tumores sólidos
Extracto
-tipo difuso a menudo están compuestos de una alta proporción de proliferación rara vez (es decir, latente) las células cancerosas, lo que indica fuertemente la implicación de las células madre de cáncer (CSC) Aunque el cáncer gástrico de tipo difuso (GC) de los pacientes tienen un mal pronóstico debido al desarrollo de alta frecuencia de la diseminación peritoneal (DP), es limitado conocimiento de que la terapia de tipo difuso GC la células madre cancerosas asociada a la DP y la eficacia de CSC-orientación. En este estudio, hemos establecido líneas de células altamente metastásicas GC por
in vivo
selección diseñada para el enriquecimiento de las células GC asociada a la DP. Por el análisis de microarrays, encontramos CXC receptor de quimioquinas tipo 4 (CXCR4) puede ser un nuevo marcador para células madre cancerosas altamente metastásicas, ya que las células CXCR4-positivas pueden crecer de anclaje independiente, inician tumores en ratones, ser resistentes a fármaco citotóxico, y producen hija diferenciada Células. En muestras clínicas, se encontraron estas células CXCR4-positivo no sólo de etapa tardía metástasis (ascitis acumulada), sino también la etapa anterior (lavados peritoneales). Por otra parte, el tratamiento con factor de crecimiento transformante-β aumentó el efecto anti-cáncer de docetaxel a través de la inducción de la diferenciación de las células de división /asimétrica celular de las células madre cancerosas gástricas CXCR4-positiva, incluso en un estado latente. Por lo tanto, inductores de diferenciación prometedores para obtener el resultado terapéutico máximo de fármacos contra el cáncer disponibles actualmente a través de reciclado del
los CAC
Visto:. Fujita T, Chiwaki M, Takahashi Ru, Aoyagi K, K Yanagihara, Nishimura T, et al. (2015) Identificación y Caracterización de CXCR4 positivos de cáncer gástrico Stem Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10.1371 /journal.pone.0130808
Editor: Masaharu Seno, Universidad de Okayama, Japón
Recibido: 18 de febrero, 2015; Aceptado: 25-may de 2015; Publicado: 25 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Fujita et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. Todos los datos de microarrays se han depositado en una base de datos compatible con MIAME, GEO; número de acceso GSE53276
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Innovación Biomédica (para la Investigación Avanzada para productos médicos Minería Programa ID10-41), el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón (para la estrategia de 10 años Tercera Integral de control del cáncer H22-007), el Fondo Nacional del cáncer Centro de Investigación y Desarrollo (25-a-6, 26-a-3). Dres T Fujita, M y T Tamaoki Nishimura son los destinatarios de un residente de Becas de Investigación de la Fundación para la Promoción de la Investigación del Cáncer en Japón
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo. Punto de vista histopatológico, los GC pueden clasificarse en dos grandes categorías: de tipo intestinal y difuso de tipo. De tipo intestinal GC predomina en las zonas geográficas de alto riesgo y se desarrolla a través de algunas etapas secuenciales que incluyen
Helicobacter pylori gratis (
H
.
pylori
) -asociado gastritis atrófica, metaplasia intestinal (IM), y la displasia. Por el contrario, GC-tipo difuso, lo que representa la mitad de todos los pacientes con cáncer gástrico, tiene una amplia distribución geográfica y desarrolla incluso de
H
.
pylori
exento, mucosa gástrica morfológicamente normal sin gastritis atrófica o IM, y de tipo difuso GC puede diferir del tipo intestinal tanto genética y fenotípicamente [1-5]. A diferencia de la incidencia decreciente del tipo intestinal, la prevalencia de los de tipo difuso se informa en aumento en todo el mundo [6]. El pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico avanzado de tipo difuso se ha mantenido pobres en la última década debido a una alta tasa de diseminación peritoneal (PD) (78%) en comparación con la de tipo intestinal (45%) [7]. En particular, los pacientes con diabetes tipo Bormann IV GC tienen un pronóstico extremadamente precario, aunque hayan recibido tratamiento multidisciplinario [8]. Por lo tanto, frente a la EP es un tema urgente de mejora en el pronóstico de los pacientes de tipo difuso GC.
difusa de tipo GC se caracteriza típicamente por una extensa fibrosis estromal con mala vascularización y proliferativa raras (
i
.
e
.) las células cancerosas latentes, lo que conduce a una resistencia terapéutica sustancial. Desde el punto de vista de la quimioterapia, la transformación ha sido pensado para contribuir a la progresión agresiva través de la transición epitelial-mesenquimal del factor de crecimiento β (TGF-beta) y mediante la inducción de fibrosis [9]. Sin embargo, TGF-β también inhibe la proliferación celular, induce la apoptosis, y media la diferenciación de las células epiteliales, lo que sugiere que los componentes de las vías de señalización de TGF-β tienen actividad supresora de tumor en los tumores epiteliales [10, 11]. A pesar de la evidencia acumulada ha demostrado el papel fundamental de TGF-β en la biología de células madre del cáncer (CSC), hay información limitada en cuanto a su papel en la GC de tipo difuso.
Se ha informado de que cada población de células tumorales mostrar heterogeneidad funcional caracterizado por la proliferación distinta y capacidad de diferenciación en diversos tipos de tumores [12]. Para tener en cuenta esta heterogeneidad tumoral, se han propuesto dos modelos: el modelo de evolución clonal [13] y el modelo de CSC [14]. El último modelo ha recibido amplia atención, ya que proporciona una explicación razonable para la resistencia a la quimioterapia convencional y radioterapia, en el que células madre cancerosas quiescentes o lento de la bicicleta sobreviven, y los resultados en la recaída del tumor eventual [15-17]. Por lo tanto, las estrategias terapéuticas dirigidas a los CAC son imprescindibles para erradicar la enfermedad residual y prevenir la recurrencia en GC no sólo, sino también otros tipos de cáncer. Además, con puntos de vista actuales sobre los mecanismos celulares de la carcinogénesis, el potencial metastásico de las células tumorales se atribuye a los CAC, que pueden iniciar la formación de tumores por clonación en sitios distantes [18, 19]. Aunque se han propuesto una serie de moléculas de superficie celular como marcadores de CSC en una gran variedad de tumores malignos humanos, no ha habido ninguna identificación marcador de células madre cancerosas asociada a la DP en GCs [20-23]. Para identificar estos marcadores, hemos considerado la idea de que la forma funcional y genéticamente heterogéneas tumores tienen mecanismos comunes e intrínsecos de mantenimiento del tumor de acuerdo con el contexto de un microambiente dado. En consecuencia, la hipótesis de que las CSC deben ser definidos funcionalmente mediante ensayos bien validados como
in vivo
trasplante. Dentro de tipo difuso GC, que inicialmente se centró en la colonización-peritoneo específico de células y enriquecido las células madre cancerosas asociada a la DP por
in vivo
selecciones repetitivas [24, 25]. Aquí, encontramos receptores de quimioquinas CXC tipo 4 (CXCR4) puede ser un marcador de células madre cancerosas gástricas asociada a la DP y se demostró que el TGF-β aumenta la eficacia de los fármacos antitumorales a través de la inducción de la diferenciación celular división celular /asimétrico en el CXCR4
+ población CSC incluso en un estado latente.
Materiales y Métodos
las muestras clínicas
las muestras clínicas fueron proporcionados por el hospital Nacional del Centro del cáncer (Tokio, Japón) después de obtener el consentimiento informado por escrito de cada paciente y la aprobación por el Consejo Nacional del Centro del cáncer de Revisión Institucional (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).
líneas celulares y cultivos primarios
A humana línea celular GC, HSC-60 fue establecido por un colaborador utilizando el procedimiento que se describió anteriormente [26]. Una línea celular altamente peritoneal metastásico, 60As6 se estableció a partir HSC-60 utilizando el implante de tejido ortotópico en ratones SCID SCID /as brevemente del siguiente modo: el tumor xenoinjertado de HSC-60 células fue trasplantado en la pared gástrica de un ratón. Hemos repetido seis ciclos de células tumorales de ascitis de cosecha y de la inoculación ortotópico de estas células. Estas dos líneas celulares se mantuvieron en un medio RPMI-1640 suplementado con suero de ternera fetal 10%. También se establecieron dos líneas celulares que expresan luciferasa (HSC-60Luc y 60As6Luc). Otros seis líneas celulares derivadas de GC (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, y KATO III) también se mantuvieron en las mismas condiciones. De estos seis, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, y 58As9 fueron establecidos por el procedimiento anterior [27, 28], y KATO III se obtuvo de la American Type Culture Collection. Para los cultivos primarios, se recogieron las células de los lavados peritoneales de los pacientes y ascitis (NSC-16C, NSC-20C, y NSC-22C) y se cultivaron en un medio RPMI-1640 suplementado con suero de ternera fetal 10%.
análisis de microarrays
ARN total de 60As6, 60As6Luc, HSC-60, y las células HSC-60Luc se aisló mediante la suspensión de las células en un tampón de lisis ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japón), seguido de precipitación con isopropanol. Se realizó análisis de microarrays dos veces mediante el uso del Genoma Humano U133 Plus 2,0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos de los proveedores. Los arreglos fueron escaneadas con un escáner GeneChip 3000 (Affymetrix), y los datos se analizaron mediante Microarray Suite versión 5.0 con la configuración por defecto de análisis de Affymetrix y de escala global como método de normalización. La intensidad media truncada de destino de cada matriz se fijó arbitrariamente a 1000. Todos los datos de microarrays se han depositado en una base de datos compatible con MIAME, GEO; número de acceso GSE53276. Por un cambio de 2 veces, se seleccionaron 684 genes como genes específicos para células 60As6 y 60As6Luc, y se seleccionaron 1150 genes de células HSC-60 y HSC-60Luc.
Los experimentos con animales
Seis C.B17 hembra /ICR-SCID (SCID /SCID) -Semana de edad (CLEA Japan, Japón) fueron criados en una temperatura ambiente con un ciclo diario de 12 h de luz /oscuridad. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos y proporcionan alimentos estériles, agua y jaulas. 1 × 10
4-1 × 10
6 de las células cancerosas fueron suspendidos con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se inyecta en la cavidad abdominal mediante el uso de una aguja de 26 medio de calibre. Los ratones se pesaron y se midieron semanalmente. criterio del punto final cruel establecidos importante acumulación de ascitis abdominal, disnea, piloerección, anemia o pérdida de peso superior al 10% del peso inicial. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor y fueron aprobados por el Comité de Ética en Experimentación Animal del Centro Nacional del Cáncer. Se hicieron esfuerzos para reducir al mínimo el número y el sufrimiento de los animales utilizados en los experimentos.
RT-PCR
El ARN total se aisló mediante la suspensión de las células en un tampón de lisis ISOGEN seguido de precipitación con isopropanol. Semi-cuantitativos de RT-PCR se llevó a cabo dentro del rango lineal de 25 a 30 ciclos por
MUC5AC
,
CXCR4
,
CXCR7
,
CXCL12
,
LGR5
,
TGFBR1
,
TGFBR2
, y
ACTB
usando los siguientes cebadores: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'y 5'-3-GTTGTCCACATGGCTGTT '
MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3' y 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3 'para
CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3' y 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 'para
CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'y 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' para
CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'y 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' para
LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'y 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' para
TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'y 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' para
TGFBR2
, y 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'y 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' para
ACTB
.
inmunocitoquímica
inmunocitoquímica de inmunofluorescencia indirecta se realizó para CXCR4, MUC5AC, y Smad2 /3 en células cultivadas en portaobjetos de cámara de 4 pocillos. Las células se fijaron en 4% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 min. Después de tres tiempos de lavado en PBS (-), se incubaron con anticuerpo monoclonal CXCR4 anti-humano (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN), anticuerpo MUC5AC anti-humano (Santa Cruz Bioquímica, Santa Cruz, CA), o anti Smad2 /3 de anticuerpo humano (BD Biosciences, Bedford, MA) seguido de incubación con una dilución 1: 1000 de burro anti-ratón Alexa 488 conjugado con suero (Invitrogen, Grand Island, NY) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los núcleos celulares se tiñeron con 4 ', dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para el ensayo de células de linaje, clasificado sola CXCR4
+ células pequeñas se tiñeron por Green CellTracker (Invitrogen) para el seguimiento de las células viables.
La citometría de flujo y clasificación de células
células 60As6 (1 × 10
6 células) se co-incubaron durante 30 min a 4 ° C con los siguientes anticuerpos: APC anti-humano CD184 (CXCR4) (IgG2a, clon 12G5) o APC IgG2a de ratón, control de isotipo k obtenido a partir de BioLegend ( San Diego, CA). Las células muertas se marcaron con yoduro de propidio y excluidos del análisis. En la clasificación de células, las subpoblaciones CXCR4-positivas y CXCR4-negativas fueron purificados usando un clasificador de células JSAN (Bay Bioscience, Kobe, Japón), y se analizaron mediante un software, FlowJo (Árbol Star, Inc., Ashland, Oregón). Para los análisis del ciclo celular, las células se transfirieron a un medio libre de suero durante 5 días, y posteriormente se recogieron con 0,05% de tripsina-EDTA, y luego se suspendieron en etanol frío al 80%. Después de la fijación durante la noche a -20 ° C, las muestras se lavaron en PBS (-) y se incubaron en 500μl de PI /RNasa tinción Buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA) por 1 × 10
6 células para 30 min a temperatura ambiente antes del análisis. La citometría de flujo se realizó usando FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ), y se analizó mediante un software, FlowJo.
independiente del anclaje ensayo de crecimiento celular
un ensayo de formación de colonias en agar suave se llevó a cabo usando el kit de CytoSelect ensayo de 96 pocillos de transformación celular (célula Biolabs, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, se suspendieron 5 x 10
células pequeñas 3 CXCR4-positivos o CXCR4-negativos en DMEM que contenía 0,4% bajo punto de fusión de agarosa y FBS al 10% y se sembraron en 1% de agarosa de bajo punto de fusión que contiene DMEM y FBS al 10%. Después de incubar las células durante 5 días a 37 ° C en 5% de CO
2, las células se lisaron y se detectaron con colorante CyQuant GR. La fluorescencia de la colonia células formadoras fue leído en Multifuncional lector de microplacas (Safire, Tecan, Mannedorf, Swizerland) a longitudes de onda de excitación /emisión de 485/520 nm.
ensayo de invasión
invasión de la célula se determinó utilizando BD BioCoat tumor Invasion sistema de ensayo (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, 4 × 10
5 de células 60As6 con medio libre de suero fueron sembradas en la cámara superior del sistema. pocillos de fondo se llenaron con los medios con 10 ng /ml de SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 24 horas de incubación, las células en la cámara superior se retiraron y las células que invadieron a través de la membrana de Matrigel se tiñeron con Diff-Quick (BD Biosciences) y se contaron manualmente.
ensayo de caspasa
Las células 60As6 se prepararon en una placa de 96 pocillos (5 x 10
3 células /pocillo). El ensayo de caspasa 3/7 se realizó utilizando el caspasa-Glo 3/7 de ensayo (Promega, Madison, WI) a las 24 h después de la adición de TGF-β1 recombinante (amp 240-B, R &; D Systems) en el cultivo celular a una concentración de 2 ng /ml.
ensayos de crecimiento celular
Para determinar IC
50 valores contra docetaxel (Doc), ambas células HSC-60 y 60As6 se cultivaron en presencia de 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokio, Japón) durante 4 días a 37 ° C en 5% de CO
2 seguido por el ensayo MTT convencional. Para validar el tratamiento de combinación con Doc y TGF-β, todas las células 60As6 y 2 cultivos primarios (NSC-16C y -22C) se preparó en una placa de 6 pocillos (1 x 10
5 células /pocillo) seguido de un tratamiento con Doc (2,5 nM) y TGF-β1 (0 o 2 ng /ml) durante 72 horas a 37 ° C en 5% de CO
2. Las células se tiñeron con azul de tripano y se contaron con TC 20 Automated Cell Contador (Bio-Rad, Hercules, CA).
El análisis estadístico
Todos los datos se expresan como la media ± SE, y se analizaron usando la prueba t no pareada. El nivel aceptado de significación fue de
p Hotel & lt; 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) fue utilizado para todos los análisis estadísticos.
Resultados
Las diferencias fenotípicas entre los padres 60-HSC células y las células 60As6 sublínea altamente tumorigénicas
Para aborda el fenómeno de tipo difuso PD GC-asociado desde el punto de vista de la biología molecular y celular, establecimos una línea altamente peritoneal metastásico de células, 60As6, a partir de una línea celular derivada de tipo difuso GC, HSC-60, a través de
in vivo
selecciones que incluyen una inoculación ortotópico de las células tumorales y el aislamiento de los altamente metastásicos de la ascitis de ratones inmunodeficientes [25]. Aunque el tiempo de duplicación de estas dos líneas celulares era comparable (30 hr para HSC-60 y 31 h para 60As6)
in vitro
, las células 60As6 formados múltiples nódulos tumorales más rápidamente después de la inoculación intraperitoneal en los ratones. El tiempo medio de supervivencia fue de 167 días después de la implantación de 5 × 10
6 HSC-60 células, mientras que la implantación del mismo número de células 60As6 dio lugar a una notable formación de ascitis hemorrágica y el tiempo de supervivencia media fue de sólo 28 días. Anchorage-independencia puede ser necesaria para la supervivencia de las células cancerosas libres en la cavidad peritoneal y para la colonización. Ensayo de formación de colonias, las células 60As6 formaron muchas más colonias en comparación con HSC-60 células (S1 FIG) que muestran que 60As6 posee una alta capacidad de crecimiento independiente de anclaje. Hemos validado la quimio-resistencia también conocida como una importante característica de los CAC. Las células se cultivaron en presencia de docetaxel (DOC), que es un fármaco anti-cáncer frecuentemente empleado para el tratamiento de pacientes GC. 60As6 mostró un 6 veces superior IC
50 valor de Doc comparación con la de HSC-60 (52 nM y 8,4 nM, respectivamente) (Fig S2). Estos datos indican que 60As6 ha ganado una gran fenotipo quimioresistente. Además, la morfología de HSC-60 células se caracterizó como plana y grande, mientras que la de las células 60As6 era semi-flotante y pequeño, que es similar a la morfología menudo observada para células madre cancerosas (S3 FIG). A continuación examinó la localización balsas de lípidos usando cólera subunidad B de la toxina (CtxB) como un marcador de balsa lipídica, puesto que ya se ha informado de que las agrupaciones de balsas de lípidos fueron enriquecidos en células madre hematopoyéticas [29]. Se observó una acumulación de la fluorescencia de CtxB 60As6 células pero no en HSC-60, lo que sugiere otra propiedad CSC-como porque las primeras células (Fig S3)
.
Para evaluar las diferencias biológicas entre HSC-60 y 60As6 células, se compararon los perfiles de expresión génica de análisis de microarrays (Tabla S1). El descenso de regulación de tres marcadores de diferenciación celular a cielo gástrica (
MUC5AC
,
MUC1
, y
TFF1
) y citoqueratinas algunos fueron encontrados en 60As6. Por el contrario, varios marcadores de células madre (
LY75
,
CD44
,
GPNMB
, y
CXCR4
) se upregulated en esta línea celular. El perfil de expresión sugiere que 60As6 tiene un fuerte fenotipo mesenquimal, que es una característica de células madre cancerosas derivadas de células epiteliales.
Además, investigó la expresión de mRNA tanto de un típico marcador de diferenciación
MUC5AC
[3 , 4] y un receptor de quimioquinas asociados a metástasis
CXCR4
[30] por RT-PCR. De acuerdo con los resultados de microarrays,
MUC5AC
y
CXCR4 ARNm
mostraron una expresión mutuamente excluyentes en las CEH-60 y 60As6 (figura 1A). Una quimiocina SDF-1 codificada por
CXCL12
se sabe que se unen CXCR4 y sus afines del receptor CXCR7 [30]; Sin embargo, el ARNm de
CXCL12
y
CXCR7
no se detectaron en ninguna línea celular. La expresión tanto de MUC5AC y CXCR4 también se confirmó en un nivel de proteína por tinción inmunocitoquímica (Fig 1B). Por lo tanto, estos resultados sugieren que las células HSC-60 albergan células más diferenciadas que lo hacen las células 60As6, que están compuestos en su mayoría de las células indiferenciadas. En su conjunto, todas estas características CSC-como de 60As6 indican que la subpoblación indiferenciada con una alta tumorigenicidad y la resistencia a las drogas se podría enriquecer eficazmente a partir de células de los padres durante la
in vivo
selecciones.
(A ) RT-PCR de
MUC5AC
,
CXCR4
,
CXCR7
, y
CXCL12
en una línea celular GC HSC-60 y su sublínea 60As6. (B) La inmunocitoquímica de MUC5AC (panel izquierdo, verde) y CXCR4 (panel de la derecha, verde) en las células HSC-60 y 60As6, respectivamente. Los núcleos se counterstained con DAPI (azul). Las barras de escala representan 100μm. (C) La citometría de flujo análisis de CXCR4 en la superficie celular en las células 60As6. Los paneles interiores representan CXCR4
+ células pequeñas (I), CXCR4
- células pequeñas (II) y CXCR4
- células grandes (III) (Ci). Cada población celular se separó mediante FACS en su respectivo pureza (Ci-Civ). No se observaron células Immunopositive para MUC5AC en sólo el CXCR4
- fracción de células grandes (Civ, panel inferior, verde). Las barras de escala representan 50 micras. (D) Imágenes representativas Después de cultivar CXCR4
- pequeñas y grandes células durante 3 días. Las barras de escala representan 50 micras.
Identificación y caracterización de células madre cancerosas gástricas en 60As6 y células de cultivo primario
A continuación examinó el papel de CXCR4 en células de GC de tipo difuso para la EP. Como se muestra en la figura 1A, el receptor
CXCR4
fue altamente expresado en 60As6 comparación con HSC-60, mientras que su ligando
CXCL12 /SDF1
no era en ambos. Sin embargo, es de destacar que este ligando se sabe que se expresa en las células mesoteliales peritoneales [31] y para funcionar como una quimioquina para inducir metástasis a distancia a través de una interacción con las células cancerosas que expresan CXCR4 [30]. Por lo tanto, se examinó si CXCR4 podría servir como un marcador para la identificación de los CAC asociada a la DP. La expresión de CXCR4 en las células 60As6 se analizó mediante análisis de fluorescencia clasificación de células activadas (FACS). De acuerdo con la expresión de CXCR4 y el patrón de dispersión hacia adelante, las células 60As6 mostraron una heterogeneidad que consta de tres subpoblaciones diferentes: I. CXCR4
+ células pequeñas (15%), II. CXCR4
- células pequeñas (65%), y III. CXCR4
- células grandes (20%) (Fig 1CI). Las células se separan a continuación para cada subpoblación con una pureza de I: 97%, II: 99%, y III: 54%, respectivamente (Fig 1Cii-1cIV). La pureza de clasificación baja del CXCR4
- gran subpoblación de células III era atribuible a la contaminación con agregada CXCR4
- células pequeñas (Fig 1cIV, panel negro en caja). Entre estos tres subpoblaciones, sólo CXCR4
- gran subpoblación de células contenía MUC5AC
+ células diferenciadas (Fig 1cIV, tres paneles exteriores). Por vigilancia del crecimiento de células en un único nivel celular, se encontró que CXCR4
- pequeñas células proliferaron, mientras que el CXCR4
- células grandes no se sometieron a la división celular incluso 3 días después del cultivo (Fig 1D y S4 Fig). Estos hallazgos sugieren que CXCR4
- pequeñas células son células amplificadoras transitorias, mientras que el CXCR4
- células grandes son células diferenciadas terminalmente
Después de clasificar los dos subpoblaciones (I y II), analizamos. cualquier desplazamiento de la población de células (Fig 2A); después de 7 días de cultivo. CXCR4
+ pequeñas celdas correspondientes a subpoblación me genera a sí mismos, CXCR4
- células pequeñas, y CXCR4
- células grandes (11%, 62% y 21%, respectivamente), mientras que CXCR4
- células pequeñas correspondientes a subpoblación II fueron capaces de dar lugar principalmente a sí mismos (80%), con algunas células de gran tamaño (17%) y muy pocos CXCR4
+ células pequeñas (2%). Estos resultados sugieren que CXCR4
+ células pequeñas tienen potencial de diferenciación y producen CXCR4
- grandes células, posiblemente a través de una etapa de CXCR4
-. Pequeñas células en el esquema de la diferenciación celular
(A ) Tanto CXCR4
+ y CXCR4
- 60As6 células fueron ordenados por FACS (columna izquierda). Las células de cada fracción se cultivaron durante 7 días y luego se analizaron para los niveles de expresión de CXCR4 (columna derecha). (B) La inmunocitoquímica para MUC5AC (verde) de una colonia procedente de una sola CXCR4
+ de células pequeñas. Las barras de escala representan 50 micras. (C) ensayo de células de linaje con dos colores diferentes. individuales CXCR4
+ células pequeñas Sorted fueron teñidas por el anticuerpo anti-MUC5AC (rojo) y verde CellTracker (Invitrogen, verde) y para el seguimiento de las células viables durante 7 días. Las barras de escala representan 50 micras. (D) RT-PCR de
LGR5 Hoteles en células epiteliales gástricas normales (panel izquierdo), CXCR4
+ células pequeñas y CXCR4
- células pequeñas (panel derecho). microdisección láser separa la mucosa gástrica normal en tres regiones:. fosa, el cuello y la glándula
Además, una CXCR4
+ pequeña de una sola célula produce una colonia que contiene MUC5AC
+ células diferenciadas después 7 días en cultivo (Fig 2B). Este hallazgo fue apoyado por un ensayo de células de linaje combinado con tinción de células vivas y la inmunotinción de MUC5AC (Figura 2C). Además, CXCR4
+ se demostró que las células pequeñas de expresar un alto nivel de
LGR5
, que se conoce como un marcador de células madre epiteliales gástricas situados en la glándula de la mucosa normal [32] (Fig 2D ).
a continuación, se validó la independencia y la capacidad de anclaje iniciadoras del tumor de los dos subpoblación de células pequeñas (I y II). En el ensayo de formación de colonias, CXCR4
+ pequeñas células formó muchas más colonias que lo hizo el CXCR4
- células pequeñas (Figura 3A). experimentos de dilución en serie de la inoculación intraperitoneal en ratones inmunodeficientes revelaron que CXCR4
+ células pequeñas también poseía una mayor capacidad tumorigénico (desarrollo de tumores en 4/5 y 1/5 ratones tras la inoculación de 10
5 y 10
4 células, respectivamente) en comparación con el CXCR4
- células pequeñas (1/10 y 0/10 ratones después de 10
5 y 10
4 células, respectivamente) (Fig 3BI). Cabe destacar que los cinco ratones portadores de tumores después de la inoculación de CXCR4
+ células pequeñas tenían múltiples nódulos tumorales (Fig 3Bii), y comenzaron a desarrollar ascitis hemorrágica dentro de 3 semanas (Fig 3Biii).
(A) imágenes representativas de crecimiento independiente de anclaje de CXCR4
+ células pequeñas y CXCR4
- pequeñas células en ensayo de formación de colonias (izquierda). El análisis cuantitativo del crecimiento celular usando CyQuant GR colorante (derecha) (n = 3, media ± SE; *** p & lt; 0,001). Las barras de escala representan 200μm. frecuencia de formación (B) Tumor de CXCR4
+ células pequeñas y CXCR4
- grandes células en ratones de xenoinjerto (BI). Los paneles inferiores muestran los hallazgos macroscópicos representativas de múltiples nódulos tumorales (Bii, punta de flecha) junto con el intestino y ascitis hemorrágica (BIII) en un ratón SCID /SCID. (C) RT-PCR (panel izquierdo) y tinción inmunocitoquímica (paneles de la derecha) de CXCR4 (verde) y CXCR7 (verde) en células de cultivo primario GC (NSC-20C). La barra de escala representa 200μm. Análisis de citometría de (D) de flujo en células primarias cultivadas GC (NSC-20C) (DI) y según CXCR4
+ células después de cultivar durante 14 días (DII). ensayo de formación de colonias de CXCR4
+ y CXCR4
- pequeñas células derivadas de células NSC-20C (n = 3, media ± SE; **
p Hotel & lt; 0,005). (Diii)
Además de difuso de tipo líneas celulares de GC, que también investigó el papel de CXCR4 en una muestra clínica (NSC-20C): un cultivo primario establecido a partir de la ascitis de un paciente GC-tipo difuso con PD. En RT-PCR y experimentos de inmunotinción, se confirmó que el cultivo primario expresar
CXCR4
pero no
CXCR7 gratis (Figura 3C). Es importante destacar que, CXCR4
+ pequeñas células clasificadas de NSC-20C poseían tanto una capacidad de repoblación (Fig 3Di y 3DII) y una alta capacidad de formación de colonias (Fig 3Diii).
Participación del CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 eje en la EP
en otras seis líneas celulares derivadas de GC de tipo difuso (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, y KATO III), se investigó aún más la relación entre el estado de la expresión de SDF-1 /receptores dos CXCL12 (CXCR4 y cxcr7) y la acumulación de ascitis en ratones inoculados con las células de cáncer por vía intraperitoneal. Los experimentos de RT-PCR reveló que dos líneas de células GC (HSC-39 y KATO III) altamente expresado
CXCR4 gratis (figura 4A). Por otra parte, ambos de estos ratones xenoinjertados tenían múltiples nódulos tumorales y ascitis acumulada (Fig 4B). Por el contrario, las otras dos líneas celulares (HSC-44 y HSC-58) no mostraron o expresión CXCR4 bastante baja, un único o pocos nódulo tumoral peritoneal y no se acumulan ascitis (Fig 4B). También confirmó la acumulación de ascitis en otra sublínea altamente metastásica peritoneal-58As9 (derivado de HSC-58), que expresa
CXCR7
en un nivel alto, pero no
CXCR4
. Un caso excepcional fue 44As3 derivado de HSC44 que tenía múltiples nódulos tumorales y ascitis acumulados sin la expresión de ambos
CXCR4
y
CXCR7
. En general, hemos encontrado una alta correlación entre el nivel de expresión de
CXCR4
o
CXCR7
y los fenotipos agresivos en siete de las ocho líneas celulares, excepto 44As3.
(A) RT-PCR de
CXCR4
y
CXCR7 Hoteles en 6 líneas celulares derivadas de tipo difuso GC. (B) los hallazgos macroscópicos de ascitis hemorrágica y múltiples nódulos tumorales (punta de flecha o un círculo de puntos) en ratones SCID /SCID formados dentro de 3 semanas después de la inoculación de cada línea celular.
En la práctica clínica, la citología de lavado peritoneal (CY) proporciona información pronóstica importante para pacientes con cáncer gástrico, ya que puede detectar la "semilla" de la EP antes de su manifestación macroscópica. Incluso en los casos sin PD (P0), los pacientes CY-positivas tienen un mal pronóstico [33], lo que sugiere que un buen número de células madre cancerosas metastásicas están presentes en el lavado peritoneal de estos pacientes. Por lo tanto, el próximo investigó la presencia de CXCR4
+ células GC en los lavados peritoneales de los pacientes sin ascitis clínicamente aparentes.
CXCR4
ARNm fue rara vez se detecta en los lavados en 9 de 10 pacientes CY-negativos; sin embargo, el ARNm se detectó en los lavados en 19 de 34 pacientes CY-positivos (S5A FIG). También confirmó la presencia de la CXCR4 y pequeñas células GC-doble positivas de citoqueratina en las células mesoteliales en forma de adoquines-unidos a la superficie de la placa de cultivo en un corto plazo (7 días) la cultura de la ascitis del paciente (Fig S5B). En nuestros experimentos, las células mesoteliales peritoneales por lo general desaparecieron en cultivo a largo plazo después de aproximadamente un mes. En tal cultivo a largo plazo, también encontramos la presencia de algunas células CXCR4- o GC-CXCR7 altamente positivos que mostró unas características para la transición epitelio-mesenquimal, vimentina (VIM) (cabeza de flecha en la figura S5C) -positivo pero citoqueratina (PAN )-negativo. Por lo tanto, CXCR4 células
+ GC están presentes en las ascitis maligna no sólo en la etapa inicial de diseminación peritoneal (P0 /CY
+), sino también en las etapas más progresiva que se caracteriza por una acumulación de ascitis manifiesta. En suma, la evidencia experimental y clínica anterior sugiere que una parte de CXCR4
+ o CXCR7
+ células GC tienen un potencial para el desarrollo de la metástasis peritoneal.
A continuación se investigó el papel funcional de la CXCR4 vía de señalización en la EP. La expresión de
CXCL12
/
SDF-1