Extracto
de CD8
epítopos de células T + que pueden inducir a las células T a matar las células tumorales es un paso fundamental para el desarrollo de una vacuna contra el cáncer de péptidos. proteína POTE es un antígeno de cáncer recientemente identificados que se encontró que se expresa en una amplia variedad de cánceres humanos, incluyendo el de próstata, colon, pulmón, mama, ovario y páncreas. Aquí, determinamos epítopos citotóxicos restringidos por HLA-A2.1 de linfocitos T (CTL) en la proteína POTE, y también epítopos mejorados diseñado por aminoácidos (AA) sustituciones. Cinco péptidos 9-mer fueron seleccionados primero y su afinidad de unión a las moléculas HLA-A2 se midió por el ensayo de unión a T2. POTE 272-280 y 323-331 POTE mostraron la afinidad de unión de HLA-A2 más fuerte. AA péptidos sustituidos POTE 252-9V (con valina en la posición 9), POTE 553-1Y (con tirosina en la posición 1) y POTE 323-3F (con fenilalanina en la posición 3) confieren mayor afinidad por HLA-A2, y las respuestas de CTL inducidas reactividad cruzada con antígenos de tipo salvaje. Mientras POTE 252-9V fue el más fuerte en este sentido, POTE 323-3F tuvo el mayor aumento de la inmunogenicidad en comparación con el tipo salvaje. Es importante destacar que, dos epítopos modificados (POTE-553-1Y y POTE-323-3F) CTL inducidos en los que murieron NCI-H522, un POTE que expresan HLA-A2
+ línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano, lo que indica endógenos naturales procesamiento de estos epítopos. En conclusión, la inmunogenicidad de epítopos pote se puede mejorar mediante la modificación del péptido para inducir las células T que destruyen las células cancerosas humanas. Una combinación de POTE 553-1Y y POTE 323-3F epítopos podría ser una estrategia de vacuna atractiva para los pacientes con cáncer de HLA-A2 para superar la tolerancia inducida por los tumores y evitar la fuga
Visto:. Huang YH, Terabe M, Pendleton CD, Stewart Khursigara D, Bera conocimientos tradicionales, Pastan I, et al. (2013) Identificación y Mejoramiento de HLA-A2.1-Restringido epítopos CTL en un Nuevo Humano del Cáncer Antígeno-POTE. PLoS ONE 8 (6): e64365. doi: 10.1371 /journal.pone.0064365
Editor: Vladimir Brusic, Instituto de Cáncer Dana-Farber, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Enero, 2013; Aceptado: April 13, 2013; Publicado: 4 de Junio, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Dr. Yi-Hsiang Huang fue apoyado por Taiwán Beca Mérito (TMS-094-2-B-015) y el Instituto Nacional del Cáncer de financiación habitual el Centro de Investigación del cáncer del NCI, Instituto Nacional del cáncer, NIH, Bethesda, Maryland, EE.UU.; y por la financiación de Taipei el Hospital General de Veteranos (V97S5-002, V100C-104 y V101C-147). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La mayoría de los cánceres no pueden ser resección curativa excepto cuando se detecta a tiempo. Otros enfoques no quirúrgicos, como la radioterapia o la quimioterapia, también afectan a las células normales y dan lugar a efectos secundarios que limitan el tratamiento. Además, todos los tratamientos para el cáncer recurrente o metastásico son paliativos. En consecuencia, desarrollo de nuevos enfoques sistémicos para el tratamiento de avanzada, se necesita cáncer recurrente o metastásico. La inmunoterapia puede tener un gran potencial como un tratamiento prometedor para los pacientes de cáncer a causa de su especificidad y la ausencia de efectos tóxicos de la quimioterapia. Desde sipuleucel-T se convirtió en la primera vacuna contra el cáncer con licencia en los Estados Unidos [1], [2], ha habido un interés renovado en vacunas contra el cáncer en gran medida [3] - [5]. Por lo tanto, los antígenos tumorales nuevos específicos para determinados tipos de cáncer son de gran interés.
CD8
+ CTL puede reconocer y matar específicamente células tumorales que expresan péptidos de antígenos asociados a tumores presentados por moléculas de MHC de clase I. Por lo tanto, la mayoría de las estrategias de inmunoterapia del cáncer actuales se centran en la inducción de los CTL que lisan células tumorales [6]. la inmunoterapia del cáncer específico de antígeno a menudo se basa en la identificación de epítopos expresados por las células de cáncer que se pueden utilizar como objetivos para CD8 + células T
. Sin embargo, los epítopos naturales de CTL de cáncer no siempre son óptimas debido a que el repertorio de CTL contra epítopos de alta afinidad es a menudo hacer tolerante [7]. mejora de epítopos, por medio de la modificación de la secuencia de AA de epítopos, se ha desarrollado para mejorar la eficacia de las vacunas, principalmente mediante el aumento de la afinidad de los péptidos por moléculas MHC [3], [8]. Las vacunas de péptidos han mostrado recientemente muy prometedores en los ensayos clínicos [9].
El descubrimiento de los antígenos específicos del tumor es fundamental para el desarrollo de una inmunoterapia eficaz del cáncer [5]. Recientemente, un antígeno asociado a tumor novedoso, POTE, se identificó a partir de una variedad de cánceres humanos [10], [11]. Este antígeno tumor se llama POTE porque estaba en primera encontrado que se expresa en la próstata normal, ovario, testículo, y tejidos de la placenta, así como en el cáncer de próstata [10]. Se encontró que la familia de genes POTE dispersa entre ocho cromosomas diferentes (2, 8, 13, 14, 15, 18, 21, y 22) con diferente longitud de los ARNm [12]. Sin embargo, la secuencia de cDNA POTE entre varios cromosomas es muy homogénea con la divergencia de menos de 10% [11]. Estudios posteriores revelaron que los genes Poté se expresa no sólo en el cáncer de próstata, sino también en una amplia variedad de tumores malignos humanos, incluyendo cáncer de mama, colon, pulmón, ovario y páncreas [11]. Hay distintos patrones de expresión de POTE en tejidos y tipos de cáncer [11] normales. Entre los diversos tipos de cáncer, los parálogos pote en el cromosoma 2 (POTE-2γ) son la expresión más frecuencia.
Debido POTE ARNm es detectable sólo en un número limitado de tejidos humanos normales (de próstata y los testículos en el macho, y el ovario y la placenta en la mujer), la proteína POTE se considera como un miembro de la familia de antígenos del cáncer de testículo [11]. La expresión de antígenos de cáncer de testículo-en la placenta o los testículos no debe conducir a la activación de células T debido a la muy baja expresión de moléculas MHC de clase I en estos tejidos [13], [14]. Para los pacientes con cáncer, algunos reactividad frente a la próstata o de mama tejido es aceptable, como tampoco lo son los tejidos vitales. Por otra parte, para los pacientes con cáncer de mama o cáncer de próstata, la próstata en el varón y de mama en la mujer debería haberse resecado quirúrgico o irradiado. Las preocupaciones de reacción autoinmune en ambos tejidos no serían un impedimento en el tratamiento del cáncer que amenaza la vida. Por lo tanto, el antígeno POTE debería ser un objetivo atractivo para la inmunoterapia de estos tipos de cáncer
.
En este estudio, se determinó primero epítopos restringidos por HLA-A2 desde POTE (2γ), y sus inmunogenicidades se probaron en ratones transgénicos AAD ratones que tienen una clase I del MHC quimérico molécula compuesta de dominios a1 y a2 de HLA-A2 y dominio α3 de D
d [15]. A continuación, hemos mejorado su unión a moléculas HLA-A2.1 de mejora epítopo para que los epítopos más inmunogénicas, sin perder la capacidad de las células CD8 específicas
+ células T para reconocer el epítopo de tipo salvaje en un grado significativo. Por último, confirmamos los epítopos modificados indujeron CTL que mataron a las células cancerosas humanas.
Materiales y Métodos
Animales
ratones AAD [15] que expresa un quimérico HLA-A2.1 transgén con los a1 y a2 dominios de HLA-A2.1 y el dominio α3 de H-2D
d, para permitir la unión de ratón CD8, en un fondo C57BL /6, se utilizaron en estos experimentos. Partes de los experimentos se repitieron en HHD-2 ratones (un regalo de Dr. François Lemmonier, Institut Pasteur), que expresan quimérico humano HLA-A2.1 con el β2m humano covalente, sin ninguna clase I molécula murina [16] - [ ,,,0],18]. Los ratones fueron criados y alojados en instalaciones de cuidado de los animales apropiados. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados de la institución.
Los péptidos
Los péptidos en este estudio se sintetizaron en un Modelo Sintetizador de Péptidos Symphony (Perkin-Elmer, Boston, MA) utilizando tecnologías convencionales fluorenilmetoxicarbonilo (f-MOC) la química y escindió de la resina con ácido trifluoroacético. La pureza y la concentración molar se analizaron por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa en una columna C18 usando un gradiente de ácido trifluoroacético al 0,1% en agua y ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo y se purificó adicionalmente por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa preparativa usando un gradiente similar.
Líneas celulares
La línea celular T2 es deficiente para las proteínas transportadoras TAP1 y TAP2 y expresa bajos niveles de HLA-A2 [19]. La línea celular C1R.AAD se deriva de la línea celular linfoblastoide B humana HMYC1R transfectadas con la molécula HLA quimérico que contiene a1 y a2 dominios de HLA-A2.1 humano y α3 de H-2D
d ratón, un regalo del Dr . V. Engelhard (Universidad de Virginia, Charlottesville, VA) como se describe anteriormente [15]. La línea celular C1R.A2.1 (un regalo del Dr. William Biddison, NINDS, NIH) también se deriva de HMYC1R transfectadas con HLA-A2.1 [20], [21]. células C1R.AAD y C1R.A2.1 se mantuvieron en medio completo que consiste en 10% de FCS-RPMI 1640, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales (biofluido, Rockville, MD), glutamina 4 mM, penicilina 100 U /ml, 100 mg /ml de estreptomicina y 50 mM 2-ME. NCI-H522 (POTE
+ /HLA-A2
+) se mantuvo en medio completo. HTB-19 (POTE
+ /HLA-A1
+) se mantuvo en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) con 5% de FCS. MDA-MB-231 (POTE
- /HLA-A2
+) se mantuvo en 10% FCS-DMEM
ensayo de unión a T2
Péptido capacidad de unión al.. molécula HLA-A2 se midió utilizando la línea celular T2 de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente [19], [22]. células T2 (3 × 10
5 células /pocillo) se incubaron durante la noche en placas de 96 pocillos con medio de cultivo (01:01 mezcla de RPMI 1640 aminoácidos de /Eagle-Hank que contenía suero bovino fetal 2,5%, 100 U /ml penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina) con 10 mg /ml β2-microglobulina (Sigma) y diferentes concentraciones valoradas de péptidos (a partir de 100 m con 2 veces la dilución en serie) como se muestra en las figuras para determinar la concentración que da un 50 % de aumento en la unión (ver más abajo). Las células se lavaron una vez con HBSS frío que contiene 0,1% de BSA y se incubaron durante 30 min a 4 ° C con anticuerpo monoclonal anti-HLA-A2.1 (BB7.2 clon) (dilución 1:40 de sobrenadante de hibridoma). Después del lavado, las células se tiñeron con anticuerpo de cabra marcado con FITC anti-inmunoglobulina de ratón (BD, San José, CA), y el nivel de expresión de HLA se midió por citometría de flujo. la expresión de HLA-A2 se cuantificó como el índice de fluorescencia (FI) de acuerdo con la siguiente fórmula: FI = (intensidad de fluorescencia media geométrica con el péptido - intensidad de fluorescencia media geométrica sin péptido) /intensidad de fluorescencia media geométrica sin péptido. La fluorescencia de fondo sin BB7.2 se restó de cada valor individual. Para comparar los diferentes péptidos, FI
0,5, la concentración de péptido que aumenta la expresión de HLA-A2.1 por un 50% en no fondo péptido control, se calculó a partir de la curva de titulación para cada péptido. Cabe señalar que el FI
0.5 proporciona una medida relativa de la afinidad de péptidos o potencia entre los péptidos en comparación lado a lado, pero no se puede tomar como una afinidad termodinámica.
Vacunas
AAD o HHD-2 ratones se inmunizaron sc en la base de la cola con 100 l de una emulsión que contiene 01:01 adyuvante incompleto de Freund (Sigma) y PBS con péptidos y citocinas (50 nmol de CTL epítopo, 50 nmol de virus de la hepatitis B core 128-140 epítopo ayudante, 5 g de ratón interleucina 12, y 5 g de granulocitos macrófagos, factor estimulante de la colonia de ratones). Las citoquinas se adquirieron de Peprotech (Rocky Hill, NJ). Los ratones se reforzaron 2 semanas más tarde, y los bazos se retiraron 2 semanas después del refuerzo. Para todos los experimentos, se utilizaron grupos de tres ratones
interferón gamma ELISPOT ensayo
El número de células secretoras de IFN-gamma se determinaron mediante un kit ELISPOT (Mouse IFN-gamma ELISPOT Sixpak.; R & amp; D, Minneapolis, MA) o por un conjunto de anti-ratón de recubrimiento IFN-γ (AN18) y la detección (R4-6A2) anticuerpos monoclonales (Mabtech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dos semanas después de la última inmunización, las células del bazo se cultivaron en placas recubiertas de anticuerpo en 200.000, 100.000 y 50.000 células /pocillo y se estimularon con 200.000 células de bazo naïve pulsadas con péptido /pocillo con la concentración indicada de péptidos durante 2 horas. Después de una noche de incubación a 37 ° C, las placas se lavaron y se añadió anticuerpo de detección. Un módulo de color azul ELISPOT (R & amp; D) se utilizó para el desarrollo de color. Las manchas fueron leídos por un lector de ELISPOT (AID). Todas las muestras se analizaron por triplicado.
In vitro
Estimulación y Ensayo de citotoxicidad
Los esplenocitos de los ratones inmunizados se volvieron a estimular los esplenocitos con cargadas con péptido (1 M). En el día 1 y día 5, se añadió Rat T Stim (BD Bioscience) como fuente de IL-2. Una semana más tarde, la actividad de CTL se midió usando un ensayo de liberación de 4-h
51Cr. Las células diana (10
6) se pulsaron con péptidos en 200 l de medio de células T completa y 150 Ci de
51Cr durante 2 h, se lavó tres veces, y se añadió a 3000 células /pocillo a la ronda de 96 pocillos -fondo placas con diferentes proporciones E /T. El porcentaje de liberación específica
51 Cr se calculó como 100 x [(liberación experimental - liberación espontánea) /(liberación máxima - liberación espontánea)]. La liberación espontánea se determinó a partir de células diana incubadas sin células efectoras y la liberación máxima se determinó en presencia de 5% de Triton-X. líneas celulares C1R.AAD o C1R.A2.1 con o sin péptidos o células de cáncer de humanos sin péptidos se utilizan como objetivos. C1R.AAD o líneas celulares C1R.A2.1 no expresan ninguna otra molécula MHC, ya sea de clase I o clase II, además de HLA-A2, por lo que no están sujetas a las preocupaciones sobre alo o xenoreactivity. células de cáncer humano se preincubaron con 1000 ng /ml de IFN-γ humano por 72 h antes del ensayo [23].
HLA-A2 /péptido tetrámero Complejos
clase tetramérico MHC I /péptido complejos obtenidos del Fondo para el NIH tetrámero se sintetizaron como se describe anteriormente [24], [25]. Brevemente, las moléculas de HLA-A2 de cadena sencilla purificados fueron sintetizados por un sistema de expresión procariota (pET; R & amp; D Systems, Minneapolis, MN). La cadena pesada fue modificado que contiene el sitio de Bir-A biotinilación enzimática. De una sola cadena pesada-cadena β2-microglobulina y péptido se replegaron por dilución en un sistema tampón redoxshuffling. El producto replegado se biotiniló por Bir-A en presencia de biotina ligasa (Avidez, Denver, CO). conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) se añadió en una relación molar 1:04. Per-CP anti-ratón marcada CD8 (BD Pharmingen) y el panel de selección de TCR Vβ (BD Pharmingen) se utilizaron para detectar el repertorio TCR de la CTL.
Mejora de epítopos
Para mejorar la unión de los epítopos Poté a HLA-A2, se analizaron las secuencias de residuos de anclaje primarios y secundarios que podrían ser subóptima, en base a las anclas primarias y secundarias definidas [26], [27], y los péptidos sintetizados con solo sustituciones AA para remediar estas deficiencias . Estos fueron probados empíricamente como se describe en los resultados para la unión y la inmunogenicidad y para la actividad de los CTL inducidos.
Declaración de Ética
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de Instituto nacional del cáncer, NIH y el hospital de Veteranos de Taipei general.
Resultados
Predicción restringidos por HLA-A2.1 Los epítopos
La secuencia prototipo del POTE contiene 584 residuos de AA (número de acceso AY172978, ref [12]). Cinco péptidos 9-mer se seleccionaron en primer lugar sobre la base de residuos de AA de anclaje que determinar la unión a moléculas HLA-A2 y tres algoritmos predictivos [22], [26], [28] - [32]. La puntuación Parker se basa en un tiempo medio previsto de la disociación de las moléculas de clase I HLA utilizando una matriz de AA en cada posición en la secuencia basada en péptidos de unión conocidos, y un puntaje mayor a 100 se sugiere como aglutinante potencial. El segundo algoritmo fue desarrollado por el Dr. Zhiping Weng, que se basa en la programación lineal para la predicción de péptidos de unión a HLA-A2 (http://zlab.bu.edu/SMM/). A En (IC50) menor que 8 se prevé que sea un aglutinante de HLA-A2. La puntuación SYFPEITHI fue desarrollado por el laboratorio de Hans-Georg Rammensee [29] (http://www.syfpeithi.de/). Un SYFPEITHI puntuación superior a 21 predice un potencial epítopo HLA-A2. Si la secuencia se sugirió como un aglutinante por uno cualquiera de los algoritmos de predicción, se utilizó el péptido para siguiente estudio. Como se muestra en la Tabla 1, las predicciones no eran completamente consistentes entre los tres algoritmos.
Determinar la afinidad de unión del POTE péptidos a HLA-A2 moléculas
La afinidad de unión de los péptidos predichos con la molécula HLA-A2 se midió por el ensayo de unión de T2. Como se muestra en la Figura 1A, POTE 323-331 y 272-280 POTE mostraron la afinidad de unión más fuerte para la molécula HLA-A2 con un FI
0,5 de 0,8 M y 0,9 M, respectivamente. POTE 252-260 y 553-561 fueron POTE ligantes intermedios con FI
0,5 de 1,6 M y 5,6 M, respectivamente. Debido POTE 222-230 es un aglutinante débil con una IF
0,5 torno a 42,4 M, esta secuencia tiene pocas posibilidades de unirse y ser presentado por moléculas HLA-A2 de CD8 + células T
. aglutinantes buenas e intermedios fueron elegidos para estudios de inmunogenicidad en ratones transgénicos HLA-A2.
(A). La afinidad de unión de HLA-A2 de la 5 predijo epítopos Poté se confirmó mediante ensayo de unión a T2. El FI calculado
0,5 para POTE 222, 252, 272, 323 y 553 eran aproximadamente 42,4 M, 1,6 M, 0,9 M, 0,8 M y 5,6 M, respectivamente. La afinidad de unión de los sustituidos POTE 252 péptidos (B), el sustituidos POTE 553 péptidos (C) o los sustituidos POTE 323 péptidos (D) para las moléculas HLA-A2. Cada ensayo se realizó por triplicado, y los datos de esta figura son representativos de dos experimentos con resultados similares. La inmunogenicidad del epítopo POTE 272 en ratones AAD (E). Se inmunizaron ratones con 50 nmol de POTE 272 en 100 l de la emulsión, y los objetivos se pulsaron con 1,0 M POTE272. Las manchas se contaron mediante un lector de ELISPOT (sistema de lector de ELISPOT AID). Las cifras muestran que el número de puntos por millón de células. (F) la reactividad de CTL en POTE 272 péptido. En una hora 4
ensayo de liberación de 51Cr, las células CIR.AAD se pulsaron con 1,0 M POTE 272 péptido y se marcaron con
51 Cr. Después de lavar tres veces, las células diana se mezclaron con diferentes cantidades de células efectoras y luego se cultivaron durante 4 horas antes de la cosecha.
Epítopo Enhancement para aumentar la afinidad de unión de péptidos POTE para HLA-A2 moléculas
células T específicas para la auto-péptidos con buena capacidad de unión con MHC de clase I molécula son frecuentemente seleccionados negativamente [7]. péptidos asociados a tumores que presentan MHC de clase I intermedia afinidades de unión podrían ser preferibles como candidatos vacunales. Además, el MHC de clase I de unión y la inmunogenicidad de tales aglutinantes de afinidad intermedia se pueden mejorar mediante la sustitución de AA ancla primaria o secundaria con los de unión más óptimos, una mejora epítopo procedimiento llamado. Hicimos péptidos con sustituciones de AA para insertar conocidos buenas residuos de anclaje primario o secundario cuando estos no eran ya presente, basado en los informes anteriores [26], [27]. Por lo tanto, hemos hecho tales modificaciones de ligantes intermedios, POTE 252 y POTE 553, y de nuevo se determinó la afinidad de unión con moléculas de HLA-A2 por el ensayo de unión T2. Además de los ligantes intermedios, también hemos hecho sustituciones de AA en uno de los mejores ligantes, POTE 323, para examinar si la modificación podría mejorar aún más su afinidad de unión a las moléculas HLA-A2. Como se muestra en la Tabla 2, se hicieron sustituciones de AA en primaria (posición 2 y el extremo C terminal) o secundaria (posición 1, 3 y 7) residuos de anclaje para las moléculas HLA-A2 si los residuos nativos no estaban ya óptima [22], [ ,,,0],26], [28], [30]. No probamos para mejorar POTE 272 como se juzgó que era poco probable que mejorar sustancialmente.
Cinco péptidos modificados fueron generados con respecto al ligante intermedia, POTE 252. Como se mostró en la figura 1B, tanto POTE 252-9V y POTE 252-1Y tenían mejor afinidad de unión a moléculas HLA-A2 que el tipo silvestre, POTE 252. el FI
0.5 del POTE 252-9V y POTE 252-1Y fue de 0,8 M y 0,9 M, respectivamente . Ambos eran casi 2 veces más baja (mayor afinidad) que la del péptido POTE 252.
Cuatro péptidos sustituidos se hicieron para otro aglutinante intermedio, POTE 553. Como se muestra en la Figura 1C, todos los péptidos modificados, POTE 553-1Y, POTE 553-2L, POTE 553-7A y POTE 553-3F tenían mejor afinidad de unión a moléculas HLA-A2 que el tipo silvestre POTE 553 péptido. La FI valores
0,5 de POTE 553-1Ywas 0,024 M.
Cuatro péptidos también se modificaron de la mejor aglutinante, POTE 323. Como se muestra en la Figura 1D, solamente POTE 323-3F podría mejorar la afinidad de unión a las moléculas HLA-A2, con la FI
0,5 M de 0,09, aproximadamente 3 veces mejor que el péptido de tipo salvaje.
la inmunogenicidad de un buen HLA-A2.1 Binder, POTE 272
Para probar la inmunogenicidad del péptido POTE 272, grupos de 3 ratones transgénicos AAD se inmunizaron con 272 POTE péptido por vía subcutánea. Dos semanas después del refuerzo, los esplenocitos de los ratones 3 se combinaron para medir su inmunogenicidad por
ex vivo
ensayo de IFN-γ ELISPOT y por el ensayo de CTL después de una semana
in vitro
estimulación. Como se muestra en la Figura 1E, POTE 272 indujo respuestas significativas de IFN-gamma después de la estimulación POTE 272. Después de una semana
in vitro
estimulación, CTL inducida con pote 272 lisaron las células diana pulsadas con POTE 272 (Figura 1F). Por lo tanto, POTE 272 es un epítopo inmunogénico en la proteína POTE. Sin embargo, CD8
+ células T específicas de antígeno propio con buena afinidad de unión pueden ser seleccionados negativamente o auto-tolerante, por lo POTE 272 puede no ser un buen candidato como una vacuna contra el cáncer de la proteína POTE, aunque esto aún no se probados.
la inmunogenicidad del tipo salvaje y mejorada POTE 252 y epítopos CD8
+ las respuestas de células T de reactividad cruzada
Tanto POTE 252-9V y POTE 252-1Y habían mejor unión afinidad a las moléculas HLA-A2 que el POTE 252 (Figura 1B). Como se muestra en la Figura 2A, tanto POTE 252 y POTE 252-9V indujeron un número significativo de manchas de IFN-γ con reactividad cruzada a ambos POTE 252 y POTE 252-9V. Aunque POTE 252-1Y tenía una afinidad de unión mejor a las moléculas HLA-A2 de POTE 252, no se detectaron respuestas significativas de IFN-gamma en el ensayo, incluso en presencia de péptido POTE 252-1Y. Después de 1-semanas de estimulación in vitro con el péptido cognado, CD8
+ CTL inducida con tanto de tipo salvaje POTE 252 y mejorado epítopo POTE 252-9V lisaron las células diana pulsadas con el tipo salvaje POTE 252, así como POTE 252-9V. Este resultado sugiere que los TCR de los CTL generados en ratones inmunizados con o bien de tipo salvaje o mejorado péptido podía reconocer el péptido de tipo salvaje (POTE 252) /MHC de clase I complejo (Figura 2B).
(A) Los ratones se inmunizados con 50 nmol de POTE 252 en 100 l de la emulsión, y los objetivos se pulsaron con 1,0 M POTE252. Las manchas se contaron mediante un lector de ELISPOT (sistema de lector de ELISPOT AID). Las cifras muestran que el número de puntos por millón de células. (B) CTL reactividad cruzada en cada péptido. Dos semanas después del segundo refuerzo, las células del bazo agrupados de tres ratones se volvieron a estimular con esplenocitos irradiados pulsados con 1,0 mM cada péptido durante 7 días. A continuación, se llevó a cabo de 4 horas
ensayo de liberación de 51Cr. (C) HLA-A2 /péptido tetramer manchas y determinación (D) de TCR repertorio para POTE 252- y los CTL inducidos por 252-9V POTE en la CH-2 ratones.
HLA-A2 de tetrámeros de maquillaje y Análisis de TCR Vβ Repertoire
el CTL inducida por POTE 252-9V fueron los más fuertemente de reacción cruzada con el antígeno POTE tipo salvaje. Asimismo, comparó la respuesta y el uso repertorio TCR de la POTE-específica CD8
+ células T de HHD-2 ratones inmunizados con POTE 252 y 252-9V. Como se muestra en la Figura 2C, 9,3% versus 6,8% de la CD8
+ células T fueron tetrámero positivo en grupos de inmunización POTE252 y POTE 252-9V, respectivamente. Al comparar el repertorio TCR de la CD8
+ tetrámero
+ células T entre los dos grupos, los datos (Figura 2D) mostraron que los CTL inducidos por POTE 252 fueron positivos para Vβ 6, 7, 8.1, 8.2, 9, 10, 11, siendo la mayoría, ya sea Vβ 6, 9, 10 o 11, mientras que los CTL inducidos por POTE 252-9V fueron positivos para Vβ 8, 9, 10, y 11, pero fueron abrumadoramente dominado por aproximadamente 80% positivas para Vβ10 y sólo una pequeña fracción de la expresión de los otros. Por lo tanto, los repertorios de TCR de las células CD8
+
tetrámero + células T eran diferentes entre el tipo salvaje y ratones inmunizados péptidos POTE mejoradas.
La inmunogenicidad del tipo salvaje y POTE Enhanced 553 y epítopos CD8
+ T entre células Respuestas
Todos los sustituidos POTE 553 péptidos mostraron mejor afinidad de unión a moléculas HLA-A2 que el POTE 553 (Figura 1C). Elegimos los dos mejores ligantes entre estos péptidos mejoradas, junto con el péptido de tipo salvaje, para probar las inmunogenicidades y respuestas de CTL con reactividad cruzada. Como se muestra en la Figura 3A y B, POTE 553 no indujo ningún respuestas significativas de IFN-gamma en cualquier concentración de péptido utilizado para la estimulación. Después de una semana
in vitro
estimulación, hay tampoco había ninguna lisis significativa de células diana detectable (Figura 3C). Por lo tanto POTE 553, como un aglutinante de HLA-A2 intermedia, no es inmunogénico. Tanto POTE 553-1Y y POTE 553-2L indujeron un cierto nivel de las respuestas de IFN-gamma sólo después de la estimulación con el mismo péptido (Figura 3A, B). En la Figura 3B, las células diana se sometieron a impulsos con diferentes concentraciones de péptido para demostrar que el péptido reforzada podría inducir a las células T de alta avidez para matar células diana en presencia de bajas concentraciones de antígeno. De acuerdo con la
ex vivo
IFN-gamma ensayo ELISPOT, no se detectó respuesta de reacción cruzada con el péptido de tipo salvaje en el CTL inducido por POTE 553-1Y o POTE 553-2L péptidos. Sin embargo, después de una semana
in vitro
estimulación, CD8
+ CTL inducidos con el epítopo mejorado POTE 553-1Y lisan células diana pulsadas con no sólo POTE 553-1Y, sino también pote pote 553 y 553- péptidos 2L, lo que sugiere que los TCR de los CTL reconoció el POTE 553 /MHC complejo de clase I, hasta cierto punto (Figura 3C). Desde este punto de vista, POTE-553-1Y podría ser una posible vacuna contra el cáncer alternativo contra el antígeno POTE. Aunque POTE 553-2L puede inducir ciertas respuestas de IFN-γ después de la estimulación con el mismo péptido (Figura 3A, B), CD8
+ CTLs inducidos con POTE 553-2L hicieron células diana no lisan pulsadas con POTE 553-2L (Figura sc 3C).
ratones fueron inmunizados AAD con una mezcla de péptidos y citocinas en adyuvante se describe en la sección Métodos. (A, B) Dos semanas después del segundo refuerzo, los esplenocitos agrupados de tres ratones se volvieron a estimular con esplenocitos de ratones AAD ingenuas pulsadas con 10 nM a 1000 nM de cada péptido en diferente E /relaciones de T (1000 nM se utilizó en el panel A) . Las manchas se contaron mediante un lector de ELISPOT (sistema de lector de ELISPOT AID). Las cifras muestran que el número de puntos por millón de células. (C) CTL reactividad cruzada en cada péptido. En una hora 4
ensayo de liberación de 51Cr, las células CIR.AAD se pulsaron con 1,0 M de cada péptido y se marcaron con
51 Cr. Después de lavar tres veces, las células diana se mezclaron con diferentes cantidades de células efectoras y después se cultivaron durante 4 horas antes de la cosecha.
La inmunogenicidad del tipo salvaje y mejorada POTE 323 y epítopos CD8
+ T Respuestas células beta de reactividad cruzada
POTE 323-3F era el único péptido modificado con una mejor afinidad de unión a HLA-A2 de tipo silvestre POTE 323 (Figura 1D). Como se muestra en la figura 4A, tanto POTE 323 y POTE 323-3F inducidos algunas respuestas IFN-gamma después de la estimulación con el péptido idéntico. A pesar de que el péptido POTE 323 fue el mejor aglutinante de HLA-A2 dentro de la secuencia POTE, sólo respuestas IFN-gamma marginales (menos de 2 veces sobre el nivel de fondo) se detectaron mediante el ensayo ELISPOT. Después de una semana
vitro
estimulación en, CTL inducida por POTE 323 fallaron para lisar células diana pulsadas con POTE 323. Esta respuesta negativa CTL podría ser debido a la pérdida de una parte sustancial de responder las células con alta avidez que podían han muerto durante la incubación con una alta concentración relativa de péptido (1,0 M). POTE 323-3F indujo puntos significativos de IFN-γ en virtud de la estimulación POTE 323-3F, y también se detectó algún grado de respuesta de IFN-γ después de la estimulación con el tipo salvaje POTE 323 epítopo. Después de
in vitro
estimulación con el péptido cognado, CD8
+ CTL inducidos con el epítopo mejorada POTE 323-3F lisaron las células diana pulsadas con el POTE 323-3F, así como de tipo salvaje POTE 323, lo que sugiere que los TCR de los CTL pueden reconocer el péptido de tipo salvaje (POTE 323) /MHC de clase I complejo (Figura 4B). POTE 323-3F era más inmunogénica en la inducción de CTL específicos para el epítopo de tipo salvaje que era el tipo salvaje epítopo en sí. Por lo tanto, POTE 323-3F podría ser un excelente candidato a vacuna a las células diana tumorales que expresan POTE.
ratones inmunizados por vía subcutánea AAD se con 50 nmol de péptido en 100 l de emulsión como se describe en la sección Métodos. (A) Dirigir ex vivo ensayo IFN-γ ELISPOT utilizando células diana pulsadas con péptido 1000 nM. Las cifras muestran que el número de puntos por millón de células. (B) CTL reactividad cruzada en POTE 323 y péptidos POTE 323-3F. (C) la citotoxicidad antitumoral contra una línea humana POTE-expresión de cáncer de pulmón de células NCI-H522 inducida por POTE 553-1Y, 323-3F y 252-9V. HHD-2 ratones fueron inmunizados con 50 nmol del péptido indicado en 100 l de la emulsión y se volvieron a estimular durante 7 días con 1.000 nM de péptido antes de ser probado para la capacidad para lisar las células tumorales. (D) Resumen de la citotoxicidad antitumoral en POTE que expresan y no POTE-expresión de células tumorales humanas. NCI-H522 es una línea de cáncer de pulmón humano que expresa tanto POTE y HLA-A2, mientras que HTB-19 es un carcinoma mamario humano que expresa POTE pero no HLA-A2, y MDA-MB-231 es una línea celular de carcinoma de mama humano que expresa HLA -A2 pero no POTE. Killing de sólo el primero de estos muestra la especificidad para POTE en combinación con HLA-A2. (Los valores negativos se deben a experimental
liberación de 51Cr ligeramente por debajo de la liberación espontánea sin células efectoras, dentro del error experimental, y por lo tanto deben ser consideradas como equivalentes a cero).
CTL inducidas por POTE Modificado péptidos contra células de cáncer humano
para servir como vacunas tumorales candidato, la inducción de citotoxicidad para matar las células cancerosas humanas es esencial. Tres líneas celulares de cáncer humano, NCI-H522 (células no pequeñas de cáncer de pulmón de células humanas, POTE
+ /HLA-A2
+), HTB-19 (carcinoma mamario humano, POTE
+ /HLA A1
+) y MDA-MB-231 (células de cáncer de mama humano, POTE
- /HLA-A2
+) fueron elegidos como células diana en este estudio. Como se muestra en la Figura 4C & amp;