Extracto
Hay una necesidad urgente de obtener y validar dianas altamente eficaces para la intervención combinatoria de los esfuerzos en curso de caracterización molecular a gran escala de los tumores. Establecimos un in silico plataforma bioinformática en concierto con una plataforma de cribado de alto rendimiento evaluación de 37 novedosas específicas agentes en 669 líneas celulares de cáncer ampliamente caracterizados que reflejan la diversidad genómica y del tipo de tejido de los cánceres humanos, para identificar sistemáticamente biomarcadores combinatorias de respuesta y co-procesables objetivos en el cáncer. biomarcadores genómicos descubiertos en un conjunto de entrenamiento línea de 141 células fueron validados en un conjunto de prueba de línea independiente de 359 células. Se identificaron concurrentes y eventos mutuamente excluyentes genómicas que representan los conductores potenciales y objetivos combinatorias en el cáncer. Demostramos múltiples eventos genómicas cooperantes que predicen la sensibilidad a la intervención farmacológica independiente de linaje tumor. El acoplamiento del escalable in silico y plataformas línea celular de cáncer de alto rendimiento biológicos para la identificación de los compañeros de eventos en el cáncer de entrega combinatorias objetivos racionales para aproximaciones sintéticas letales con un alto potencial de adelantarse a la aparición de resistencia
.
cita: Un Tabchy, Eltonsy N, Housman dE, GB Mills (2013) La identificación sistemática de los conductores combinatorias y metas en líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 8 (4): e60339. doi: 10.1371 /journal.pone.0060339
Editor: Mark Isalan, Centro de Regulación Genómica, España |
Recibido: 25 Octubre, 2012; Aceptado: February 25, 2013; Publicado: 5 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Tabchy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) U54 CA112970 a GBM (http://www.nih.gov/), una subvención Komen Promise (KG08109903) de GBM y concesión Komen Proteómica Descubrimiento (FAS0703849) a AT y GBM (http : //ww5.komen.org/), un programa de la 01 concesión entretenimiento Fundación de la Industria SU2C-AACR-DT0209 de GBM (http://www.standup2cancer.org/), y el apoyo de GSK para GBM (http: //www.gsk.com/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. GBM recibió investigación patrocinada de GSK para determinar marcadores moleculares para predecir la respuesta a los inhibidores de PI3K. GBM tiene el apoyo de Exelixis, Celgene, Wyeth y Astra Zeneca para determinar la respuesta a los fármacos que no participaron en este estudio. GBM está en el Consejo Asesor de la oncología de Astra Zeneca. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Los otros autores declaran no tener conflictos de intereses.
Introducción
Un reto importante que emerge a raíz del tsunami de datos generados por los esfuerzos para caracterizar los tumores a nivel molecular (por ejemplo, del Genoma del Cáncer Atlas [ ,,,0],TCGA] (http://www.cancergenome.nih.gov) e Internacional del Genoma del cáncer Consorcio [ICGC] (http://www.icgc.org)) es la forma de aprovechar los datos y traducirlo en una mejora de los resultados clínicos, por la identificación de la base molecular del cáncer en pacientes individuales y, posteriormente, el uso de estas lesiones moleculares como objetivos para la intervención efectiva. Al mismo tiempo, la reducción de los costes de secuenciación que conducen a la
democratización Red de pruebas moleculares se traduce ya en muchos pacientes que tienen sus tumores mecanografiadas a nivel molecular. Los esfuerzos de caracterización de tumores no son ya la limitación de tasa; más bien cómo interpretar y "actuar" en los datos es ahora el principal factor limitante. Estos retos deben superarse antes de los avances tecnológicos emergentes en la caracterización del tumor pueden ofrecer el máximo impacto clínico. Un paso clave en el proceso es la identificación de biomarcadores que podrían predecir la respuesta al tratamiento y el análisis de aberraciones moleculares de conducción de acciones concretas de ruido. Estos desafíos se pueden resolver mediante la aplicación de algoritmos que ayudan a analizar los datos, de forma paralela al establecimiento de sistemas modelo humanizado gran escala de alto rendimiento descubrimiento y validación de objetivos que serán el fundamento de un desarrollo de fármacos y acelerado proceso de ensayos clínicos. Se necesitan con urgencia biomarcadores predictivos robustos para la medicina molecular combinatoria de cambiar el panorama de ensayos clínicos del estado actual de la baja eficacia terapéutica en grandes ensayos clínicos y las poblaciones no seleccionadas, con alta eficacia ensayos clínicos pequeños enriquecidos para las poblaciones objetivo. Este enfoque tiene el potencial de hacer ensayos clínicos pequeños, más rápidos y más baratos, mientras que el aumento de los beneficios para los pacientes individuales.
Así biomarcadores individuales conducidos lejos intervenciones han tenido un éxito limitado en la clínica. Los éxitos iniciales con terapias dirigidas en los tumores "oncogenes adicto" [1] - [4] (por ejemplo imatinib en LMC; inhibidores de BRAF en el melanoma) se han moderado por la realización de una serie de limitaciones: (1) la aparición de resistencia debido a la heterogeneidad cáncer, con clones pre-existentes que demuestra la variación en la diana molecular que conduce a resistencia clínica (selección clonal); (2) la resistencia inicial de los tumores debido a la co-mutación en una vía de resistencia; y (3) la resistencia debido a la retroalimentación homeostática bucles que restablecerá el estado estacionario de referencia perturbado por la intervención dirigida [2] - [6]. Por lo tanto, parece que los marcadores biológicos y /o intervenciones individuales pueden tener un potencial limitado para el éxito en la clínica. De la misma manera que manejamos en peligro la vida infecciones bacterianas o virales (por ejemplo, tuberculosis, virus de inmunodeficiencia humana) con múltiples antibióticos simultáneas [7] - [9], la terapia exitosa para el cáncer, que tiene toda la versatilidad y robustez del repertorio eucariota de respuestas a su disposición, lo más probable es requerir múltiples intervenciones dirigidas simultáneas para adelantarse a la aparición de resistencia. Aquí proponemos un marco para la identificación racional de los múltiples factores que cooperan para producir el fenotipo del cáncer, y podría utilizarse como dianas eficaces para la intervención terapéutica combinada.
líneas celulares de cáncer de cerca recapitular conocido asociados a tumores genética anomalías proporcionar modelos para la enfermedad humana. Por ejemplo, líneas celulares de cáncer derivado de mama se ha demostrado que recapitular fielmente las características genómicas de tumores primarios, con la amplificación del gen HER2 en correlación con la sensibilidad trastuzumab tanto in vitro como en pacientes [10], lo que demuestra que las correlaciones genotipo-respuesta clínicamente observados se conservan en los modelos de líneas celulares de cáncer. Aquí llevamos a cabo una búsqueda sistemática de los compañeros de eventos genómicos que se seleccionan durante la iniciación o progresión del cáncer, y si se dirigen juntos podría mejorar notablemente los resultados del paciente. Demostramos una plataforma en silico para la identificación de los conductores y los biomarcadores de cáncer respuesta concurrentes, y su aplicación como prueba de concepto en una línea de set 669 células altamente caracterizado tratados con agentes dirigidos 37 novedosos. biomarcadores predictivos identificados en un conjunto de entrenamiento línea de 141 células fueron validados en un conjunto de prueba de línea independiente de 359 células. Proponemos que una tubería compuesta de una robusta plataforma bioinformática silico acoplado a una plataforma de línea celular de cáncer de alto rendimiento para el descubrimiento genómico funcional y validación podría actuar como un puente entre los esfuerzos de caracterización como el TCGA /ICGC en un extremo y los ensayos clínicos /clínicas por el otro.
Resumen de datos Métodos
respuesta a los fármacos gIC50 para un total de 37 compuestos dirigidos probado en 669 líneas celulares que representan la diversidad genómica de los tipos de cáncer humano, específicamente 23 compuestos probados en 310 células líneas (juego GSK), y 14 compuestos ensayados en 500 líneas celulares (juego McDermott) se obtuvieron de las bases de datos públicas (Fig 1). [11] - [13]. Las curvas de respuesta de drogas se generaron y puntos de inflexión se determinaron matemáticamente en base a modelos de curvas polinómicas de orden superior y definen sensibles frente a líneas celulares resistentes para cada fármaco (Fig. S1 en el archivo S1). Las líneas celulares fueron genotipo principalmente SNP adaptado a la base de datos de la línea celular del Genoma del Cáncer del Instituto Sanger de vincular los datos de sensibilidad de drogas en las líneas celulares a los datos de caracterización genómica disponible de Sanger [14], incluyendo el estado de la mutación de la secuenciación completa exones de codificación de 64 genes del cáncer frecuentemente mutados (incluyendo el número de copias), y copiar los datos de número de Affymetrix SNP matriz de 6,0 en 419 genes [14]. Un evento genómico se define como una mutación y /o un número de copia aberración en un gen particular. Esperado y observado la frecuencia co-evento se generaron en las líneas de células sensibles y resistentes y compañeros de las características genómicas que estaban en desequilibrio capturado a través de las pruebas de significación de varias capas estadística y biológica y la validación cruzada produciendo así los eventos co-seleccionado y mutuamente excluyentes altamente significativas entre ellos características genómicas y de linaje en la población línea celular y para cada fármaco (Fig. 2). Los biomarcadores genómicos descubiertos en una línea de formación 141 células fueron validados establecer de forma independiente en un conjunto independiente que no se solapan prueba de 359 líneas celulares proyectará el 14 de los compuestos.
conjunto de GSK es de 310 líneas celulares, información genómica disponible en 294. McDermott conjunto es de 500 líneas celulares, información genómica disponibles en 366. las líneas 141 celulares comunes a los GSK y McDermott se utilizaron como un conjunto de entrenamiento, información genómica disponible en 139.
trama de la diferencia entre las frecuencias (
Observado - predicho) Opiniones de todos los posibles eventos genómicas dobles en las líneas celulares 294. Basado en 262 genes distintos afectados, hubo un total de 34.191 potenciales eventos que involucran dos genes genómicos. Las diferencias negativas más alejadas (cola de la izquierda) cero son mutuamente exclusivos, eventos diferencias positivas más alejadas (extremo derecho) son cero eventos co-seleccionado. Los acontecimientos significativos de las colas izquierda y derecha se encuentran en la Tabla 3 y la Tabla S3 S5 en Archivo
Métodos
Declaración de Ética:. N /A.
Línea de Crecimiento Celular Ensayos de inhibición
Los datos de 23 compuestos analizados GSK en un máximo de 310 líneas celulares (rango 187 a 273 líneas celulares examinadas por medicamento, media = 228 líneas celulares por drogas) fueron descargados de los recursos proporcionados desde Greshock y colegas y Kim y sus colegas (conjunto GSK) [11], [13], y datos de 14 compuestos adicionales probadas en un máximo de 500 líneas celulares (rango 244 a 500, media = 460 líneas de células) fueron descargados de los recursos proporcionados por McDermott y colegas (juego McDermott) [12] (Fig. 1). Tanto el conjunto de GSK y McDermott de líneas celulares representan el amplio espectro de tipos de tumores en el cáncer humano, con 23 y 21 respectivamente linajes de cáncer, de origen epitelial, mesenquimal y orígenes hematopoyéticas. Para el conjunto de GSK, Wooster y sus colegas obtuvieron un total de 311 líneas celulares de cáncer únicas de varios proveedores (American Type Culture Collection; Programa de Desarrollo Terapéutica, Instituto Nacional del Cáncer, el Centro de Recursos Alemana de material biológico; y Colección Europea de Cultivos de Células Animales), luego crecido a medios de cultivo estándar recomendado por el proveedor; líneas celulares donde autenticados por SNP toma de huellas dactilares en Affymetrix 500 K 'SNP Chip y como se describe anteriormente [11]. Para el conjunto de McDermott, líneas celulares de cáncer humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cultivos Celulares GmbH (DSMZ), la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (JHSF), o la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) y se cultivaron de acuerdo con protocolos estándar como se describe anteriormente [12]. ensayos de inhibición del crecimiento de líneas celulares se realizaron como se describe anteriormente [11], [12]. Brevemente, para el conjunto de GSK, el punto medio de la ventana de crecimiento (la gIC50) cae a medio camino entre el número de células en el momento de la adición del compuesto (T = 0) y el crecimiento de las células de control tratadas con DMSO a las 72 horas. El valor gIC50 (concentración del fármaco, nmol /L) es una métrica para medir la inhibición de la proliferación en las células cancerosas. Del mismo modo, en el conjunto de McDermott, la
viabilidad celular
de cada línea celular a una concentración dada de compuesto se calculó como la fracción de células viables para las células no tratadas presentes después de 72 h de tratamiento (ratio). Nos referiremos aquí para gIC50 (conjunto GSK) y la viabilidad celular (juego McDermott) como los valores de inhibición del crecimiento (GI). En ambos conjuntos, menor será el valor de GI más sensible es la línea celular de un medicamento específico.
Curvas de respuesta de Drogas y Determinación de Resistentes contra líneas celulares sensibles
sistemática identificó sensibles frente a células resistentes líneas para cada fármaco. La sensibilidad y la resistencia no son propiedades intrínsecas de las líneas de células, pero se definen en relación a un fármaco específico. Para cada medicamento, le ordenaron y trazan los valores de IG para la población línea celular. El conjunto de GSK incluye 310 líneas celulares. El conjunto incluye McDermott 500 líneas celulares sometidas a prueba en 14 compuestos: las 141 líneas celulares que eran comunes a los conjuntos McDermott y GSK se utilizaron como un conjunto de entrenamiento; se utilizaron las líneas de células 359 restante que no se solapan (500-141 = 359) como una prueba ajustado a validar nuestros resultados en los 14 datos compuestos proporcionados por McDermott (Fig. 1). Sobre la base de la determinación de la primera "punto de inflexión", que corresponde a la zona donde el gráfico se desvía bruscamente en la zona central plana de la curva (Fig. S1 en File S1), la población línea celular se dividió en dos grupos, los primeros parte de la curva define las líneas sensibles con bajos valores de GI (antes del punto de inflexión), y la parte plana de la curva y más allá de las líneas resistentes definidos con valores de GI superiores (después de punto de inflexión). Esto asegura que las líneas de células que se definen como sensibles tienen valores de GI bajos y una sensibilidad diferente, entonces el resto de las líneas celulares ensayadas para ese medicamento. La parte central plana de la curva contiene líneas celulares con valores de GI similares, que corresponde a la zona de frecuencia de pico en una curva de distribución normal cuando la frecuencia se representa frente a valores de GI. Este enfoque también garantiza la captura efectiva de pequeños subconjuntos de líneas de células atípicas con las respuestas marcadas debido a los genotipos que sensibilizan a los medicamentos de baja frecuencia. La curva de respuesta a los fármacos fue modelado matemáticamente como una curva polinómica de orden superior; el primer "punto de inflexión" se determinó gráficamente como la primera instancia del mayor cambio en la pendiente (pendiente es la primera derivada) de la curva de respuesta a los fármacos, es decir, la primera instancia del valor absoluto más grande de la segunda derivada de la curva ( primer valor extremo). Los puntos de inflexión se determinaron de forma independiente para cada compuesto en el conjunto de GSK, y en los conjuntos de entrenamiento y prueba para compuestos en el conjunto McDermott, respectivamente. En el conjunto de GSK, el valor mediano gIC50 en el punto de inflexión fue 659 nM, con un rango de 16 a 3.955 nM. En el conjunto McDermott, se utilizó como punto de corte el punto de inflexión o un valor de IG de 0,78, lo que dio el mayor (GI valor más pequeño) Sensibilidad: para el conjunto de entrenamiento, el punto de corte media fue de 0,69, con un rango del 0,51 a la 0,78; para el equipo de prueba, el punto de corte media fue de 0,74, con un rango del 0,50 al 0,78.
Huellas Digitales basados en SNP utilizado como Robusta Dirección de la línea celular de referencias cruzadas
Con el fin de realizar el genotipo correlaciones de respuesta, que vinculan la información genómica (mutaciones y aberraciones número de copias) en líneas celulares a partir de un conjunto independiente de datos de sus perfiles de respuesta (GI). Para evitar posibles problemas con la denominación de líneas celulares y la contaminación, se utilizó la única huella digital SNP de cada línea celular (conjunto GSK) para referencias cruzadas y su adecuación a las líneas celulares a través de bases de datos. Genotipo análisis del conjunto de la línea celular de GSK 310 SNP se realizó mediante la huella dactilar de Affymetrix 500 K 'SNP Chip y como se describe anteriormente [11]. Brevemente, las huellas dactilares de SNP de las líneas celulares se compararon entre sí y a la huella digital SNP generada por cáncer genoma de la célula Line Proyecto del Wellcome Trust Sanger Institute como se describió anteriormente, con las líneas celulares que tienen & gt; 80% de identidad considera una coincidencia genética. Había 283/310 líneas de células genéticamente distintas en el conjunto de GSK. Ensayos de viabilidad celular para 25 de los 37 compuestos se restringen a las líneas de células genéticamente distintas. Se encontró un total de 256/310 líneas celulares de tener un partido genotipo en la base de datos de Sanger. De los partidos genotipo, 233/256 también igualó por su nombre, y para aquellos que no coincidía con el nombre de (n = 23), la asociación del genotipo entre los nombres había sido registrado previamente (http://www.sanger.ac.uk /genetics/CGP/Genotyping/synlinestable.shtml). Para los 54 restantes líneas celulares (310-256), 38 fueron emparejados por su nombre a la base de datos de Sanger, y 16 permanecieron sin igual (Tabla S1 S3 en archivos). nombres de líneas celulares fueron revisados manualmente. Se tomaron nuevas medidas para garantizar la coherencia entre los nombres de la línea celular y la duplicación en los casos diferencias de sintaxis o de puntuación se produjeron entre los nombres o alias. Para el set McDermott contando 500 líneas celulares, las 141 líneas celulares que eran comunes a los conjuntos McDermott y GSK tan igualada por nombre fueron utilizados como un conjunto de entrenamiento, y se utilizaron los que no se solapan 359 restantes líneas celulares como un conjunto de prueba. Las líneas celulares en el equipo de prueba, donde una asociación del genotipo con una línea celular en el conjunto de entrenamiento había sido grabado previamente fueron retirados del conjunto de prueba; Además, las líneas celulares dentro de la configuración de prueba, donde una asociación genotipo había sido grabada previamente (duplicados internos) fueron removidos con un representante de la línea celular restante. De este modo 348 líneas celulares distintas permanecieron en el equipo de prueba. Un total de 216/348 líneas celulares fueron emparejados a la base de datos de Sanger, y 132 se mantuvo sin igual (Tabla S2 S3 en archivos). Las características genómicas de las líneas celulares correspondientes en el Proyecto del Genoma del Cáncer Sanger fueron descargados (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/) para la GSK y McDermott establece, respectivamente; se compiló una base de datos curada de los sucesos genómicos en cada línea celular (Tabla S3 S3 en archivo para el conjunto y el entrenamiento conjunto de GSK, n = 310-16 = 294; Tabla S4 en Archivo S3 para el equipo de prueba, n = 216) basado en los datos de secuenciación para la resolución de pares de bases de los exones codificantes completas de 64 genes del cáncer frecuentemente mutados, y el análisis del genoma del aumento del número de copias y la pérdida utilizando Affymetrix SNP 6.0 microarrays y el algoritmo de picnic para predecir los segmentos de número de copias en 419 genes (incluidos los 64 genes arriba), descargados de Sanger Proyecto del Genoma del cáncer, Catálogo de mutaciones somáticas en el cáncer (versión v51 cósmica) [14]. Un evento genómico se define como una mutación (que codifica la variante de secuencia), y /o un número de copias aberración [una deleción homocigótica (número total de copias = 0) o una amplificación (número & gt copia total, = 8)] en un gen particular . Los términos de eventos de mutación genómica y se utilizan indistintamente en el texto para representar una aberración en un sitio genómico específico.
La identificación genómica Compañeros de eventos de relevancia
Si los sucesos genómicos (es decir, mutaciones, número de copias aberraciones) están distribuidos al azar en la población de líneas celulares, y dos eventos co-ocurren en una línea celular de forma independiente el uno del otro y debido a factores de azar, y su co-ocurrencia no pone el celular a una ventaja o desventaja selectiva, entonces la tasa de co-mutación previsible de la población es la siguiente:
observaron tasas de co-mutación se compararon con las tasas de mutación co-predichos; Los compañeros de mutaciones que se producen
más o menos que
predicho por casualidad se determinaron en un nivel de significación de P & lt; = 0,05 mediante la prueba de Chi-cuadrado de Pearson. Estas desviaciones de la aleatoriedad son probablemente debido a presiones selectivas. En concreto, para identificar compañeros de eventos que se asociaron con la respuesta al fármaco, se comparó prevé que las frecuencias observadas para cada medicamento en subpoblaciones sensibles y resistentes, respectivamente (prueba de Chi-cuadrado). Cuando los compañeros de mutaciones relevantes se determinaron en subpoblaciones sensibles y resistentes, además de la prueba de Chi cuadrado para la significación estadística, una relación de las frecuencias observadas en sensible vs líneas resistentes (S /R) se calculó con un cambio veces mayor que 1,5 [ ,,,0],0,667 a 1,5] se utiliza como un segundo criterio de selección. Estos enfoques se aplicaron a la formación y de prueba, respectivamente.
Análisis de Datos y Clustering
Cluster
se utilizan para ajustar los datos de GI antes de la agrupación jerárquica. Para cada uno de los 37 compuestos, valores de GI fueron los primeros mediana centra entonces normalizada; esto produce una puntuación de inhibición del crecimiento reducido que es un medio de potencia independiente de la comparación de perfiles de respuesta a través de compuestos. a continuación, los datos se agrupan jerárquicamente usando la correlación de Pearson como una métrica basada en la distancia media entre nodos. Treeview se utiliza para la visualización de las agrupaciones resultantes. El Cluster Treeview y el software están disponibles en el laboratorio Eisen (http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm) [15]
Análisis estadístico
la prueba de Pearson Chi-cuadrado. ( se utilizaron para los compañeros de eventos) y la prueba exacta de Fisher (para eventos individuales) para asignar valores a dos caras P en el intervalo de confianza del 95% para describir las correlaciones entre las mutaciones del gen /número de copias aberraciones y sensibilidad a los fármacos. Para la determinación de eventos genómicos individuales estadísticamente significativas, con sólo unas pocas pruebas de funcionamiento, esto evita la necesidad de corregir para comparaciones múltiples. (. Tabla S5 en Archivo S3 y la figura 2) en que se determinó el espacio de dos compañeros de eventos en las líneas celulares 310, se aplicó un umbral múltiples pruebas de corrección Benjamini-Hochberg con una tasa de falso descubrimiento (FDR), de 5%; más del 92% de los resultados siguió siendo significativa después de la corrección. Incluso si por razones teóricas aplicamos los más estrictos múltiples pruebas de corrección, la corrección de Bonferroni altamente conservadora, al espacio sin filtrar total de toda observó 6871 dobles compañeros de eventos, con 6871 pruebas se ejecutan, & gt; 65% de los resultados siguió siendo significativa después de la corrección se aplicó. Más importante aún, nuestras predicciones de biomarcadores para individuales y co-eventos fueron validados de forma independiente en un conjunto de pruebas que no se solapan independiente de 359 líneas celulares sometidas a prueba en 14 compuestos que comprenden establece el McDermott.
Resultados
no supervisada la agrupación de respuesta a los fármacos en líneas celulares recapitula objetivos farmacológicos específicos Pathway y controladores
en primer lugar, determinamos si el agrupamiento no supervisado de la sensibilidad de las 310 líneas celulares de cáncer humano a 37 fármacos dirigidos podrían recapitular los mecanismos de acción de fármacos conocidos y también lo molecular base de la respuesta en líneas celulares altamente caracterizados. Esto se visualiza en la Fig. 3 para una visión global de la respuesta de las células línea con las drogas (y la Fig. S2 en Archivo S1). Figs. S3, S4 en S1 del archivo a visualizar las imágenes de agrupamiento para la GSK (23 medicamentos) y los conjuntos McDermott (14) por separado drogas; el análisis independiente reduce el ruido introducido por el análisis de 37 compuestos y la fusión de dos conjuntos de datos independientes con diferentes enfoques produciendo de este modo un agrupamiento más apretado de clases de objetivos funcionales. De hecho, los fármacos agrupados juntos en el eje vertical de acuerdo con su objetivo principal conocida molecular. Por ejemplo, un conjunto de medicamentos IGF1R dirigida estructuralmente divergentes agrupado en las proximidades de la Fig. 3 y la fig. S3 en File S1, con un coeficiente de correlación de 0,78 para el subcluster IGF1R representado. La agrupación jerárquica también recapitula objetivos de medicamentos dentro de las vías, definiendo así las intervenciones específicas que pueden modular la vía efectiva vías oncogénicas aberrantes. Esto fue evidente en la agrupación apretada de fármacos que se dirigen a la vía PI3K /AKT /mTOR, en la Fig. 3 y la fig. S3 en Archivo S1, como GSK2126458 [PI3K], GSK690693 [AKT], temsirolimus [mTOR], TGX-221 [PI3K-beta], IC87114 [PI3K-delta], GSK2119563A [PI3K-alfa], GSK2080806A [PI3K], BEZ -235 [panPI3K y mTOR], y GSK1059615 [PI3K], agrupado junto con un coeficiente de correlación de 0,72 para el subgrupo vía PI3K /Akt /mTOR. En la Fig. 3 y la fig. medicamentos S4 en File S1, EGFR y HER2 específicas, Erlotinib [EGFR], CL387 [EGFR], HKI272 [EGFR, HER2], y Lapatinib [ERBB1 /2], agrupado junto con un coeficiente de correlación de 0,66 para el subgrupo EGFR. inhibidores de la mitosis, Paclitaxel [tubulina], GSK461364 [Plk1], GSK661637 [Pan-PLK], GSK923295 [CENPE], y GSK1070916 [AURKB] también agrupados estrechamente como se muestra en la Fig. 3 y la fig. S1 S3 en Archivo. En este análisis, el linaje de origen de las células no influyó significativamente en la organización de los grupos, lo que sugiere que los eventos no dependientes del linaje contribuyen a la respuesta a las diferentes clases de fármacos. Las lesiones moleculares que subyacen a la respuesta a los fármacos específicos en estos subgrupos se analizan más adelante.
Cada fila representa una línea celular independiente, y cada columna representa un compuesto probado por separado. El aumento de la sensibilidad de una línea celular se indica por el aumento de la intensidad de la señal de verde, y el aumento de la resistencia de una línea celular se indica por el aumento de la intensidad de la señal de color rojo; cuadrados negros denotan sensibilidad cerca de la media a través de las líneas celulares. Las líneas celulares no apantallados con un compuesto particular se indican en gris. Los datos de la Fig. 3 se divide en dos cifras menos complejos (Fig.S3 y S4 en S1 Archivo) para disminuir el ruido y proporcionar una mejor visualización de las relaciones funcionales y activan la vía subclusters oncogénicos.
Eventos individuales genómicas Segregar Sensible a partir las líneas resistentes
el objetivo fue identificar las bases moleculares de la diferencia en la respuesta a la intervención del medicamento. Se correlacionaron las diferencias moleculares subyacentes en las líneas celulares con las diferencias en la respuesta a los fármacos. Para identificar qué lesiones moleculares estaban asociados con la sensibilidad o resistencia a un medicamento específico, la frecuencia de un evento genómico se comparó en sensible vs líneas resistentes y una proporción de (frecuencia en sensible /frecuencia en resistente), S /R, se calculó para cualquier aberración gen presente en más de 12% de las líneas sensibles o resistentes. Cualquier frecuencia gen que fue alterado en más de 1,5 veces en la sensibilidad vs líneas resistentes se consideró estar asociado con la sensibilidad a la droga (S /R & gt; 1,5) o la resistencia a la droga (S /R & lt; 0,67), respectivamente. Este identificados eventos genómicos asociados con la sensibilidad o resistencia a la intervención específica de drogas; los eventos estadísticamente significativas se encuentran en la Tabla S6 en S3 Archivo.
A modo de ejemplo, las líneas que eran sensibles a los inhibidores de MEK GSK1120212 eran 2,93 veces, 2.35, 1.92, y 1.67 veces más probabilidades de albergar una BRAF, KRAS, APC mutación o CDKN2A mutación (p14), respectivamente (P = 0,0009, P = 0,0021, P = 0,0243, P = 0,0105), mientras que las líneas resistentes fueron 2,57 más susceptibles de albergar un evento en RB1 (P = 0,0024) (Tabla 1). lesiones BRAF y RAS son conocidos por aumentar la actividad de MEK en los tumores [3], [16], por lo tanto, las intervenciones que inhiben la actividad de MEK reducirá /normalizar la señalización aguas abajo a través de la cascada de la quinasa MEK-ERK activado de forma constitutiva y por lo tanto se espera que estos enlaces. Sin embargo, no se espera que la asociación de la sensibilidad con APC o mutaciones del gen CDKN2A y sugerir biomarcadores adicionales de respuesta a la inhibición de MEK.
Las líneas sensibles al inhibidor de AKT GSK690693 mutaciones de esperar albergadas en la vía PI3K, incluyendo PIK3CA , PTEN, erbB2, y también FBXW7, TET2 y alteraciones BRCA2 (P = 0,0140, P = 0,0197, P = 0,0053, P = 0,0273, P = 0,0346, P = 0,0208, respectivamente) sugiriendo de nuevo biomarcadores genómicos inesperados de respuesta a AKT inhibidores que podrían aumentar el número de pacientes que puedan beneficiarse; no hubo eventos individuales asociados significativamente con la resistencia (Tabla S6 en S3 Archivo).
aberraciones PIK3CA confiere resistencia al inhibidor de BRAF AZ628 (P = 0,042) una observación que fue confirmado en el equipo de prueba (P = 0,05 ), probablemente a través de la activación de derivación de la vía PI3K paralelo, la recapitulación de los resultados de la intervención experimental [17], [18]. Por otro lado, BRAF, las ANR, como se esperaba [3], [16], y MLTT3 y se reunió aberraciones confiere sensibilidad a AZ628 en el conjunto de entrenamiento (P = 0,003, p = 0,036, p = 0,034, p = 0,003); esto fue confirmado en la prueba de BRAF y ANR (P = 2,4 × 10
-10, P = 0,001) (Tabla 2).
A pesar de que había una fuerte asociación genética de un solo aberraciones con respuesta a los agentes terapéuticos, esta asociación no se absoluta con un número de líneas celulares que contienen cualquier caso específico que se obtuvo como sea sensible o resistente. Por lo tanto debe haber eventos adicionales que cooperan con el estado mutacional para determinar la sensibilidad y resistencia a terapias dirigidas. Aparte de las asociaciones indicadas anteriormente y las aberraciones en PTEN y erbB2 potencialmente contribuir a la agrupación de los inhibidores de la familia EGFR y aberraciones en PTEN y CDKN2A ser asociados con las drogas dirigidas a las vías PI3K y de IGF1R, no hubo aberraciones claras de conducción la mayoría de la respuesta a los fármacos grupos (Fig. 3). De nuevo, esto sugiere que los compañeros de eventos adicionales deben contribuir a la sensibilidad a los fármacos y la resistencia. Los potenciales compañeros de eventos se analizan a continuación.
Molecular co-ocurren sucesos proporcionan controladores y Objetivos co-procesables en Cáncer
Para identificar potenciales eventos que cooperan, que identificó por primera sucesos genómicos que co-produjo más allá de lo que se espera si fueran independientes y la asociación debido a factores casualidad. Esto define compañeros de eventos que probablemente bajo presión selectiva durante la iniciación del tumor o la progresión (o durante la adaptación a la cultura) y por lo tanto tienen una alta probabilidad de ser conductores del fenotipo del cáncer. lesiones moleculares cuyos co-ocurrencia conduce a una ventaja proliferativa o de la supervivencia más allá de lo que se observa para las ocurrencias individuales separadas serán co-seleccionados y la frecuencia de la co-evento aumentarán en la población (Fig. 4). Sobre la base de la base de datos de sucesos genómicos en líneas celulares, el espacio de los observados dos compañeros de eventos (por ejemplo mut1-mut2) se generó para las líneas celulares 294 para los que se disponía de información genómica (juego GSK). Hubo 6871 observaron distintas dobles compañeros de eventos en las líneas celulares 294 y 12958 ocurrencias totales. Hubo 95415 distintas triples compañeros de eventos (por ejemplo mut1-mut2-Mut3) en las líneas celulares 294 y 110872 ocurrencias totales. Se compararon las frecuencias prevé que el co-evento observado en las líneas celulares 294, donde estaban disponibles para proporcionar un análisis estadístico de un número suficiente de compañeros de eventos. (Figura 2;. Tabla S3 S5 en Archivo)
aquí ilustrado es un secuencial múltiple modelo de éxito de la iniciación y progresión del cáncer, co-selección subyacente y la exclusividad mutua de los eventos genéticos en el cáncer. A, B, C son genes dentro del núcleo de una célula.