Extracto
Antecedentes
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) tiene un pronóstico sombrío . El alto riesgo de recurrencia después de la resección quirúrgica proporciona la base para la terapia adyuvante. Sin embargo, sólo un subconjunto de pacientes se benefician de la terapia adyuvante. Por lo tanto, se justifica la identificación de marcadores moleculares para predecir el resultado del tratamiento. El objetivo del presente estudio fue evaluar si la expresión de nuevos biomarcadores candidatos, incluidos los microRNAs, puede predecir el resultado clínico en pacientes PDAC tratados con terapia adyuvante.
Metodología /Principales conclusiones
fijado en formol parafina incrustados especímenes de una cohorte de 82 casos resecados PDAC coreanos se analizaron para la expresión de proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica para la expresión de microARN y cuantitativa utilizando PCR en tiempo real. Riesgos proporcionales de Cox análisis del modelo en el subgrupo de pacientes tratados con terapia adyuvante (N = 52) mostró que más baja que la mediana de miR-21 expresión se asoció con una proporción significativamente menor de riesgo (HR) para la muerte (HR = 0,316; IC del 95% = 0,166 a 0,600; p = 0,0004) y la recurrencia (HR = 0,521; IC del 95% = ,280-,967; P = 0,04). estado de expresión de miR-21 surgió como el biomarcador predictivo más sencillo para los resultados del tratamiento entre los 27 y 9 biológica clinicopathological factores evaluados. No se encontró asociación significativa se detectó en los pacientes no tratados con terapia adyuvante. En una cohorte de validación independiente de 45 tejidos congelados PDAC de casos italianos, todos ellos tratados con terapia adyuvante, por debajo de la mediana de expresión de miR-21 se confirmó que se correlaciona con una mayor supervivencia global, así como libre de la enfermedad. Por otra parte, la transfección con anti-miR-21 aumentó la quimiosensibilidad de las células PDAC.
Conclusiones Importancia
Bajo la expresión de miR-21 se asocia con un beneficio del tratamiento adyuvante en dos cohortes independientes de los casos PDAC, y anti-miR-21 aumentó la actividad de medicamento contra el cáncer
in vitro
. Estos datos proporcionan evidencia de que el miR-21 puede permitir la estratificación para la terapia adyuvante, y representa una nueva diana potencial para la terapia en PDAC
Visto:. Hwang JH, Voortman J, E Giovannetti, Steinberg SM, LG Leon, Kim YT, et al. (2010) Identificación de microARN-21 como un biomarcador para quimiorresistencia y el resultado clínico tras la terapia adyuvante en el cáncer pancreático resecable. PLoS ONE 5 (5): e10630. doi: 10.1371 /journal.pone.0010630
Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemania |
Recibido: 23 Enero, 2010; Aceptado: April 20, 2010; Publicado: 14 May, 2010
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito
Financiación:. En parte financiado por los Institutos nacionales de Salud, programa intramuros del Instituto Nacional del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer y en las últimas décadas poca mejoría en la supervivencia se ha observado pesar de los grandes esfuerzos de investigación [1]. Alrededor del 95% de los cánceres de páncreas exocrino son adenocarcinomas ductales pancreáticas (PDAC), de los cuales la incidencia ha aumentado de forma constante durante las últimas décadas [1], [2]. La cirugía es factible en el 15-20% de los pacientes, pero, incluso después de la resección completa, el pronóstico sigue siendo pésimo, con una tasa de supervivencia a 5 años quedando al 10-20% [3].
El cáncer de páncreas es notablemente resistente a quimioterapia y radioterapia. El tratamiento adyuvante es moderadamente eficaz y puede tener efectos tóxicos sustanciales. Por lo tanto, el papel de la terapia adyuvante en el cáncer de páncreas resecable aún no está clara, aunque por lo general pensado para beneficiar a un subgrupo de pacientes [4], [5]. Ser capaz de identificar este subgrupo sería un gran avance en el tratamiento de esta enfermedad, ya que permitiría estratificación de los pacientes para el tratamiento adyuvante [6]. Por lo tanto, se necesitan con urgencia marcadores predictivos de sensibilidad a la terapia adyuvante, así como nuevas dianas terapéuticas en esta enfermedad [7], [8].
expresión alterada de varios factores ha sido asociada con el comportamiento agresivo PDAC y pronóstico. Por ejemplo, entre todos los tipos de cáncer, PDAC tiene la mayor frecuencia de
K-Ras
mutaciones, lo que ha llevado a la especulación en cuanto a su aplicación como un diagnóstico, así como un marcador pronóstico [7]. El producto de proteína de
K-Ras
es una proteína de unión a GTP mediación de un número de funciones celulares críticas, incluyendo la proliferación, la supervivencia celular y la motilidad. Sin embargo, la mayoría de las pruebas, hasta el momento, sugiere que
K-ras
mutaciones no están asociados significativamente con la supervivencia en pacientes con cáncer de páncreas [9], [10]. Otros estudios sugirieron la importancia pronóstica de la expresión alterada de las proteínas implicadas en la vía de señalización Ras, tales como Akt. Sin embargo, los niveles de expresión de Akt fosforilada se asociaron con la supervivencia más corta y más larga en pacientes PDAC resecables [11], [12]. Otros marcadores reportados como predictores independientes de PDAC pronóstico incluyen p16, la metaloproteinasa de matriz 7 (MMP-7) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) expresión [13]. Sin embargo, muchos aspectos biológicos que rigen esta enfermedad son aún poco conocidos y ningún marcador único se ha demostrado predecir con exactitud el resultado clínico
.
En los últimos años, se ha hecho evidente que la expresión de la proteína también puede ser regulado por los microARN (miRNA ) [14]. Los microARN son una clase de pequeños ARN no codificantes que interactúan con los mRNAs de codificación de genes para dirigir su represión posttranscriptional [15]. MicroARN han demostrado estar involucrados en el crecimiento y la oncogénesis del tumor, y también para jugar un papel importante en la quimiorresistencia [16] - [19]
Además, la expresión de microRNAs es específica de tejido, y ciertos histotypes cáncer. se pueden clasificar en base a los perfiles de expresión de microARN [20], [21]. En el cáncer de páncreas, se han reportado varios miRNAs que se expresa de manera aberrante, incluyendo microRNAs con un papel clave en el cáncer, tales como "onco -miRs (génica)", miR-21 y miR-155, y "MIR supresores de tumores", miR 29b y miR-34 y let-7 familias [22] - [29]. Los estudios preclínicos en células PDAC mostraron que exógeno miR-34 sobreexpresión se asocia con la reconstitución de la función supresora de tumores dependiente de p53 en las células deficientes en p53, así como la inhibición de cáncer de células madre de auto-renovación de páncreas [30]. Sobre regulación de let-7 se asocia con la reversión de transición epitelial a mesenquimal (EMT) en las células resistentes a gemcitabina [31]. El microARN-29b puede apuntar de novo de ADN metiltransferasa 3A y 3B (DNMT3A y DNMT3B) y conducir a la hipometilación global y la sobreexpresión de diversos genes supresores de tumores, incluyendo p16 [32]. la expresión de microARN-21 se asocia con aumento de la proliferación, propiedades invasivas y quimio-resistencia gemcitabina y un estudio previo mostró que la alta miR-21 expresión, tal como se determina mediante hibridación in situ, predijo una supervivencia más corta en pacientes con ganglios negativos PDAC [28], [33]. MicroARN-155 está implicado en la represión de
proteína tumoral 53 inducida por la proteína nuclear 1
, que es un gen diana de p53 inducida por estrés proapoptótico y un efecto pronóstico negativo de la alta expresión de miR-155 se observó en una cohorte de los casos PDAC incluyendo pacientes con enfermedad avanzada y /o local R2-resección [34], [35].
el objetivo del presente estudio fue evaluar los posibles marcadores biológicos para predecir el resultado de la quimioterapia adyuvante. Por lo tanto, hemos realizado un análisis integrador de la expresión de miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155 y let-7a-2 en una cohorte de pacientes PDAC, con características patológicas y tratamiento conocidos . expresión Adicionalmente, hemos investigado, de 20 conocido potenciales marcadores de proteínas y objetivos para la terapia, que participan en la progresión del PDAC y el pronóstico (Ver Tabla S1 para obtener una descripción completa de los 27 biológica y 9 clinicopathological factores utilizados en el estudio) [6], [13 ]. Desde estado de la expresión de miR-21 surgió como el biomarcador predictivo más sencillo para el resultado del tratamiento de todos los factores evaluados en pacientes tratados con adyuvante, se llevó a cabo un análisis más detallado de miR-21 expresión en una segunda cohorte de 45 pacientes, todos ellos tratados con terapia adyuvante. Este conjunto independiente confirmó la asociación significativa de miR-21 Estado de la expresión tanto con la supervivencia y la supervivencia libre de enfermedad. Además, la asociación de baja expresión de miR-21 con beneficio del tratamiento adyuvante fue apoyada por
in vitro
datos que muestran el aumento de la quimiosensibilidad de las células PDAC después de la transfección con anti-miR-21.
métodos
participantes, centros de estudio, los detalles del tratamiento
Doscientos cuarenta y cinco pacientes sometidos a resección del cáncer pancreático con el diagnóstico definitivo de cáncer de páncreas se revisaron retrospectivamente el uso de registros médicos electrónicos durante el período 1999-2007 en Seúl National University hospital y el hospital de la Universidad Nacional de Seúl Bundang. Entre ellos, ochenta y dos pacientes habían resecado completamente (R0) adenocarcinoma de páncreas y fueron incluidos en el estudio. estadio tumoral patológico se determinó de acuerdo con el American Joint Committee on estadificación del cáncer Cáncer (AJCC), 6
ª edición [36]. Brevemente, en etapas T1-2 patológicos (pT1-2) participación tumor se limita al páncreas, el tamaño del tumor de ser menor o mayor que 2 cm para las etapas pT1 y pT2, respectivamente. Patológica T3 (pT3) tumores en estadio se extienden más allá del páncreas, sin la participación del tronco celíaco o la arteria mesentérica superior, mientras pT4 se caracterizan por la participación del tronco celíaco o la arteria mesentérica superior. En cuanto a la etapa ganglionar linfático, estadio ganglionar patológica 1 (pN1) indica metástasis ganglionares regionales. Finalmente, M1 indica la presencia de metástasis a distancia. estadios de la enfermedad I, IIA, IIB, III y IV indicará "pT1-2 pN0 M0", "pT3 N0 M0", "pT1-3 pN1 M0", "pT4 cualquier N M0" y "cualquier pT cualquier M1 pN", respectivamente . Los pacientes recibieron quimioterapia adyuvante, quimioterapia combinada (CCRT) o ambos (n = 52), o no recibieron tratamiento (n = 27). estado de tratamiento de tres pacientes era desconocido. La quimioterapia adyuvante y quimio-radioterapia consistían en combinaciones de gemcitabina o 5-fluorouracilo (5-FU). FFPE especímenes fueron revisados para el diagnóstico y el contenido del tumor en el Hospital de la Universidad Nacional de Seúl, así como en el Instituto Nacional del Cáncer, NIH, Bethesda, MD. La cohorte de validación se compone de 45 muestras congeladas de adenocarcinoma pancreático pacientes italianos consecutivos diagnosticados en el periodo 2001-2004 en el Centro Regional de Referencia para el Tratamiento de Enfermedades de páncreas, Hospital de la Universidad de Pisa, Pisa, Italia [37]. El tratamiento adyuvante consistió en el tratamiento de modalidad combinada basada en gemcitabina. Los detalles de los regímenes adyuvantes se enumeran en la Tabla S2.
Ética
aprobación y consentimiento del paciente estudio se obtuvo de las Juntas de Revisión Institucional locales de acuerdo con las regulaciones legales de los países participantes. Consentimiento informado, se obtuvo de pacientes coreanos que todavía estaban vivos en el momento del estudio a través del banco de tejidos humanos. El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro de Investigación Clínica Humana. En cuanto a los pacientes italianos, se obtuvo el consentimiento por escrito. El protocolo de estudio fue aprobado por la Universidad de Pisa Comité de Ética.
La inmunohistoquímica
La expresión de marcadores de proteínas y 20 objetivos para la terapia fueron estudiados mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC). Como se informó en la Tabla S1 se evaluaron los niveles de expresión de los siguientes marcadores: factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), la metaloproteinasa de matriz 2 (MMP2), metaloproteinasa de matriz 7 (MMP7), metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9), inhibidor tisular de metaloproteinasa-3 (TIMP3), epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR), la reparación por escisión del grupo transversal complementación 1 (ERCC1), quimiocinas (CXC motivo) del receptor 3 (CXCR3), quimiocinas (CXC motivo) del receptor 4 (CXCR4), anfirregulina, epiregulina, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), neuropilina, factor de crecimiento similar a la insulina 1 receptor beta (IGF-1R), Ron β, c-Met, fosforilada-c-Met (Pc-Met), la timidilato sintasa (TS), E -cadherin, y la ribonucleótido reductasa subunidad M1 (RRM1). microarrays de tejidos (TMA) secciones se construyeron utilizando biopsias de tejido de núcleo (2 mm de diámetro) obtenidos a partir de muestras de cáncer individuales incluidos en parafina coreanos pancreáticas. Las biopsias fueron incluidos en los nuevos bloques de parafina receptor utilizando un aparato de trépano (Superbiochips laboratorios, Seúl, República de Corea). Cada bloque de matriz de tejido que contiene hasta 50 núcleos y 2 bloques de matriz se prepararon durante el estudio.
TMA secciones se deparaffinized utilizando xileno, rehidratada en alcohol y se tiñeron con anticuerpos específicos que se enumeran en la Tabla S3. Para ERCC1, el H-puntuación indica intensidad de la tinción (0 a 3) multiplicado por un factor determinado por la proporción de células positivas: 0 si 0% de células positivas, 0,1 si 1-9%, 0,5% si 10-49, 1 si & gt; 50% de células positivas. Para todos los demás factores, la tinción positiva significa una intensidad de señal mayor o igual a 2 y más de 20% de células positivas.
expresión MicroARN
Se aisló ARN a partir de secciones FFPE utilizando el RecoverAll total nucleico kit de aislamiento de ácidos (Ambion, Austin, TX) y de las secciones de tejido congelado como se informó anteriormente [38]. ARN (10-100 ng) se utilizó para el análisis de la expresión de miR-21 (cohorte italiana) o miR-21, miR-29, miR-34a /b /c, let-7a-2, y miR-155 (cohorte de Corea ) por cuantitativos PCR en tiempo real (QRT-PCR) con ensayos TaqMan-microARN y los 7900 HT-Fast (Applied Biosystems PCR en tiempo real, Foster City, CA) usando pequeña U66 ARN nuclear o RNU43, como los controles de normalización endógenos para las muestras coreanos e italianos, respectivamente. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y los resultados que no cumplen se omitieron criterios de control de calidad metodológica. Cuantificación de la expresión microRNA relativa se realizó usando el método de Ct delta. La expresión se determina como alta cuando el nivel de expresión era igual o superior a la mediana de la cohorte y baja cuando estaba por debajo de la media de la cohorte.
Los estudios in vitro
Las líneas de células humanas PDAC BxPC3 , HPAF-II, HPAC, PANC-1 y PL45 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina (50 IU /ml) y estreptomicina (50 mg /ml) (Gibco, Gaithersburg, MD). Las células se mantuvieron a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% de CO
2 en 75 cm
2 frascos de cultivo de tejidos (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania) y cosechadas con tripsina-EDTA en su crecimiento exponencial fase. El ARN se extrajo utilizando un protocolo Trizol-cloroformo (Sigma, St. Louis, MO). los rendimientos y la integridad del ARN se verificaron mediante la medición de la densidad óptica a 260/280 nm con un espectrofotómetro Nanodrop®.
La expresión basal de miR-21 se evaluó mediante cuantitativa Tiempo Real--PCR, como se describe anteriormente para los tejidos PDAC . La cuantificación de la expresión de miR-21 se realizó mediante el método de Ct delta, la normalización de los datos de amplificación CT con RNU43. Relativos miR-21 niveles de expresión se expresaron en unidades arbitrarias (AU).
inhibición del crecimiento celular por 5-FU (0,1-1000 M), y gemcitabina (0,1-1000 nM) más irradiación (100 cGy), se determinó a partir de tres experimentos separados utilizando el SRB (sulforhodamina-B) de ensayo, y se expresó como el porcentaje del control (células tratadas con vehículo) absorbancia, corregido para la absorbancia, antes de la adición del fármaco, como se describe anteriormente [39]. Para la irradiación, las células que crecen exponencialmente se sembraron en placas de 100 mm de cultivo de tejidos (Costar), que se pueden conectar durante 24 horas, y se irradiaron usando un 6 MV de fotones acelerador lineal (General Electric, Buckinghamshire, UK). Después de la irradiación, las células fueron cosechadas y 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos y se dejaron crecer durante 48 h adicionales en un medio libre de drogas o tratados con gemcitabina, como se describe anteriormente [40]. La concentración inhibitoria del 50% (IC
50) del crecimiento celular para cada línea celular se determinó por no lineal de mínimos cuadrados ajuste de la curva de las curvas dosis-respuesta (GraphPad Prism versión 5, un software intuitivo para la Ciencia, San Diego, CA ). El efecto de miR-21 sobre el crecimiento celular y la quimiosensibilidad se evaluó mediante la transfección de las células con los oligonucleótidos antisentido (anti-miR-21) adquirido de Ambion Biosystems-Applied (Ensayo de identificación, AM10206), en 30 nM de concentración final. Las células se sembraron a 200.000 células /pocillo en 3 ml de RPMI con 10% de FBS y 1% de antibióticos. Después de 24 h las células fueron expuestas a 9 oligofectamine l (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) en medio libre de suero, se mezcló durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de 3 l de 6,25 M miR-21 precursor o inhibidor. Las células se incubaron también con los controles negativos miARN y marcado con FAM anti-mir (Ambion). Después de 24 horas el medio se eliminó de los pocillos y se reemplazó con RPMI con 10% de FBS, sin antibióticos. Luego, las células se recogieron por tripsinización y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, donde se les permitió crecer durante 48 h adicionales en un medio libre de drogas o tratados con 5-FU, como se describe anteriormente. pozos de control adicionales se utilizaron para la extracción de RNA, como se describió anteriormente, mientras que la eficiencia de la transfección con los controles anti-mir marcadas con FAM se evaluó con un microscopio de fluorescencia.
Métodos estadísticos
Las comparaciones de los parámetros dicotómicas se realizado entre dos grupos utilizando la prueba exacta de Fisher. Una versión generalizada de la prueba exacta de Fisher se utilizó para la comparación de la edad, el estadio del tumor y el grado de diferenciación cuando se divide en tres categorías [41]. La probabilidad de supervivencia global (SG) o la supervivencia (DFS) libre de enfermedad como una función del tiempo se determinó por el método de Kaplan-Meier, con un log-rank test se utiliza para determinar la significación estadística de la diferencia de las curvas de Kaplan-Meier [42], [43] Para los factores pronósticos análisis con una variable, los casos en que los pacientes fueron en última instancia agrupan en dos categorías, determinado después de una evaluación preliminar de cuatro categorías utilizando los cuartiles de la distribución del parámetro de agrupación, tuvieron el valor de p ajustado por multiplicando el valor de p no ajustado por tres. Esto explicaría la prueba implícita que dio lugar a la decisión de poner a los pacientes en las dos categorías con una diferencia más grande entre los grupos de pronóstico. Se realizó un riesgo proporcional de Cox análisis del modelo para determinar la asociación conjunta de factores que se encuentran inicialmente tener potencial asociación con el resultado de los análisis univariados (evaluación en este
modelo final
sólo aquellos parámetros con no ajustado p & lt; 0,10 desde un registro prueba -rank) [44]. Todos los valores de p son dos de cola, y excepto como se indica más arriba, se presentan sin ajuste para comparaciones múltiples.
Todos los
in vitro
en experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos dos veces. Los datos se expresaron como valores medios ± EE y se analizó mediante la prueba t de Student y /o la prueba de Mann-Whitney. La significación estadística se estableció en p & lt; 0,05
Resultados
Características de los pacientes
La Tabla 1 resume las características clínico-patológicas.. En los pacientes coreanos, la mediana de SG y SLE fueron 18,1 y 9,1 meses, respectivamente. En esta cohorte de SG fue significativamente mayor en los pacientes tratados con quimioterapia adyuvante y /o CCRT (n = 52): la mediana de supervivencia fue de 21,3 frente a 14,7 meses para los pacientes tratados versus no tratados con terapia adyuvante (n = 27); p = 0,017. Véase la figura S1 para los gráficos de Kaplan-Meier.
Resultados de análisis de la expresión
La expresión de miR-21, miR-34a, miR-155 y let-7a era detectable en los 82 casos , y la expresión de miR-29b, miR-34b, 34c y miR-81 en, 73 y 80 casos, respectivamente. De acuerdo con estudios anteriores que muestran que el miR-34b y la cuota de miR-34c el mismo promotor de la transcripción [45], se correlacionaron los valores de expresión de estos miRNAs (datos no mostrados). resultados de IHC estaban disponibles para neuropilina y MMP-9 en 80 casos, por anfirregulina, HGF, EGFR y TIMP3 en 79 casos, por Ron, CXCR-3, e-cadherina, RRM1, IGF-1R, TS, VEGF, MMP-2 y MMP-7 en 78 casos, de CXCR-4 en 77 casos, de c-Met y Pc-Met en 76 casos, de ERCC1 en 75 casos y para epirregulina en 73 casos.
Tal como se describe en el sección de métodos, para cada proteína marcamos la intensidad de la tinción y el porcentaje de células teñidas positivamente. En la figura S2, se muestran imágenes representativas de la tinción inmunohistoquímica para P-c-Met. La Tabla 2 resume los resultados de la tinción inmunohistoquímica para todas las proteínas estudiadas.
El análisis univariante
Se evaluaron un total de 36 variables clínico, microARN y proteínas por su asociación con el sistema operativo o la SSE en la cohorte de Corea. Basado en el análisis univariado, un conjunto de 10 parámetros y 12 fueron considerados para la evaluación de los modelos de Cox para OS y DFS, respectivamente (ver Tabla S4). Los parámetros seleccionados se ensayaron también de acuerdo a la condición de tratamiento adyuvante (Tabla S4). Además, para cualquier parámetro, la población se dividió en 4 grupos para la comparación: (1) parámetro negativo, no vs. tratamiento adyuvante (2) parámetro negativo, adyuvante vs. tratamiento (3) parámetro positivo, no vs. tratamiento adyuvante (4 ) parámetro positivo, el tratamiento adyuvante. Tabla S4 sólo las listas de combinaciones con un valor de p & lt asociado; 0,10. En particular, se demostró una fuerte interacción de miR-21 Estado de la expresión y el tratamiento adyuvante de estado para el sistema operativo y DFS. Bajo la expresión de miR-21 se asoció con el sistema operativo más largo y DFS en los pacientes tratados con adyuvante, con valores de p de 0,016 y 0,02, respectivamente, pero no en los pacientes no tratados con terapia adyuvante (valores de p de 0,49 y 0,93, respectivamente). Esta asociación diferencial entre el miR-21 y el tratamiento de estado fue apoyada por la comparación del subgrupo de baja miR-21, los pacientes tratados con adyuvante frente a los pacientes restantes. El grupo de pacientes con baja miR-21 que fueron tratados con el tratamiento adyuvante tuvo mediana de SG y DFS de 27,7 y 16,2 meses, respectivamente. pacientes restantes tuvieron la mediana de SG de 14,3 y DFS de 7,0 meses, con valores de p de 0,002 para el sistema operativo y 0,0095 para la DFS. Véase también la Figura 1 y la Figura S3.
La supervivencia global en función del estado de miR-21 en (A) no adyuvante pacientes tratados y tratados (B) adyuvantes pacientes. supervivencia libre de enfermedad según el estado de miR-21 en (C) no adyuvante En los pacientes tratados y (d) adyuvantes tratados los pacientes.
Cens .: censurados
.
parámetros que contienen
modelos de Cox para la supervivencia y la supervivencia libre de enfermedad
El uso de un algoritmo de selección hacia atrás, un modelo de Cox que se construyó se encontró que se asocia de forma conjunta con el sistema operativo. Un segundo modelo se identificó para la determinación pronóstica de DFS (Tablas 3 y 4). A partir del análisis multivariante entre todos los pacientes, como el parámetro que más se asocia de manera significativa tanto para SG y SLE, pacientes con baja miR-21 que fueron tratados con terapia adyuvante mostraron tener un cociente de riesgo significativamente menor (HR) para la muerte (0.443, 95% CI: 0,263 a 0,748; p-valor, 0.002) y para la recurrencia (0,358; IC del 95%: 0,188-0,682; p-valor: 0,002) en comparación con todos los demás pacientes. Por el contrario, en los pacientes no tratados con terapia adyuvante, inferior a la mediana de miR-21 expresión no se asoció con un HR significativamente diferente de la muerte o recurrencia de 0,880, p-valores de 0,76 y 0,30, respectivamente.
Comparación de covariables acuerdo con adyuvante tratados frente a no tratados los pacientes
Como los casos no fueron asignados al azar para recibir tratamiento en este estudio, quisimos determinar si había diferencias significativas en la distribución de covarianza entre los pacientes tratados y no tratados con terapia adyuvante (Tabla S5). La única diferencia significativa fue menor edad mediana en el grupo tratado con adyuvante a los 61 años (rango: 45-75 años) frente a 66 años (rango: 49-83 años) en el grupo no tratado (p-valor: 0,002, Wilcoxon de dos -ejemplo de prueba). Véase la Tabla S6 para la expresión diferencial de proteínas. Además, se construyó modelos de Cox separados para los pacientes tratados con la terapia adyuvante vs. pacientes no tratados con terapia adyuvante. En primer lugar, se realizó un análisis univariado en ambos grupos (Tablas S7 y S8). Análisis del modelo de Cox demuestra que sólo en el subgrupo de pacientes tratados con adyuvante de bajo estado de miR-21 se asoció con un HR significativamente menor de muerte y recurrencia (Tabla 5, Tabla 6, Tabla 7 y Tabla 8). En el subgrupo de no adyuvante pacientes tratados, la invasión angiolinfática positiva y la expresión de miR-34a encima de la mediana se asociaron con un aumento de la FC para la muerte y recurrencia, respectivamente, mientras que el miR-21 no tuvo un p-valor suficientemente bajo para su inclusión en el modelo final.
Comparación de covariables de acuerdo con la expresión de miR-21
Distribución de covariables clinicopatológicas y la IHC se comparó entre los bajos de miR-21 y altos miR-21 pacientes, como se informa en la Tabla 9 y en la Tabla S9. La mediana de edad en el grupo de miR-21 baja fue de 63 años (rango: 45-83 años), no significativamente diferente del grupo alto de miR-21, la mediana de edad de 64 años (rango: 46-78 años), p-valor: 0,94 . Sin embargo, hubo una tendencia hacia una etapa más avanzada de la AJCC (IIa vs IIb) en el grupo de alta expresión de miR-21 (valor de p: 0,07). Del mismo modo, hubo más casos con mala grado de diferenciación en el grupo alto de miR-21, aunque este grupo también contenía más casos con tumores bien diferenciados (Tabla 5). No pudimos confirmar una asociación ya se ha informado de miR-21 y la expresión TIMP3 [46], mientras que se encontró que Pc-Met y la expresión del VEGF fue significativamente más frecuente en el miR-21 casos altos (Tabla S9).
a medida que la expresión de miR-34a alta se demostró que se asocia con una disminución DFS hemos comparado, además, la distribución de las covariables clinicopatológicas e IHQ entre bajos de miR-34a y miR-34a pacientes de alto. Alta expresión de miR-34a está fuertemente asociada con una elevada expresión de fosfo-c-Met (p-valor: 1x10E-6). Además, la expresión de alto miR-34a se asoció con una baja expresión de HGF (valor de p: 0,01), así como la alta expresión de VEGF (valor de p: 0,01). Por último, una baja expresión de miR-21 se observó con mayor frecuencia en los casos de baja miR-34a. (P-valor: 3x10E-8) guía
alta expresión de miR-21 muestra la asociación con mayor tasa de recurrencia distante
a continuación, se comparó la tasa de recidiva a distancia vs. local de la enfermedad en el grupo de baja expresión vs. alta de miR-21. En el grupo de alta expresión de miR-21 25 de los 41 pacientes (61%) tenían enfermedad recurrente en un sitio distante que fue significativamente diferente del grupo de baja expresión de miR-21 en el que sólo 12 de 38 pacientes (32%; con 3 pacientes perdidos para el seguimiento) experimentan recurrencia a distancia (valor de p: 0,013). En comparación, en el grupo que recibió terapia adyuvante 25 de los 51 pacientes (49%) tenían enfermedad recurrente. Esto no fue significativamente diferente del grupo no tratado con la terapia adyuvante con 11 de los 26 pacientes (42%) experimentaron recurrencia a distancia (p-valor: 0,63; con 5/82 pacientes que faltan por falta de datos)
Aunque no es estadísticamente significativa, la alta expresión de miR-21 también mostró una tendencia hacia una mayor estadio y el estado de los ganglios linfáticos positivos (Tabla 5).
Validación cohorte
una serie de 45 pacientes con adenocarcinoma pancreático resecado , todos ellos tratados con gemcitabina adyuvante, se utilizó para validar el papel predictivo de miR-21 expresión en los caucásicos. La mediana de SG y SLE fueron de 20,4 y 18,7 meses, respectivamente. Véase la Tabla 1 para los parámetros clínico-patológicos (cohorte italiana). MiR-21 expresión fue detectable en todas las muestras. El análisis univariante mostró una tendencia a la asociación entre una mala diferenciación del tumor y el sistema operativo más corto (valor de p: 0,07), mientras que la aparición de la infiltración de los nervios se asoció con marginalmente significativamente más corto DFS (p-valor: 0,047), pero no OS (p- valor: 0,90), como se informa en la Tabla S10. Edad, sexo, estadio, los ganglios linfáticos y la infiltración vascular no se asociaron con el resultado. Los pacientes con alta expresión de miR-21, tuvieron una SG significativamente más corto, es decir, la mediana de 15,6 en comparación con 24,4 meses en los pacientes con miR-21 nivel de expresión inferior a la mediana (valor de p: 0,006). El DFS media de los pacientes con alta expresión de miR-21 fue 14,0 meses, en comparación con 23,8 meses en los pacientes con la baja expresión de miR-21 (valor de p: 0,0042). Vea la Figura 2 para las curvas de Kaplan-Meier. modelos de Cox se construyeron, que confirmó la asociación del estado de la expresión de miR-21 y duración de la supervivencia, con alta expresión de miR-21, ya que el único factor restante, asociado con un aumento del CRI de muerte en CI 3.538 (95%: 1,415-8,849; p -valor: 0,007) y la recurrencia a 4.008 IC (95%: 1,385 a 11,595; valor de p: 0,01). El análisis agrupado de los dos cohortes confirmado la importancia predictiva significativa de miR-21 Estado de expresión, como se informa en Figuras S4 y S5.
(A) La supervivencia global de acuerdo con el miR-21 Estado y (B) libre de la enfermedad estado de supervivencia en función del estado de miR-21.
Cens .: censurado
.
miR-21 y efectos antiproliferativos de 5-FU en células PDAC
La expresión de miR-21 fue detectable en todas las células PDAC líneas, que van desde 4,5 en las células PL45 a 1,5 au en las células BxPC-3 (Figura 3A). Se observó una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento celular después de tanto 5-FU y la gemcitabina más radioterapia tratamiento, como se muestra en la Figura 3B-C. En particular, 5-FU tratamiento resultó en una modesta inhibición del crecimiento celular en las células PANC-1 y PL45, con IC
50 años de 138,4 ± 23,4 micras y 174,2 ± 31,1 mu M, respectivamente. Entre las líneas celulares estudiadas, BxPC3 y HPAF-II fueron las más sensibles a la gemcitabina y 5-FU, respectivamente, mientras que PL45 fue el más resistente tanto al 5-FU y gemcitabina más radioterapia.
(A) MIR -21 expresión en 5 líneas celulares PDAC. La expresión se determinó mediante PCR cuantitativa, utilizando el método de Ct delta con la NUR-43 como referencia y los valores están en au. (B-C) Curvas representativas de los efectos inhibidores del crecimiento de 5-FU (B) y gemcitabina más radioterapia (C) , la exposición al fármaco 48 horas. (RE). Las células se sembraron a 10
4 /pocillo y se evaluaron los efectos anti-proliferativos usando el ensayo de SRB, como se describe en los métodos. El IC media
50 valores para 5-FU (48 h de exposición continua) fueron como sigue: 36,3 M (BxPC-3), 30,9 mM (HPAF-II), 138,4 M (PANC-1) y 174,2 micras (PL45 ); mientras que los valores de CI50 para gemcitabina (en las células pre-tratadas con 100 cGray) fueron 2,1 nM (BxPC-3), 3,4 nM (HPAF-II), 10,2 nM (PANC-1) y 11,4 nM (PL45).