectivamente). (C) El putativo miR-30e sitio * diana o una secuencia mutada de la 3 'UTR de Bmi1 se clonó inmediatamente aguas abajo del gen de la luciferasa. (D) La actividad de luciferasa de las células AGS co-transfectadas con plásmidos que contienen la secuencia de miR-30e * objetivo de tipo salvaje en el 3 'UTR de Bmi1 o plásmidos de control junto con el mRNA imitador NC y mímica miR-30e *. (E) La actividad de luciferasa de las células AGS co-transfectadas con plásmidos que contienen el de tipo salvaje o la secuencia * objetivo miR-30e mutante en el 3 'UTR de Bmi1 junto con el mRNA imitador NC y mímica miR-30e *.
Análisis de la Bmi1 3 'UTR utilizando la base de datos en línea de Miranda reveló una secuencia objetivo previsto para el miR-30e *. A continuación se investigó si miR-30e * se dirige directamente a la 3 'UTR de Bmi1 utilizando constructos que contienen el miR-30e sitio * putativo objetivo o una secuencia mutada de la 3' UTR de Bmi1 clonado inmediatamente aguas abajo de un gen de la luciferasa. El LUC-Bmi1 construcción que contiene la secuencia objetivo * miR-30e predicho en el Bmi1 3 'UTR se muestra en la Figura 4C, con secuencias de semillas indicadas por líneas. La transfección de células AGS con el miR-30e * imitador suprimió significativamente la actividad de luciferasa a partir del vector informador que contiene el tipo salvaje Bmi1 3 'UTR (LUC-Bmi1-WT) en comparación con el vector control (Figura 4D). También se construyeron vectores informadores que contenían el mutante Bmi1 3 'UTR (LUC-Bmi1-MT). La transfección con el miR-30e * imitador no suprimió la actividad de luciferasa a partir del vector informador que contiene la mutado 3 'UTR de Bmi1 en comparación con la de tipo salvaje 3' UTR del vector (Figura 4E). Estos resultados indican que el miR-30e * regula la expresión Bmi1 atacando directamente a su extremo 3 'UTR.
Bmi1 expresión se correlaciona inversamente con el miR-30e * expresión en pacientes con cáncer gástrico
A continuación analizaron los niveles de miR-30e * expresión en tejidos de cáncer y sus epitelios normales adyacentes emparejados utilizando QRT-PCR. La expresión de miR-30e * fue significativamente menor en los tejidos de cáncer en comparación con sus epitelios emparejado normal adyacente tanto en el cáncer gástrico (Figura 5A) y el cáncer de colon (Figura 5C). Además, se comparó el miR-30e * Los niveles de expresión entre alta y baja Bmi1 que expresan los tejidos de cáncer. Se detectaron altos niveles de expresión Bmi1 en el 45% (24/53) de las muestras de cáncer gástrico y el 54% (20/37) de las muestras de cáncer de colon. Bmi1 expresión se correlaciona inversamente con la expresión de miR-30e * en el cáncer gástrico (Figura 5B). Sin embargo, la expresión Bmi1 no se asoció con la expresión de miR-30e * en el cáncer de colon (Figura 5D). Estos datos mostraron que la expresión Bmi1 estaba fuertemente correlacionado con el miR-30e * expresión en pacientes con cáncer gástrico, pero no en pacientes con cáncer de colon
.
(A) los niveles de miR-30e * expresión en 16 tejidos de cáncer gástrico y su emparejados epitelio gástrico normal adyacente como se evaluó mediante qRT-PCR. (B) Los niveles de miR-30e * expresión en 29 de alto y 24 de baja Bmi1-expresando tejidos de cáncer gástrico según la evaluación de QRT-PCR. (C) Los niveles de miR-30e * expresión en 37 tejidos de cáncer de colon y su epitelio de colon normal adyacente emparejado según la evaluación de QRT-PCR. (D) Los niveles de miR-30e * expresión en 20 de alto y 17 de baja Bmi1-expresando tejidos de cáncer de colon como se evaluó mediante qRT-PCR.
macrófagos M1-M2-polarizados y purificada a partir de monocitos humanos inducida regulación a la baja de miR-30e * y la regulación positiva de Bmi1
Nuestros resultados anteriores demostraron que la expresión Bmi1 fue significativamente mayor en AGS y células HCT116 co-cultivadas con tanto polarizadas-M2 macrófagos THP-1 y M1-. Nos co-cultivadas AGS próximos y células HCT116 con M1- y macrófagos polarizadas-M2 purificados a partir de monocitos humanos. expresión Bmi1 fue significativamente mayor en las células AGS co-cultivadas con tanto M1- y macrófagos polarizadas-M2 purificó a partir de monocitos humanos, y miR-30e * expresión fue significativamente menor en las células AGS co-cultivadas con ambos macrófagos (Figura 6A, C). En contraste, la expresión Bmi1 fue significativamente mayor en las células HCT116 co-cultivadas con macrófagos polarizadas-M1, pero no en las células HCT116 co-cultivadas con macrófagos polarizadas-M2. La expresión de miR-30e * fue significativamente menor en las células HCT116 co-cultivadas con ambos macrófagos (Figura 6B, D). Este resultado demostró que M1- y macrófagos polarizadas-M2 purificaron a partir de monocitos humanos regulación a la baja de miR-30e * inducidas en líneas de células gastrointestinales, y la regulación positiva de Bmi1 en línea celular de cáncer gástrico, pero no en la línea celular de cáncer de colon.
(a) QRT-PCR análisis de miR-30e * expresión en células AGS co-cultivadas con macrófagos M2-M1-polarizados y. Significativamente más baja se detectó la expresión de miR-* 30e en grupos co-cultivadas en comparación con el grupo control (***
P Hotel & lt; 0,001, *
P Hotel & lt; 0,05, respectivamente). (B) QRT-PCR análisis de miR-30e * expresión en células HCT116 co-cultivadas con M1- y macrófagos polarizadas-M2. Significativamente más baja se detectó la expresión de miR-* 30e en grupos co-cultivadas en comparación con el grupo control (***
P Hotel & lt; 0,001, **
P Hotel & lt; 0,01, respectivamente). (C) QRT-PCR análisis de la expresión en células AGS Bmi1 co-cultivadas con M1- y macrófagos polarizadas-M2. Es significativo que se ha detectado una mayor expresión Bmi1 en grupos co-cultivadas en comparación con el grupo control (***
P Hotel & lt; 0,001, **
P Hotel & lt; 0,01, respectivamente). (D) QRT-PCR análisis de miR-30e * expresión en células HCT116 co-cultivadas con M1- y macrófagos polarizadas-M2. Significativamente se detectó una expresión más alta Bmi1 en grupos co-cultivadas macrófagos M1 en comparación con el grupo control (**
P
& lt; 0,01). (E) Representación esquemática de miR-30e * -Bmi1 la señalización mediada por TAM.
Discusión
En este estudio, se demostró que los TAM aumentó la expresión de Bmi1, lo que aumenta la capacidad de formación de esferas. Bmi1 expresión fue suprimida por el miR-30e * a través de miR-30e * unión directa a Bmi1 3 'UTR, y la expresión Bmi1 se correlacionó inversamente con la expresión de miR-30e * en tejidos de cáncer.