Extracto
acetogeninas Annonaceous, una gran familia de policétidos naturales aisladas de diversas especies del género de plantas
Annonaceae
, se han encontrado que exhiben una citotoxicidad significativa contra una variedad de células cancerosas. Estudios anteriores demostraron que estos compuestos podrían actuar sobre las mitocondrias complejo-I y bloquear la cadena de transporte de electrones correspondiente y terminar la producción de ATP. Sin embargo, más detalles de los mecanismos de acción siguen siendo ambigua. En este estudio se evaluó el efecto de un conjunto de miméticos de acetogenin Annonaceous en algunas líneas celulares de cáncer, e informamos que entre ellos AA005 exhibe la actividad antitumoral más potente. AA005 agota ATP, activa la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) e inhibe complejo mTOR 1 vía de señalización (mTORC1), que conduce a la inhibición del crecimiento y la autofagia de células de cáncer de colon. inhibidores de la AMPK compuesto C y reprimir inosina, mientras que la AMPK activador AICAR mejora, supresión de la proliferación AA005-causado y posterior autofagia de las células de cáncer de colon. AA005 mejora la depleción de ATP y la activación de AMPK causada por 2-desoxiglucosa, un inhibidor de la respiración mitocondrial y la glucólisis. AA005 también inhibe agente quimioterapéutico cisplatino desencadenó-regulación de mTOR y sinergia con este fármaco en la supresión de la proliferación y la inducción de la apoptosis de células de cáncer de colon. Estos datos indican que AA005 es un nuevo inhibidor metabólico que presenta potencial terapéutico en el cáncer de colon
Visto:. Liu Y-Q, Cheng X, Guo L-X, Mao C, Chen Y-J, Liu H-X, et al. (2012) La identificación de un Annonaceous acetogenin mimético, AA005, como un activador de AMPK y la autofagia inductor en células de cáncer de colon. PLoS ONE 7 (10): e47049. doi: 10.1371 /journal.pone.0047049
Editor: Xiaolin Zi, Universidad de California Irvine, Estados Unidos de América
Recibido: 31 Enero, 2012; Aceptado: September 11, 2012; Publicado: 8 Octubre 2012
Copyright: © Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Programa Nacional clave de Investigación básica (2012CB910800, 2010CB833200 y 2009CB940900), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (N ° 81071930, 81171925, 20972160 y 21172220), la Fundación Especial del Presidente y el Proyecto clave del Programa de Innovación del conocimiento de la Academia china de Ciencias (KSCX1-YW-R-26 y KSCX2 YW-R-235) Programa, y el Mayor Nacional de la Ciencia y Tecnológico para el descubrimiento de medicamentos (2009ZX09103-101). No se recibió financiación externa adicional para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en las células tumorales hay un aumento de enzimas de la ruta glicolítica y transportadores de glucosa, incluso en presencia de un alto O
2 la concentración, en última instancia conduce a una tasa elevada producción de ATP [1]. La evidencia clínica ha vinculado el metabolismo celular con los resultados del cáncer, y el metabolismo energético reprogramación ha sido aprobado para ser un sello distintivo que emerge de cáncer [2]. Estas observaciones han aumentado el interés en la orientación de metabolismo de la energía para la terapia del cáncer para ambos hipóxica (glicólisis) y los tumores oxidativo [1], aunque también la preocupación de que estas terapias tendrían efectos indeseables sobre las células normales. Curiosamente, algunas de las primeras terapias contra el cáncer dirigidas a las necesidades metabólicas específicas de las células cancerosas siguen siendo eficaces en la clínica hoy, los esfuerzos de re-inspiración para orientar las dependencias metabólicas de las células del cáncer como una estrategia contra el cáncer selectiva [3].
AMP proteína quinasa activada (AMPK), que existe en las células como un complejo heterotrimeric compuesto de una subunidad catalítica de quinasa (α) y dos subunidades reguladoras (beta y gamma), es un sensor de estado de energía que mantiene la homeostasis de la energía celular. Se activa por una caída de ATP (concomitante con un aumento de ADP y AMP) o estímulos que aumentan la relación celular AMP /ATP, lo que resulta en la activación de las vías catabólicas y la inhibición de las vías anabólicas [4], [5]. Esencial para la activación de AMPK es su fosforilación en Thr-172 por un quinasas AMPK aguas arriba (AMPKKs) [6] y LKB1 supresor de tumores [7] que es una serina /treonina quinasa asociada con poliposis gastrointestinal y el cáncer [8] y el cáncer de pulmón [ ,,,0],9]. AMPK fosforila dos enzimas limitantes de la velocidad en los ácidos grasos y la síntesis de colesterol: acetil-CoA carboxilasa (ACC) y HMG-CoA reductasa, así como otros objetivos de abajo, que culminó en la inhibición de las vías anabólicas y la activación de las vías catabólicas [5] . la activación de AMPK limita directamente iniciación de la traducción y la síntesis de proteínas [10], a través de la inhibición del factor de elongación de traducción 2 (EF2) [11], e indirectamente a través TSC2, conduciendo a la supresión de la diana mamífera de rapamicina (mTOR) [12], que puede fosforilar y activar la quinasa p70 S6 y proteína de unión 4E-(4EBP) [13].
activación de AMPK por AMP análogo de ribonucleótido 5-aminoimidazol-4-carboxamida (AICAR) acumula dependientes de ciclina quinasa p21 y los inhibidores de p27 y regula a la baja ciclina D1 en células de carcinoma hepatocelular humano, lo que lleva a la detención del ciclo celular en la fase G1 [14]. Los estudios de población proporcionan indicios de que el uso de la metformina que es un activador de AMPK, puede estar asociada con una menor incidencia y pronóstico de ciertos tipos de cáncer [15], [16] mejoró. En el cáncer de mama, la metformina ejerce efectos inhibidores a través de la inhibición de la iniciación de la traducción dependiente de mTOR [17], [18]. La metformina inhibe la proliferación, disminuye el ciclo celular y la viabilidad celular bloques en fase G1 en células de cáncer de próstata, y en el tratamiento in vivo con metformina conduce a una reducción significativa del crecimiento tumoral en ratones portadores de xenoinjertos de células de cáncer de próstata [19]. La metformina y AICAR inducen apoptosis y suprime el crecimiento de tumores de p53 cáncer de colon HCT116 línea (- /-) xenoinjertos, y desencadenan la autofagia de las células [20] p53 HCT116 (+ /+). AICAR y el plegamiento de proteínas inhibidor de 17-AAG, especialmente cuando se combinan, muestran eficacia contra líneas celulares de cáncer humano aneuploides [21]. Estos resultados indican que la AMPK podría ser un objetivo racional de los medicamentos y compuestos de plomo deben ser identificados o diseñados para el desarrollo de vías terapéuticas para el cáncer.
acetogeninas Annonaceous representan una clase de policétidos naturales aisladas de diversas especies de la planta género
Annonaceae
[22]. Estos compuestos presentan diversas actividades biológicas, incluyendo cytotoxicites prometedores y actividades antiparasitarias [23]. Aunque los estudios muestran que las acetogeninas annonaceous pueden alterar la función mitocondrial a través del bloqueo mitocondrias complejo I y ubiquinona ligada NADH oxidasa [23], y enlazar el tercer bucle del lado de la matriz de ND1 subunidad de mitocondrial NADH-ubiquinona oxidorreductasa [23], [24], los mecanismos de acción de estos compuestos en la lucha contra el cáncer siguen siendo en gran parte desconocido. El grupo de química de nuestro equipo había diseñado y sintetizado una serie de compuestos miméticos acetogenin annonaceous [25] - [28]. En este trabajo se evaluó la actividad biológica de algunos nuevos análogos y se investigaron los mecanismos subyacentes citotoxicidad acetogeninas annonaceous ', y se informó de que un AA005 mimético que se mostró actividades inhibidoras potentes y selectivos contra una variedad de células cancerosas, fue capaz de activar AMPK e inducir celular la detención del ciclo seguido por autofagia, lo que demuestra su potencial terapéutico
Materiales y Métodos
Productos químicos y Reactivos
Annonaceous acetogenin miméticos (Tabla 1) se disolvieron en DMSO y se almacenaron a. - 20 ° C. El 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) se adquirió de Amresco Inc. (Solon, OH). Compuesto C, rapamicina, rotenona, inosina, Rodamina 123, 2-DG y AICAR se adquirieron de Sigma. MitoTracker color rojo oscuro de FM se adquirió de Invitrogen. ATP Assay Kit se adquirió de Beyotime Instituto de Biotecnología (Haimen, Jiangsu, China) guía empresas
Los anticuerpos
Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron los siguientes:. Anti-β-actina ( Sigma); anti-p-AMPKα1, anti-p-ACC, anti-p-mTOR, anti-p-S6K, anti-AMPKα1, anti-ACC, anti-mTOR, anti-S6K, anti-PARP, de cabra anti-conejo IgG HRP y de cabra anti-IgG de ratón-HRP de anticuerpos (Cell Signaling Technology); anti-CyclinD1 (Abcam), anti-CDK4 (Santa Cruz de Biotecnología), y anti-LC3 (Sigma).
Cultivo de células y transfección
El pulmón A549 línea celular de cáncer, células de cáncer de mama línea MCF-7, línea celular de cáncer cervical HeLa, líneas celulares de cáncer de colon LOVO, SW480, HCT116 y HT29, y las células HEK-293T de riñón embrionario humano se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection (ATCC). Humana de fibroblastos de pulmón embrionario MRC-5, línea celular de cáncer gástrico SGC7901, y la línea celular de cáncer hepático BEL7402 fueron adquiridos de la célula Centro de Recursos de la Academia China de Ciencias Médicas (Beijing). Las células normales humanas bronquiales epiteliales (HBEpiC) fueron adquiridos de Sciencell (Laboratorios de Investigación Sciencell, San Diego, California). El 293T, A549, BEL7402, HeLa, MCF-7, SGC7901 y las normales las células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B [29] las células se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS; Gibco /BRL , Grand Island, NY), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. LOVO, SW480, HCT116 células HT29 y se cultivaron en DMEM /F12 suplementado con 10% FBS, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Células MRC-5 se cultivaron en medio MEM /EBSS complementado con ácidos no esenciales aminoácidos, 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. células HBEpiC se cultivaron en un medio de células del epitelio bronquial libre de suero (Sciencell Research Laboratories) que contiene suplemento de crecimiento de células del epitelio bronquial (Laboratorios de Investigación Sciencell). Los pQCXIP-GFP-LC3 y pQCXIP-GFP plásmidos [30] se transfectaron en células LOVO utilizando el Lipofectamine 2000 (Qiagen) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante.
viabilidad celular, la proliferación celular y ensayos clonogénico
Las células de cáncer (5 × 10
3) se sembraron en cada pocillo de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Coaster, Charlotte, NC) y se trató con miméticos acetogenin annonaceous de 48 h a 37 ° C en una 5% de CO
2 atmósfera. ensayo de MTT se realizó tal como se describe [31], y la IC
50 valores se calcularon usando el software Calcusyn (versión 2.0, Biosoft, Cambridge, UK). La viabilidad celular se estimó por exclusión de tripan colorante azul. El potencial sinérgico, efecto aditivo o antagonista entre AA005 y 2-DG o cisplatino se evaluó cuidadosamente usando el Software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido) como se describe [32]. Las curvas de dosis-efecto de un tratamiento único o combinado de drogas fueron analizados por el método del efecto mediana [33], donde los índices de combinación (IC) menor que, igual a, y mayor que 1 indican, aditivos y efectos antagónicos sinérgicos, respectivamente .
Para la formación de focos, HT29, LOVO o HCT116 tratados con AA005 se sembraron por triplicado en placas de 35 mm (200 células por placa). Después de 8 días de cultivo, las células fueron teñidas con Giemsa y los clones que contienen más de 50 células se contaron [29].
Análisis del ciclo celular y apoptosis
Para detectar la distribución del ciclo celular, colon las células de cáncer se sincronizan con G1 /S frontera por un bloque de timidina doble [31] y luego expuesto a AA005 a las concentraciones indicadas durante 24 h. Se recogieron las células, se fijaron con etanol al 70% frío en 4 ° C durante la noche. Las células se centrifugaron y se lavaron con PBS, seguido de incubación con RNasa y yoduro de propidio (PI) (Sigma-Aldrich). la distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo (BD FACS Vantage diva, EE.UU.). apoptosis de las células se midió utilizando PE Anexina V /PI kit de detección de apoptosis (BD Biosciences, San Jose, CA) según las instrucciones del fabricante.
Análisis de células con GFP-LC3 vesículas
Las células se transfectaron con pQCX-IP-GFP-LC3 y pQCX-IP-GFP-expresión de plásmidos durante 24 h, y después se trataron con varias concentraciones de AA005 durante otras 24 h. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% /PBS durante 15 min a temperatura ambiente y se analizaron mediante microscopía confocal a 63 × magnificación. El porcentaje de células positivas para GFP vesículas se evaluó [30].
Medición de transmembrana mitocondrial, contenido de ATP y NAD Potencial
+ /NADH Relación
Las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de miméticos acetogenin annonaceous durante 24 h. El potencial transmembrana mitocondrial se examinó como se describe [34], se midió el contenido de ATP usando una bioluminiscencia Kit de ensayo ATP (Beyotime Instituto de Biotecnología), y la relación NAD
+ /NADH se midió utilizando Amplite ™ colorimétrico NAD /NADH Assay Kit ( AAT Bioquest, Inc., Sunnyvale, CA) según las instrucciones del fabricante.
los análisis de microscopía confocal
las células fueron cultivadas en cubreobjetos y se fijaron en paraformaldehído al 4%. Después de un breve lavado en PBS suplementado con glicina 100 mM, los portaobjetos se bloquearon con 5% de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma) y 0,3% de Triton X-100 en PBS durante 30 min a temperatura ambiente, y se tiñeron para la microscopía de fluorescencia como se describe [ ,,,0],31]. Las células sobre AA005-gripe se examinaron mediante el uso de un microscopio Zeiss LSM 510 META equipado con un objetivo de inmersión en aceite 63 ×. procesamiento y análisis de imágenes se realizaron con la versión de software Zeiss LSM 510 3.2, ImageJ versión 1.42 (Institutos Nacionales de Salud), y Adobe Photoshop Versión 7.0 (Adobe Systems).
Western Blot Las
Los sedimentos celulares se lisaron en tampón RIPA que contiene mM Tris-HCl 50 pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 1% de desoxicolato, 1% Triton X-100, EDTA 1 mM, NaF 5, vanadato de sodio 1 mM, e inhibidores de proteasa cóctel ( Sigma). Las células se lisaron en hielo durante 30 min en tampón RIPA, los lisados se centrifugaron, los extractos de proteína se cuantificaron y se cargan en 10% a 15% en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida, electroforesis, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Whatman). La membrana se incubó con el anticuerpo primario, se lavó, y se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpo secundario. La detección se realizó mediante el uso de un kit de quimioluminiscencia oeste de detección (Cell Signaling Technology) [35].
Análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces y los datos se presentan como la media ± SD a menos que se indique lo contrario. Se evaluaron las diferencias entre grupos de datos utilizando importancia para Estudiantes
t-test
de datos no apareados o análisis de varianza de una sola vía y de Bonferroni post-test.
P
valores & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
Estructura actividad Relación (SAR) Análisis de Annonaceous acetogenin miméticos
Una serie Annonaceous acetogenin miméticos. se había sintetizado mediante la sustitución de tanto tetrahidrofurano (THF) anillos de bullatacina natural con una sencilla unidad de éter de dietilenglicol por el grupo de la química de nuestro equipo de [25] - [28]. Nueve nuevos análogos se sintetizaron en este trabajo, y encontramos que el miméticos AA005 [25] y AA093, un compuesto con la introducción de un grupo 10-hidroxi en AA005, representan los dos compuestos que tenían los valores de IC50 más bajas en este entorno ( Tabla 1). La observación de que AA090 compuesto y AA091 que carecen de la unidad de lactona derecha e izquierda de la cola 11-carbono exhibió un 17 a & gt; 170 veces menor citotoxicidad en células de cáncer sugiere que estos grupos son esenciales para la citotoxicidad de AA005. AA101 con una unidad de lactona adicional incorporado en la parte izquierda cadena hidrocarbonada exhibió un 23 a 142 veces menor citotoxicidad en las células cancerosas, lo que confirma además la importancia de la cola hidrófoba larga y la lactona terminal derecho en el mimetismo. La adición de una unidad de éter centro hacia los miméticos (compuestos AA102-105) ligeramente mejoradas su actividad anti-proliferativa en comparación con AA101, lo que sugiere que una unidad de dietilenglicol es esencial para la actividad anti-proliferativa. La diversa actividad biológica de estos miméticos indica que los análogos estructurales no pueden ser análogos funcionales.
efectos inhibitorios de AA005 en las células cancerosas
Debido AA005 era el agente citotóxico más potente entre estos miméticos, se más probado sus efectos en 11 líneas celulares de cáncer humano y 4 líneas de células no cancerosas (HBEpiC, MRC5, HLF y 293T), y encontró que AA005 mostró diversos efectos sobre las células cancerosas en que tenía potente efecto inhibidor sobre el colon (HCT116, HT29, LOVO y SW480), gástrico (SGC7901), hepática (BEL7402), pulmón (A549) y de mama (MCF7) líneas de cáncer, y efecto débil en células de cáncer cervical (HeLa) (Figura 1A). AA005 exhibe efectos inhibidores sobre HCT116 (Figura 1B), HT29 (Figura 1C) y células LOVO (Figura 1D) en la dosis y de manera dependiente del tiempo. Curiosamente, AA005 mostró una actividad aún más débil contra células no cancerosas (HBEpiC, MRC5, HLF, BEAS-2B y 293T) (Figura 1A y Tabla 1). Estos resultados indican que los efectos inhibidores selectivos relativas de AA005 sobre las células cancerosas merecen una investigación adicional.
(A) IC
50 valores de AA005 (en 48 h) para diversos cáncer humano y líneas celulares no cancerosas. IC
50 valores (media ± DE, M) se calcula a partir de 3 experimentos independientes. (B a D) ensayos de MTT de HCT116 (B), HT29 (C) y LOVO (D) sobre células AA005 en los puntos de concentración y tiempo indicados.
AA005 suprime la proliferación celular y la formación de colonias de Actividad las células del cáncer de colon
Asimismo, analizaron los efectos de AA005 de las células de cáncer de colon. Mediante el uso de la exclusión de azul de tripano análisis, se demostró que el tratamiento con AA005 de 50 a 200 nM durante 24 a 48 h notablemente inhibió la proliferación de HT29, LOVO y HCT116, pero no HBEpiC o células BEAS-2B (Figura 2, A y B) . ensayo de formación de focos mostró potentes efectos inhibidores de AA005 en colonia actividad de las células de cáncer de colon (Figura 2C) de conformación. Se analizaron los efectos de AA005 en ciclo celular y se encontró que AA005 causó un aumento sustancial en el porcentaje de células de cáncer de colon en fase G1 en una manera dependiente de la dosis (Figura 2D).
(A, B) indicó las células fueron tratadas con o sin AA005 durante 48 h o puntos de tiempo indicados, y se analizaron mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. ensayo de formación de (C) de colonias para la actividad clonogénico de las células de cáncer de colon tratados con o sin AA005. (D) células de cáncer de colon se trataron con AA005 a las concentraciones indicadas durante 24 h. la distribución del ciclo celular se determinó por citometría de flujo.
Objetivos AA005 mitocondrias, elimina el ATP y activa AMPK en células de cáncer de colon
AA005 marcado con fluoresceína (AA005-gripe, Figura 3A) fue logrado con éxito por un protocolo de evaluación con ayuda de actividad biológica después de examinar un número de posiciones posibles derivados en paralelo [36]. Se encontró AA005-gripe para exhibir selectividad celular similar a su molécula parental, y se acumulan en las mitocondrias de cáncer hepático, pero no las células normales [36]. Mediante el uso de análisis de inmunofluorescencia microscopía confocal, hemos demostrado que AA005-gripe podría co-localizar con mitocondrias en HT29, HCT116 y células LOVO (Figura 3B). Sin embargo, la señal AA005-gripe era muy débil en las mitocondrias de HBEpiC o células 293T (Figura 3B). Mientras AA005-gripe inhibió la proliferación de LOVO, HT29 y las células HCT116 de una manera dependiente de la dosis, su efecto citotóxico sobre HBEpiC era débil (Figura 3C). Por otra parte, se informó de que podría aumentar AA005 Rodamina 123 fracciones negativas en HT29 y LOVO pero no las células HBEpiC (Figura 3D). Estos resultados sugieren que podría AA005 moléculas diana mitocondriales y así perturbar vía energético de las células cancerosas.
(A) Estructura química de AA005-fluoresceína. (B) la localización intracelular de AA005. Las células fueron co-incubadas con AA005-influenza a 100 nM durante 12 h, y se analizaron mediante microscopía confocal usando un MitoTracker (roja) a tinción de contraste mitocondrias. (C) de ensayo MTT de LOVO, HT29, HCT116 y las células HBEpiC sobre AA005-gripe a las concentraciones indicadas durante 48 h. (D) AA005 disminuye el potencial transmembrana mitocondrial de las células de cáncer de colon revelados por aumento en las células 123-negativos de rodamina. Las células fueron tratadas con AA005 a la concentración indicada durante 24 h y se analizaron por tinción con rodamina 123 y citometría de flujo. (E) Las células se trataron con o sin AA005 a la concentración indicada durante 24 h, NAD
relación de + /NADH se midió usando un NAD /NADH Kit de ensayo colorimétrico AmpliteTM. (F) Las células se trataron con o sin AA005 a la concentración indicada durante 24 h, y el contenido de ATP se midió usando un kit de ensayo de ATP bioluminiscencia. (G) Las células fueron tratadas con AA005 en los puntos de concentración y tiempo indicados, se lisaron, y Western blot se realizó utilizando anticuerpos indicados.
Las mitocondrias focalización agentes (mitocans) son propensas a interrumpir la oxidación vía de fosforilación y la reducción de NAD relación
+ /NADH, lo que resulta en la inhibición de la producción de ATP y la activación de AMPK que se refleja por la fosforilación e inactivación de la acetil-CoA carboxilasa (ACC) (Ser79) que es un indicador para la actividad de AMPK [37]. Hemos probado el efecto de AA005 de celulares NAD
+ /NADH y el contenido de ATP, y se encontró que en las células HT29 y Lovo tratamiento con AA005 de 50 a 200 nM durante 24 h reduce NAD relación
+ /NADH ( Figura 3E) y agota ATP de una manera dependiente de la dosis (Figura 3F), mientras que, curiosamente, AA005 no podría disminuir significativamente NAD
+ /relación de NADH y el contenido de ATP en las células HBEpiC (figura 3E y F). Por otra parte, AA005 notablemente hasta reguladas p-AMPK y p-ACC de la dosis y modo dependiente del tiempo (Figura 3G). Sin embargo, estos fenómenos no se observaron en células HBEpiC (Figura 3G).
Hemos demostrado que AA005, así como los mitocans AICAR y rotenona causados depleción de ATP en las células HT29 y LOVO, mientras que AMPK compuesto inhibidores de la C y la inosina atenuadas este efecto (Figura 4A). AA005, AICAR y rotenona hasta reguladas p-AMPK y p-ACC, mientras que el compuesto C y reducen la inosina-AA005 desencadenó sobre regulación de las dos moléculas (Figura 4B). Además, mientras que AA005 inhibió la proliferación de las células HT29 y LOVO, compuesto C y inosina reduce este efecto (Figura 4C). Estos resultados sugieren que se requiere la activación de AMPK por la citotoxicidad inducida por AA005 de células de cáncer de colon.
(A) Las células indicadas se trataron solo o combinatoria con AA005 (100 nM), AICAR (AA, 1 mM), se midió retenone (1 M), el compuesto C (CC, 10 M), o inosina (20 mM) durante 24 h, y el contenido de ATP. (B) y las células HT29 LOVO fueron tratados con el protocolo indicado, se lisaron, y Western Blot se llevó a cabo utilizando anticuerpos indicados. (C) HT29 y las células LOVO fueron tratados con diferentes regímenes de tratamiento durante 48 h, y la viabilidad celular se detectó mediante el ensayo de MTT.
inducida por AA005 AMPK activación media la mTOR Complex 1 Inhibición (mTORC1) in vitro
AMPK activada fosforila TSC2 en Thr-1227 y Ser-1345 y aumenta la actividad de TSC1-TSC2 complejo para inhibir mTOR [12]. Hemos probado los efectos de AA005 de mTORC1, y se informó que disminuyó AA005 p-mTOR y p-S6K (p85 y p70 S6K) en LOVO y HT29, pero no las células HBEpiC (Figura 3G). AICAR y rotenona también redujeron regulado p-mTOR en las células HT29 y LOVO (Figura 4B). Sin embargo, inducida por AA005 p-mTOR baja regulación podría ser parcialmente reprimida por inosina y el compuesto C (Figura 4B). Compuesto C e inosina también ciclina D1 parcialmente atenuada regulación a la baja causada por AA005 (Figura 4B).
AMPK /mTOR Signaling participa en AA005 inducida por autofagia in vitro
activación de la AMPK puede inducir la autofagia a través la inhibición de mTOR (49). Hemos probado si AA005 podría inducir la autofagia en las células de cáncer de colon o no mediante la detección de los cambios de forma citosólica (LC3-I) y la forma lipidada (LC3-II) de la LC3 marcador de autofagia. Curiosamente, se encontró que AA005 indujo acumulación de LC3-II en las células LOVO en un tiempo y dependiente de la dosis de la manera (Figura 5A). El plásmido pQCXIP-GFP-LC3 se transfectó en células LOVO que se trataron luego con AA005 a 100 nM durante 24 h, seguido de la evaluación de la microscopía confocal. Hemos demostrado que mientras que las células de control mostraron una tinción difusa, las células LOVO sobre rapamicina AA005 o mTOR inhibidor (100 nM) exhibió un patrón de tinción fluorescente moteado, lo que indica la redistribución de LC3 a autofagosomas (Figura 5B). Curiosamente, inosina atenuada formación de autofagosomas LC3 (Figura 5B) y la acumulación de LC3-II (Figura 5C) AA005-causado. Estos resultados indican que AA005 induce la autofagia de las células de cáncer de colon a través de la vía de señalización AMPK /mTOR. Sin embargo, el tratamiento con AA005 en 50 a 200 nM durante 24 h o 100 nM para 12 a 48 h no resultó en un marcado apoptosis de las células Lovo reflejada por Anexina V /PI tinción y citometría de flujo evaluación (Figura 5D) o análisis de transferencia Western de la escisión de PARP, un sustrato de activado casp-3 (Figura 5E).
(a) el análisis por inmunotransferencia de los niveles de LC3-II LC3-I y en las células tratadas con LOVO AA005. células (B) LOVO transfectadas con pQCXIP-GFP o plásmido pQCXIP-GFP-LC3 se trataron durante 24 h con AA005 (100 nM) y /o inosina (20 mM), y rapamicina (100 nM), y se evaluaron por análisis de inmunofluorescencia. células LOVO (C) fueron tratados con los protocolos indicados, se lisaron, y ensayo de transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos indicados. (D) células LOVO fueron tratados con AA005 o cisplatino (20 M) durante 24 h, o AA005 a 100 nM para los puntos de tiempo indicados. Las células se analizaron entonces mediante tinción con anexina V /PI y citometría de flujo. (E) análisis de transferencia Western de lisados de células tratadas con LOVO AA005 o cisplatino (20 m para 24 h).
AA005 sinergia con 2-desoxiglucosa y cisplatino en la inhibición de la proliferación de células del cáncer de colon mediante la modificación de AMPK y mTOR
2-desoxiglucosa (2-DG) es un análogo de la glucosa sintética capaz de inhibir la glucólisis y la producción de ATP [38]. Hemos probado los efectos combinados de AA005 y 2-DG en células Lovo y encontramos que el uso combinado de los dos agentes ejercida sinergismo en la inhibición de la proliferación celular (Figura 6 A y B) y la supresión de la generación de ATP (Figura 6C). AA005 en combinación con 2-DG condujo a una mayor regulación de p-AMPK y p-CAC, y la baja regulación de p-mTOR y CDK4 (Figura 6D).
(A), B células LOVO fueron tratados indica protocolos durante 48 h, analizados mediante el ensayo de MTT (a), y los efectos combinados fueron evaluados por el método de Chou-Talay y software Calcusyn (B). Los índices de combinación (IC) menor que, igual a, y mayores que 1 indican, aditivos y sinérgicos efectos antagónicos, respectivamente. células LOVO (C) se trataron con 50 nM AA005 o /y 5 mM 2-DG durante 24 h, y el contenido de ATP se evaluó como se describió anteriormente. análisis (D) de transferencia Western de lisados de células tratadas con LOVO AA005 y /o 2-DG usando anticuerpos indicados. células LOVO (E, F) se trataron protocolos indicados durante 48 h, analizados mediante el ensayo de MTT (E), y los efectos combinados fueron evaluados por el método de Chou-Talay y software Calcusyn (F). análisis (G) de transferencia Western de lisados de células tratadas con LOVO AA005 o /y cisplatino utilizando anticuerpos indicados. (H) células LOVO fueron tratados con AA005 y /o cisplatino, y se analizaron por tinción con Anexina V /PI y citometría de flujo. (I) Las células fueron tratadas con AA005 y /o cisplatino durante 24 h, y el contenido de ATP se midió usando un kit de ensayo de ATP bioluminiscencia. (J) LOVO células fueron tratadas con AA005 y /o cisplatino durante 24 h, y la distribución del ciclo celular se determinó por citometría de flujo.
agente quimioterapéutico cisplatino puede regular por incremento vía de supervivencia de mTOR, que confiere resistencia a los medicamentos a cáncer de células [39]. Hemos demostrado que, si bien AA005 y cisplatino causaron efecto inhibitorio sinérgico sobre la proliferación de células LOVO (Figura 6 E y F), AA005 disminuyó disparado por cisplatino sobre regulación de mTOR y S6K (Figura 6G). El uso combinado de AA005 y cisplatino dio lugar a una mayor apoptosis efecto sobre las células Lovo reflejados por Anexina V /PI tinción y citometría de flujo evaluación (Figura 6H) o Western blot de la escisión de PARP (Figura 6G). Sin embargo, la combinación de estos dos agentes no causó sinergia en el agotamiento del contenido de ATP (Figura 6I), la detención del ciclo celular (Figura 6J), o la autofagia (que se refleja por la expresión LC3-II, la Figura 6G) en células LOVO.
Discusión
acetogeninas Annonaceous representan una serie de C-35 /C-37 los productos naturales con THF hidroxilado y las estructuras de anillos de γ-lactona [25], [26], [28]. Muchos miembros de esta familia presentan actividad citotóxica por la perturbación de la etapa de transferencia de electrones terminal en el complejo I de la mitocondria [40]. AA005 es un mimético de acetogenin Annonaceous en el que tanto los anillos de THF se sustituyen por una unidad de etileno glicol éter. AA005 conserva las funcionalidades esenciales de las acetogeninas naturales y muestra más potente actividad biológica [41]. En este estudio, mostramos que AA005 es capaz de activar AMPK e inhibir mTOR, por lo tanto, detiene el ciclo celular en la fase G1 e induce la autofagia de células de cáncer de colon. AA005 sinergias con inhibidor de la glucólisis 2-DG de bloqueo marcada generación de ATP, y antagoniza inducida cisplatino sobre regulación de p-mTOR, que conduce a la inhibición de una mayor proliferación e inducción de apoptosis en células de cáncer de colon. Estos resultados indican que AA005 tiene potencial terapéutico al menos en este tipo de neoplasia maligna
Orientación metabolismo de las células del cáncer, especialmente la inhibición de la glucólisis, ha emergido como una nueva estrategia prometedora para combatir el cáncer [42] -. [44]. Las mitocondrias no sólo gestionar la generación de energía a través del ciclo del ácido cítrico (ciclo de ácido tricarboxílico, ciclo de Krebs), sino que también juegan un papel clave en la regulación de la apoptosis mediante la liberación de citocromo C. A pesar de que tiene un gran debate sobre si las mitocondrias tienen defectos en la vía de la fosforilación oxidativa, se podría ser un objetivo potencial para la terapia del cáncer [42], [45]. Algunos mitocans como Metaformin y vitamina E análogos que inhiben el complejo I y II muestran actividad eficaz y selectiva anti-cáncer. Estos agentes inducen la muerte de células de cáncer a través de la generación de superóxido y la desestabilización mitocondrial [46]. ATP también se podría agotar hasta cierto punto de tratamiento de mitocans [42], [45]. Las mitocondrias complejo I ha demostrado ser el blanco de acetogenin Annonaceous [40]. Nos informan de que AA005 puede co-localizar con la mitocondria en el cáncer de colon, pero no HBEpiC o células 293T (Figura 3A), lo que sugiere que AA005 puede reducir NAD
+ cociente /NADH y la producción de ATP en las células cancerosas. Esta posibilidad se confirmó en LOVO, HT29 y las células HCT116 (Figura 3C). Sin embargo, ¿por qué las mitocondrias en las células cancerosas son más propensos a ser el blanco de AA005 sigue siendo una pregunta abierta. La inhibición de la mitocondria por Metaformin y rotenona puede conducir a la activación de la AMPK [42]. Se demuestra que AA005 también puede suprimir las mitocondrias y activar AMPK (Figura 3).