Extracto
Aplicaciones
La recidiva local es la principal manifestación de fracaso del tratamiento en pacientes con carcinoma de laringe operable. factores clínico-patológicos establecidos no pueden predecir lo suficientemente pacientes que son propensos a reaparecer después del tratamiento. Por lo tanto, se requieren herramientas adicionales para identificar con precisión los pacientes con alto riesgo de recurrencia. Este estudio trata de identificar y validar de forma independiente los modelos de expresión génica, pronóstico de supervivencia libre de enfermedad (DFS) en el cáncer de laringe operable.
Materiales y Métodos
El uso de Affymetrix U133A Genechips, hemos perfilado dulce tejidos tumorales congelados procedentes de 66 pacientes con cáncer de laringe localmente tratados con cirugía. Se aplicó la regresión de riesgos proporcionales de Cox para identificar predictores de modelado de múltiples genes de recurrencia. modelos de genes fueron validados en dos cohortes independientes de 54 y 187 pacientes (conjuntos de validación de tejido fresco congelado y fijados en formalina, respectivamente).
Resultados
Nos centramos en los genes asociados con DFS univariately (
p Hotel & lt; 0,01) en el conjunto de entrenamiento. Entre varios modelos que comprenden un número diferente de genes, un modelo conjunto 30 de sonda demostró un rendimiento óptimo tanto en la formación (log-rank,
p Hotel & lt; 0,001) y 1
st validación (
p
= 0,010) fija. En concreto, en el conjunto de validación 1
st, la mediana DFS según lo predicho por el modelo de serie 30-sonda, fue de 34 y 80 meses para los pacientes de alto y bajo riesgo, respectivamente. razón de riesgo (HR) para la recurrencia en el grupo de alto riesgo fue de 3,87 (IC del 95%: 1,28 a 11,73, de Wald
p = 0,017
). Prueba de la expresión de genes seleccionados a partir del modelo anterior en el conjunto 2
nd validación, con qPCR, reveló asociaciones significativas de marcadores individuales, tales como ACE2, FLOT1 y PRKD1, con DFS paciente. Alta PRKD1 mantuvo un marcador pronóstico desfavorable en el análisis multivariante (HR = 2,00, IC del 95% 1.28 a 3.14,
p = 0,002
) junto con el estado de los ganglios positivos.
Conclusiones
Hemos establecido y validado modelos de genes que pueden estratificar con éxito a pacientes con cáncer de laringe, en función de su riesgo de recurrencia. Parece digno para validar de forma prospectiva la expresión PRKD1 como marcador pronóstico de cáncer de laringe, para aplicaciones clínicas rutinarias
Visto:. Fountzilas E, Kotoula V, Angouridakis N, Karasmanis I, Wirtz RM, Eleftheraki AG, et al. (2013) Identificación y Validación de un Multigenes predictor de recurrencia en cáncer de laringe primaria. PLoS ONE 8 (8): e70429. doi: 10.1371 /journal.pone.0070429
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de marzo de 2013; Aceptado: 18 Junio 2013; Publicado: 9 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Fountzilas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación interna Helénica Cooperative Oncology Group (HeCOG) (HE R_5G). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses: En el momento del estudio Ralph M. Wirtz y Elke Veltrup fueron empleados por Siemens Healthcare Diagnostics. En nombre de la Fundación Helénica para la Investigación del Cáncer, Atenas, Grecia, el autor principal (GF) ha solicitudes de patente pendientes con Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El cáncer de laringe es el tipo más común undécima de cáncer en los hombres en todo el mundo. Cada año 52.000 casos son diagnosticadas en Europa y 10.000 en los Estados Unidos [1], [2]. A pesar de los últimos avances en las técnicas diagnósticas y terapéuticas, la mayoría de los pacientes aún reaparecer después del tratamiento [3]. factores clínico-patológicos establecidos no pueden predecir lo suficientemente pacientes que se repita. Por lo tanto, se requieren factores adicionales para identificar con precisión los pacientes con mal pronóstico. De perfiles de expresión se ha usado con éxito en la estratificación de los pacientes de cáncer con pronóstico desfavorable [4], [5], [6], [7]. Estudios previos en cáncer de cabeza y cuello han relacionado los perfiles de expresión de genes para el estado ganglionar [8], [9], [10], metástasis a distancia [11], [12] y la supervivencia libre de enfermedad [13], [14], [15], [16]. Si bien estos estudios proporcionan una gran comprensión de la complejidad molecular de cáncer de cabeza y cuello no identificaron un robusto perfil genético. El uso clínico de estos modelos ha sido limitada por el gran número de genes, los conjuntos de datos de pequeño tamaño y la falta de reproducibilidad y validación independiente. Por otra parte, ninguno de estos estudios se centraron exclusivamente en el cáncer de laringe.
En el presente estudio, hemos tratado de identificar los genes de pronóstico de recurrencia en pacientes con cáncer de laringe primaria. El punto final de nuestro análisis fue la supervivencia libre de enfermedad (DFS). Estamos perfiladas muestras de tumores de dos cohortes independientes de pacientes que utilizan mundial de perfiles de expresión génica. El uso de la primera cohorte en su conjunto de entrenamiento, hemos identificado varios genes modelos de pronóstico, que luego fueron validados en la segunda cohorte de pacientes. Con el fin de validar nuestros resultados, hemos perfilado seleccionaron los genes de nuestros modelos para la expresión en relación con la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR) en una cohorte independiente de los pacientes.
Materiales y Métodos
población de estudio
Nuestro estudio se compone de 307 pacientes con diagnóstico de cancinoma laríngeo primario de células escamosas (conjunto de entrenamiento: 66, 1
conjunto de validación ST: 54 y 2
nd conjunto de validación: 187 pacientes ), con una mediana de seguimiento de 52, 33 y 89 meses, respectivamente. Todos los pacientes fueron sometidos a la extirpación quirúrgica del tumor en el Servicio de Otorrinolaringología del Hospital AHEPA en Salónica, Grecia, entre 1985 y 2008. administración postoperatoria de la radioterapia fue decidido por el médico tratante y más a menudo se le dio a los pacientes con márgenes tumorales positivos, pacientes con tumores T4 o aquellos con tumores supraglóticos T1 /T2 para los cuales no se ha hecho una linfadenectomía electiva profiláctica. Ninguno de los pacientes recibió terapia sistémica como parte de su tratamiento inicial. Este es el tratamiento de referencia actual en muchos países europeos [17], sin embargo, esto puede no ser el caso en otros países, como los EE.UU., donde el objetivo principal es la preservación de la laringe con quimiorradioterapia concomitante, precedida en algunos casos por inducción quimioterapia [18]. El seguimiento incluyó el examen físico, cada tres meses durante los tres primeros años y cada seis meses a partir de entonces. Se realizaron exámenes de imágenes, como se indica por los síntomas y el examen físico. demográficos detallados y las características clínicas de los pacientes con datos válidos de genes se enumeran en la Tabla 1, mientras que los datos de pacientes individuales se muestran como en la Tabla S1.
Tumor especímenes
tumoral fresco congelado muestras de tejido, a partir de pacientes que comprenden la formación y 1
conjuntos de validación st, se recogen de forma prospectiva en el momento de la cirugía, de 2004 a 2008, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan en -80 ° C hasta su procesamiento. muestras (FFPE) de tejido tumoral en parafina fijados con formol, de los pacientes que comprenden el 2
nd conjunto de validación, se recogieron de forma retrospectiva (pacientes tratados entre 1985 y 2008). Este último se fijaron en formalina durante al menos 6 horas antes de ser incluidos en parafina. tumores laríngeos fueron evaluados histológicamente y se verifican en todos los casos, incluyendo las muestras de tejido fresco congelado.
Declaración de Ética
muestras de tejido tumoral-frescas congeladas y FFPE fueron recogidos de acuerdo a los protocolos aprobados por el Institutional Junta de revisión del hospital "AHEPA" y el Comité de Bioética de la Universidad Aristóteles de Tesalónica, Escuela de Medicina. consentimiento informado por escrito para el uso científico de material biológico se obtuvo de todos los pacientes que comprenden la formación y la validación de sistemas 1
st y de los pacientes del 2
nd conjunto de validación tratada después de 2004. La omisión del consentimiento se obtuvo de la Comité de Bioética para los pacientes tratados antes de 2004 y para los que las muestras de tejido tumoral FFPE necesitaba ser recogidos de forma retrospectiva. Todas las investigaciones clínicas relacionadas con el presente estudio se han realizado de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki.
aislamiento de ARN a partir de tejido fresco congelado y perfiles de expresión génica global
El aislamiento de ARN a partir fresca muestras de tumor congelados se realizó mediante el protocolo de RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania), como se describe anteriormente [19]. la cantidad de ARN se determinó midiendo la absorbancia UV a 260 y 280 nm, mientras que la calidad del ARN se evaluó mediante un ARN Bioanalyzer 6000 kit LabChip Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). El ARN se transcribe de forma inversa, con la etiqueta y se hibridó a Affymetrix (Santa Clara, CA) arrays HG-U133A, como se describe anteriormente [19]. Los experimentos relativos a la formación y 1
conjuntos de validación st se llevaron a cabo por separado, en diferentes momentos, en Siemens Healthcare Diagnostic Products (Colonia, Alemania). Los datos de expresión génica se han depositado en el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología Expresión Génica Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y están disponibles a través del número de acceso de GEO serie GSE27020. En el siguiente enlace se ha creado para permitir la revisión de GSE27020: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dxcdxksauqicizy&acc=GSE27020
aislamiento de ARN a partir FFPE muestras de tejido tumoral y QRT-PCR
Todas las investigaciones que implican muestras de tejido FFPE se realizaron en el Laboratorio de Oncología Molecular, Fundación Helénica para la Investigación del cáncer de la Universidad Aristóteles de Tesalónica Escuela de Medicina. Para validar el valor pronóstico de genes derivados de nuestro análisis de microarrays, se utilizó una cohorte separada de los pacientes con material de tejido tumoral disponible. Este grupo muestra incluyó 187 muestras de tejido FFPE que fueron macrodissected en la evaluación histológica previa para contener & gt; 50% las células tumorales. Se aisló ARN después de la lisis del tejido durante la noche completa utilizando Trizol-LS (Life Technologies, Paisley, Reino Unido), como se describe anteriormente [20] y fue a transcripción inversa con superíndice III (Life Technologies), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ADNc se normalizaron a 25 ng /ul y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. la expresión de ARNm se investigó con ensayos de expresión de genes TaqMan® marcadas con FAM en reacciones de dúplex que implican un ensayo de referencia marcado-VIC-primer limitado para la beta glucuronidasa (GUSB, ensayo#Hs00939627_m1), como un control molde endógeno. GUSB se prefirió sobre los controles endógenos generalmente aplicados debido a que no han pseudogenes, hasta ahora, ha informado de este gen. Además, se ha identificado como uno entre los objetivos de mRNA mejor conservados en los tejidos FFPE [21]. qPCR ARNm objetivo de selección incluyó la evaluación de las 30 sondas de la firma U133A de genes duplicados, las características de genes (identidades génicas válida, el tipo de gen, variantes de empalme grabadas que no se pueden distinguir por la sonda en la matriz o por el ensayo qPCR), así como una paramétrico
p
-valor de & lt; 0,05 para factor de cambio en la expresión génica. De las 30 sondas de U133A, 23 permanecieron válido para la aplicación de QRT-PCR (Tabla 2). Para estos 23 objetivos, se realizaron búsquedas de ensayos pre-hechos TaqMan Gene Expression (Applied Biosystems) que se correspondería con las secuencias diana detectados por las sondas correspondientes de la matriz U133A. Fue posible recuperar 16 tales ensayos (Tabla 2). Duplex 10 reacciones ul se llevaron a cabo por duplicado, conteniendo cada uno 50 ng de plantilla, en un sistema ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems /Life Technologies) en un bloque de 384 pocillos en condiciones por defecto con 45 ciclos de amplificación, junto con una muestra de ARN de referencia ( TaqMan® control de ARN total, cat. 4307281, Applied Biosystems) y controles sin plantilla. El ARN de referencia se utilizó como control positivo y la placa para la evaluación del rendimiento del ensayo entre carreras (validación entre RUN). Dos de los 16 ensayos seleccionados dieron valores deltaRQ de & gt; 1,5 entre las diferentes carreras y, por lo tanto, algún error de validación inter-run y no fueron evaluados (Tabla 2) guía empresas
umbrales de ciclo (TC, lo que corresponde. CQ en las directrices MIQE) para cada objetivo y para la endógeno de referencia se obtuvieron de forma automática en condiciones predeterminadas y cuantificación relativa (RQ) se calculó en un modo lineal [22] restando (45-avg deltaCT), mediante el cual 45 fue la amplificación total número de ciclo y DCT = [(objetivo CT) - (CT GUSB)] promedio medio para los duplicados. Los criterios de elegibilidad para una evaluación adicional de la muestra incluyen los valores de CT GUSB & lt; 38 para cada reacción y deltaRQ para cada uno (variación intra-ejecución) duplicado de & lt; 0,8. Para 3 ensayos se obtuvieron curvas de amplificación para la FFPE y las muestras de referencia de ARNm, mientras que para un ensayo adicional se observaron altos diferencias intra-ejecutar valor de RQ, en 87% de las muestras (Tabla 2). Sobre la base de los pasos anteriores de filtrado para el ensayo y la elegibilidad de la muestra, finalmente fue posible evaluar los resultados RQ por sólo 10 genes.
Mediante la aplicación de los criterios anteriores para la elegibilidad de la muestra, se obtuvo el siguiente número de muestras informativas por ARNm objetivo (ensayos informativos solamente): ACE2, 159; DHTKD1 171; FLOT1, 178; MAP4K1, 169; Nek2, 156; SFRS8, 184; PRKD1, 162; TBC1D4, 165; TGOLN2, 183 y YTHDC2, 176.
El análisis estadístico
Gene pronóstico modelos de expresión se han desarrollado exclusivamente en el conjunto de entrenamiento. DFS se midió desde el momento del diagnóstico hasta la progresión de la enfermedad o la muerte verificada. los pacientes vivos y sin progresión de la enfermedad verificada fueron censurados en la fecha del último contacto. Los genes seleccionados tenían que estar asociado con univariately DFS (
p Hotel & lt; 0,01, Cox modelo de riesgo proporcional). El algoritmo de ajuste a modelos de riesgos proporcionales de relacionar DFS para cada gen, un gen a la vez, y proporciona un
p
valor para cada gen, poniendo a prueba la hipótesis de que DFS es independiente del nivel de expresión del gen particular. Los genes que se encuentran asociados con DFS en el conjunto de entrenamiento se clasifican en función de su valor de índice de riesgo absoluto, proporcionada por el algoritmo. gen modelos de pronóstico, que comprenden un número diferente de genes superiores de la graduación, se desarrollaron utilizando el algoritmo principal de la supervivencia componente supervisado [23]. El algoritmo calcula componentes principales y realiza Cox análisis de regresión de riesgos proporcionales para calcular un coeficiente de regresión (peso) de cada componente principal. Un modelo de componentes principales supervisado se ha desarrollado para proporcionar un índice pronóstico para cada paciente del estudio. Un índice pronóstico alta corresponde a un valor alto del peligro de recurrencia. Para evaluar el valor predictivo de este método, se utilizó licencia-One-Out-validación cruzada, donde se omite cada caso y todo el análisis se realiza utilizando el resto de las muestras. Con el fin de aplicar directamente estos modelos al 1
er conjunto de validación, que normalizó la formación y los conjuntos de validación 1
st, utilizando el método empírico de Bayes (EB) [24]. El método utiliza un algoritmo diseñado para ajustarse a la variación experimental no biológico ( "efecto de lote") entre los diferentes conjuntos de datos. Se reduce la variación entre laboratorios, así como las diferencias técnicas debido a la utilización de diferentes plataformas y enfoques metodológicos. Después de la normalización, se aplicó directamente los modelos de genes a la 1
er conjunto de validación sin ninguna modificación.
Las curvas de Kaplan-Meier y log-rank test fueron utilizados para estimar y comparar las distribuciones de supervivencia en pacientes con alto - y de bajo riesgo de recurrencia. Todos los reportados
p
valores son de doble cara. Se utilizó el análisis de riesgos proporcionales de Cox para el análisis univariante y multivariante para el ajuste de los factores pronósticos conocidos. El análisis estadístico se realizó a través de BRB-ArrayTools desarrollados por el Dr. Richard Simon y el equipo de desarrollo de BRB-ArrayTools y el paquete estadístico SPSS, versión 18.0, (IBM Corporation, Armonk, Nueva York).
Se utilizó la supervisión "Subclase Mapping" (submapa) método [25] para evaluar la correspondencia molecular de pacientes con un pronóstico favorable y desfavorable entre el conjunto de entrenamiento y el 1
er conjunto de validación. Este método bidireccionalmente evalúa la asociación de subtipos predefinidos en varios conjuntos de datos independientes, a pesar de su variante técnica. El algoritmo proporciona el cálculo de un
valor de p
para demostrar la probabilidad de similitud molecular entre las diferentes subclases, que se implementa en el software GenePattern (Versión 3.0, Broad Institute, Cambridge, MA) y se puede acceder en se utilizó http://www.broad.mit.edu/genepattern/
análisis gene conjunto (GSA) para detectar la red de genes característicos de desregulación grupos de pacientes con buen o mal pronóstico [26]. Utilizando los datos disponibles al público, que entonces se predijo el estado de activación de la vía oncogénica en cada paciente de la formación y 1
conjuntos de validación st. Se aplicaron los modelos de expresión de genes, previamente desarrollado y validado in vitro, para estimar la probabilidad de activación de la vía en cada muestra [27]. Por último, mediante modelos de regresión probit bayesianos asignamos a cada paciente una probabilidad de activación de la vía.
Resultados
Identificación y validación de los clasificadores de pronóstico utilizando perfiles de expresión génica
El diagrama de flujo de nuestro estudio se muestra en la Figura 1 (diagrama de consorte). Se analizaron los tumores laríngeos primarios de 66 pacientes (conjunto de entrenamiento) y 54 pacientes (1
er conjunto de validación) utilizando perfiles de expresión génica global. Después de evaluar la calidad de los datos de microarrays, se excluyeron los valores atípicos 7 y 4 técnicos de los dos conjuntos, respectivamente. Para algunos de los genes, la expresión se evaluó usando dos conjuntos de sonda diferentes. modelos de pronóstico sonda conjunto se identificaron exclusivamente en el conjunto de entrenamiento. Después de excluir a una cuarta parte de los genes menos variantes, nos centramos en los genes asociados con DFS (Wald de
p Hotel & lt; 0,01). Luego clasificamos los 253 conjuntos de sonda que se encuentran asociados significativamente con DFS, en función de su coeficiente de regresión de Cox. Se identificaron varios modelos de pronóstico sonda conjunto que consta de hasta 250 a tan sólo 20 conjuntos de sonda, que llevan a cabo igualmente bien en el conjunto de entrenamiento.
A continuación, hemos aplicado estos predictores de múltiples genes directamente al 1
er conjunto de validación. El modelo de serie 30-sonda realizó el mejor en el conjunto de validación (el modelo con menor número de los genes que muestran la diferencia estadística más alta de la SSE entre los pacientes de riesgo alto y bajo). La mediana de SSE en los grupos de pacientes con pronóstico desfavorable y favorable, según lo predicho por el modelo de serie 30-sonda, fue de 34 y 80 meses, respectivamente (log-rank,
p = 0,010
). La razón de riesgo (HR) para la recurrencia en el grupo de alto riesgo en comparación con el grupo de bajo riesgo fue de 3,87 (IC del 95%: 1,28 a 11,73, de Wald
p = 0,017
). Las curvas de Kaplan-Meier para todos los modelos de la sonda conjunto en la formación y 1 conjuntos de validación
st se pueden encontrar en S1 Archivo. La concordancia entre las asignaciones de riesgo tanto en la formación y 1
conjuntos de validación st en base a los diferentes clasificadores era alta, 81-87% (V Cramer prueba = 0,62 a 0,75).
Las anotaciones de las 30 de la sonda conjuntos incluidos en nuestro modelo se muestran en la Tabla 3, mientras que una representación gráfica de los patrones de expresión génica del modelo de serie 30-sonda en los de alto y bajo riesgo los pacientes se muestra en la Figura 2a. Hemos observado que en este modelo, dos genes (ACE2 y MAP4K1) está representado por dos conjuntos de sonda. Con el fin de evitar el efecto de la ponderación de estos dos genes dos veces más en comparación con cada uno de los otros conjuntos de sondas individuales, lo que representa un único gen, que reanalizada nuestro modelo en la formación y 1
st conjuntos de validación utilizando una única sonda fijado para cada gen. En el conjunto de entrenamiento, la significación estadística en el modelo 28-gen se mantuvo idéntica (log-rank test,
p Hotel & lt; 0,001, Figura 3a) con el basado en el modelo de serie 30-sonda. La mediana de DFS en el conjunto de validación 1
st, según lo predicho por el modelo 28-gen, fue de 34 y 80 meses, respectivamente (log-rank,
p = 0,029
, Figura 3b). La razón de riesgo (HR) para la recurrencia en el grupo de alto riesgo en comparación con el grupo de bajo riesgo fue de 4,38 (IC del 95%: 1.6 a 7.1,
p = 0,036
de Wald).
Representación gráfica de los patrones de 30-sonda modelo conjunto de expresión en pacientes con pronóstico favorable y desfavorable se muestra en el panel a. el color rojo indica la sobreexpresión y color verde disminución en la expresión de los respectivos genes. similitud molecular de pacientes con un pronóstico favorable y desfavorable en el entrenamiento y 1
conjuntos de validación st, utilizando Submapa, se muestra en el panel b. La barra de abajo indica la relación entre el color y Bonferonni corregido
valores de p
. El color rojo representa alta confianza para la homogeneidad molecular entre los grupos respectivos, mientras que el color azul representa la falta de confianza de los mismos.
estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier para los pacientes de alto y bajo riesgo en función de la 28-gen las predicciones de riesgo modelo en el conjunto de entrenamiento (a) y 1
er conjunto de validación (b).
a fin de validar el significado pronóstico de estos perfiles, hemos aplicado nuestro 28-gen modelo para una cohorte a disposición del público de los pacientes con cáncer en etapa temprana de laringe [28]. Debido a la variación técnica entre los dos conjuntos de datos, 23 de los 28 genes de nuestro modelo se utilizaron para estratificar a los pacientes en función de su riesgo de recurrencia. A pesar de las limitaciones técnicas y biológicas (diferentes plataformas, diferente número de genes, temprana contra todos en estadio de la enfermedad) nuestro modelo mantuvo su importancia pronóstica. La mediana de SSE en los grupos de pacientes con pronóstico desfavorable y favorable, según lo predicho por el modelo 23-gen, fue de 118 y 161 meses, respectivamente (log-rank,
p = 0,011
, Figura S1). El HR para la recidiva en el grupo de alto riesgo en comparación con el grupo de bajo riesgo fue de 4,37 (IC del 95%: 1,24 a 15,34, de Wald
p = 0,022
).
homología molecular de pacientes con favorables y pronóstico desfavorable en el entrenamiento y 1
conjuntos de validación st
Nuestro perfil de 28 genes parece no sólo ser una colección de genes de pronóstico, pero para realmente capturar la biología subyacente de los tumores. Para demostrar la homogeneidad molecular de los tumores de alto riesgo, se utilizó la cartografía subclase (Submapa), un método que evalúa la similitud molecular de grupos predefinidos que pertenecen a diferentes conjuntos de datos. Hemos hecho puesto de manifiesto que los grupos de pacientes con mal pronóstico y buena en el conjunto de entrenamiento cuota de los mismos patrones biológicos con los grupos respectivos en el conjunto de validación, por encima y más allá de la expresión de genes específicos. Gráficos que muestran buena "correspondencia molecular" de los de alto y bajo riesgo los pacientes se muestran en la Figura 2b.
importancia pronóstica independiente del modelo 28-gen
Estábamos interesados en demostrar la independencia importancia pronóstica de nuestro predictor de múltiples genes. Se incluyeron en la etapa de análisis y grado, los únicos factores pronósticos conocidos, por lo que estaban disponibles para los pacientes de nuestro estudio de datos. También hemos incluido la terapia de radiación, ya que se sabe que reduce significativamente la recurrencia local. En el análisis multivariado, nuestro modelo de 28-gen mantiene significado pronóstico incierto en el conjunto de validación 1
st. HR para la recidiva en el grupo de alto riesgo fue de 2,67 (IC del 95%: 0,99 a 7,22, Wald de
p = 0,05
) (los detalles se muestran en la Tabla 4).
Pathway análisis en los grupos de alto y bajo riesgo
con el fin de obtener alguna información adicional sobre los procesos biológicos en pacientes con un pronóstico favorable y desfavorable, se realizó un análisis conjunto de genes (GSA). Exploramos las redes de genes y temas biológicos, según lo descrito por la Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas de base de datos (KEGG) Camino. Nosotros sí, identificado una amplia gama de vías, expresa de forma diferente entre los dos grupos de pacientes (prueba global de GSA Goeman
valores de p Hotel & lt; 0,01). Nos centramos en las vías desreguladas tanto en la formación y en los conjuntos de validación 1
st. La Tabla 5 presenta una selección de vías de interés, mientras que la lista completa de las vías se puede encontrar que en la Tabla S2. Varias de estas vías han sido previamente demostrado que desempeñan un papel importante en la progresión del cáncer de cabeza y cuello. Curiosamente, se observó que los genes de la adhesión focal (FA) vía [29], mostrado ser pronóstico en nuestra base de datos, así como en el cáncer de cabeza y cuello, estratificada con éxito a nuestros pacientes en función de su riesgo de recurrencia (detalles en la Figura 4 )
estimaciones de Kaplan-Meier de supervivencia libre de enfermedad en pacientes de alto y bajo riesgo, tal como se define por los genes de la vía de adhesión focal (log-rank,
p
. & lt; 0,005).
patrones de activación de la vía oncogénica en pacientes individuales
Además de los resultados de los análisis antes mencionados vía que derivan de la evaluación de grupos de pacientes, hemos tratado de explorar la vía de activación en pacientes individuales . Hemos utilizado anteriormente desarrollado y validado la expresión génica "in vitro" de "lectura-outs" para identificar la activación de vías oncogénicas conocidos en cada paciente de la formación y 1
conjuntos de validación st. Hemos investigado la Src, Ras, ß-catenina y E2F3 vías, que han sido previamente demostrado estar asociado con la supervivencia en otros tipos de cáncer [27]. Curiosamente, hemos demostrado que los pacientes con mal pronóstico con mayor frecuencia tenían tumores que se caracteriza por la activación de la vía Ras, odds ratio (OR) = 2,92 (IC del 95%: 1,33 a 6,39, de Wald
p Hotel & lt; 0,01), mientras que los pacientes con buen pronóstico tumores más a menudo tenido que exhiben Src y activación de la vía β-catenina, OR = 4,54 (IC del 95%: 1,64 a 12,50,
p
= 0,003) y de 2,63 (IC del 95%: 1,16 a 5,88,
p
= 0,03), respectivamente. Además, se realizó proporcional de Cox de regresión de riesgos de supervivencia y observamos que no se encontró la activación de la vía Ras estar asociado con un mal pronóstico, HR = 2,55 (IC del 95%: 1,19 a 5,45,
p = 0,020
). Las vías de Src, beta-catenina y E2F3 no parecen estar asociados con SLE en pacientes con cáncer de laringe. Correspondientes curvas de Kaplan-Meier se muestran en la Figura 5. Por último, se realizó un análisis multivariante, incluyendo el modelo 28-gen y de la vía Ras y encontramos que el predictor mantuvo su importancia pronóstica independiente (de Wald
p = 0,001
) , al igual que la vía oncogénica (Tabla 6).
los valores RQ han sido combinados como variables binarias para obtener perfiles 3-regresivas según datos de la matriz. Marcadores, como se indica. Azul y rojo curvas coinciden con los patrones de pronóstico esperados obtenidos en el modelo 28-gen de los genes particulares. curvas grises: los pacientes no clasificados (escala intermedia)
qPCR validación de un subconjunto de genes de la 28-gen predictor
Los análisis antes mencionados se realizaron con fresco congelado. muestras de tejido. Sin embargo, este enfoque tiene algunas limitaciones metodológicas cuando se trata de la práctica clínica diaria. Por lo tanto, se intentó validar nuestro predictor de múltiples genes mediante PCR cuantitativa en muestras de tejido tumoral FFPE, una metodología más fácilmente aplicable. Como se describe en la sección Materiales y Métodos, sin embargo, fue posible investigar de forma fiable en nuestra serie de muestras FFPE la expresión de sólo 10 de los 28 genes en el predictor originales. Las características descriptivas de los valores RQ obtenidos de las muestras informativas por ensayo se describen en la Tabla 7 (medias, medianas, SD, min, max). En un primer momento, se intentó agrupar los valores de RQ continuas para todos estos genes. Sin embargo, la agrupación jerárquica no dió resultados comparables a la predictor 28-gen de una manera significativa, con la mayoría de los valores altos y bajos RQ agrupados en la dirección opuesta (figuras 6a y b). Esto era de ninguna sorpresa, ya que sólo examinó un tercio de los genes sondadas en la firma matriz, mientras factor de cambio en la expresión de estos genes era muy estrecha y podría invertirse fácilmente con un método diferente (qPCR vs. matriz de hibridación ) o un tipo diferente de material (FFPE tejidos vs. fresco congelado). serían necesarios enfoques analíticos y estadísticos detallados para el comportamiento de cada ensayo qPCR frente a la sonda de matriz en FFPE emparejado frente a muestras frescas congeladas para el esclarecimiento de esta discrepancia, sin embargo este tipo de análisis en profundidad estaba más allá del alcance de la presente estudiar. Por lo tanto, hemos aplicado al lado de perfiles determinados con anterioridad para la investigación de los posibles efectos de los genes probados con qPCR en DFS paciente. Con este fin, hemos transformado los valores de RQ continuos en los parámetros binarios (alta /baja expresión). Sobre la base de la estrecha factor de cambio de la expresión génica entre los grupos buenos y malos pronóstico en el predictor 28-gen, se utilizó la mediana de los valores de RQ para clasificar alta y baja expresión de los 10 genes evaluables. las pruebas para estos genes como marcadores individuales produjeron asociaciones con resultado similar a los observados para los genes correspondientes en la firma U133A (patrones de altas /bajas comparables con arriba y log-rank baja regulación de la expresión génica, respectivamente, para 6 de los 10 genes), algunos de los cuales fueron significativas (PRKD1) o mostraron una tendencia a la significación (ACE2, FLOT1) (Tabla 8). La agrupación jerárquica de valores de RQ continuas para los últimos tres genes obtuvieron dos grupos de pacientes con significativamente diferente DFS (Figuras 6c y d). El patrón de expresión génica se espera estaba presente en el contexto correcto con el resultado, pero estuvo ausente en la mayoría de los casos.
La agrupación jerárquica de valores de RQ de los genes probados en el
conjunto de validación 2º (muestras FFPE ). En los paneles A y B, se evaluaron los valores de RQ de los 10 genes aplicables. Se identificaron dos grupos principales (a) que se han demostrado tener un efecto significativo sobre la SSE paciente (b). Cluster 1 se asoció con un mejor pronóstico en comparación con grupo 2. Sin embargo, la mayoría de estos genes se agrupan en la dirección opuesta a la esperada de la clasificador 28-gen. En los paneles C y D, la agrupación de los 3 genes con asociaciones significativas individualmente dio 2 grupos de pacientes con desenlace distinto; en comparación con el original clasificador 28-gen, los patrones correctos de la expresión génica estaban presentes en los correspondientes grupos buenos y malos pronóstico. colores verdes en los paneles de un rojo y y C denotan alta y baja expresión, respectivamente.
Aplicación de los patrones de buen pronóstico alta /baja expresión de genes a los valores binarios RQ transformado reveladas ningún tumor individual con el patrón esperado para todos los 10 genes.