Extracto
microARN anormal (miARN) expresión se ha relacionado con el desarrollo y la progresión de varios cánceres humanos, y tal desregulación puede resultar de la metilación del ADN aberrante. Si bien se conoce un pequeño número de miRNAs ser regulados por la metilación del ADN, que postula que dicha regulación epigenética es más frecuente. Mediante la combinación aislada-MBD de Secuenciación del Genoma (GSI) para evaluar los patrones de metilación del ADN en todo el genoma y el análisis de microarrays para determinar los niveles de expresión de los genes miARN, se buscaron candidato miRNAs regulados por la metilación del ADN en líneas celulares de cáncer colorrectal. Hemos encontrado 64 miRNAs a ser robusta metilados en células HCT116; dieciocho de ellos se localizaron en regiones o imprinting ya comunicados a ser regulados por la metilación del ADN. A los 46 miRNAs restantes, los niveles de expresión de los 18 eran compatibles con su estado de metilación del ADN. Por último, 8 miRNAs fueron reguladas por el tratamiento con 5-aza-2'- desoxicitidina y se identificó a ser nuevos miRNAs regulados por la metilación del ADN. Por otra parte, hemos demostrado la relevancia funcional de estos miRNAs epigenetically silenciados por ectópica expresan los candidatos seleccionados, lo que resultó en la inhibición del crecimiento y la migración de las células cancerosas. Además de informar sobre estos resultados, nuestro estudio también proporciona una estrategia fiable y sistemático para identificar ADN miRNAs metilación regulado mediante la combinación de perfiles de metilación del ADN y los datos de expresión
Visto:. Yan H, Choi Aj, Lee BH, Ting AH (2011) identificación y análisis funcional de epigenetically Silenciado microARN en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (6): e20628. doi: 10.1371 /journal.pone.0020628
Editor: Axel Imhof, Ludwig-Maximilians-Universität München, Alemania |
Recibido: 24 Enero, 2011; Aceptado: May 6, 2011; Publicado: 16 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Yan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miRNA) son pequeñas, no codificante. ARN que regulan la expresión de genes y juegan un papel fundamental en los procesos celulares normales, incluyendo la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [1]. Tanto la expresión aberrante y silenciamiento de miRNAs se han observado en los cánceres humanos, lo que sugiere posibles funciones oncogénico y supresores de tumores para estos miRNAs [2], [3]. La biogénesis de miRNAs implica la transcripción de un largo transcrito primario (pri-miARN) por la ARN polimerasa II [4], la escisión en un producto intermedio (pre-miARN) por Drosha [5], y el procesamiento final en el miARN maduro por Dicer [ ,,,0],6]. Cada etapa del proceso está altamente regulada, y la desregulación en cualquier nivel puede dar lugar a funciones inadecuadas miARN. De particular interés para nuestro estudio es miRNA regulación transcripcional de la metilación del ADN. En general, la metilación del gen promotor de ADN se correlaciona negativamente con la expresión de genes y puede dar cuenta de aberrante supresor tumoral silenciamiento de genes en una variedad de cánceres humanos [7]. Al igual que en estas proteínas transcritas POLR2A genes de codificación, la transcripción de los genes miARN también puede ser silenciado por la metilación del ADN del promotor.
miRNAs epigenetically silenciados han sido descubiertos en el cáncer basado en la expresión diferencial entre los tejidos normales y tumores o entre el inicio y el cáncer de ADN desmetilados Células. Por ejemplo, Bandres
et al.
Identificó por primera vez 23 miRNAs que se regulan a la baja en los cánceres primarios de colon en comparación con el epitelio colorrectal normal correspondiente y posteriormente se descubrió que el miR-129-2, miR-9-1, y miR -137 son silenciados por la metilación del ADN en el cáncer [8]. Toyota
et al.
Células de cáncer colorrectal HCT116 tratados con el agente de desmetilación, 5-aza-2'- desoxicitidina (5-aza-DC), y se compararon los perfiles de expresión de genes miARN entre el tratado y las células no tratadas para identificar silenciamiento de miR-34b /c por hipermetilación del promotor del ADN [9]. Por otra parte, Lujambio
et al.
Comparó el perfil de expresión de miRNA de las células de tipo salvaje HCT116 con la de su derivado desmetilado isogénica, ADN metiltransferasa -1 y -3b doble knockout (DKO) las células, y encontraron 18 miRNAs hasta reguladas en DKO células [10]. Posteriormente, se confirmó que la metilación del ADN es responsable del silenciamiento de miR-124a en el cáncer de colon.
Una búsqueda en la literatura utilizando MEDLINE reveló que se sabe que están epigenetically silenciados por la metilación del ADN 16 miRNAs [8], [9 ], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. la metilación del ADN se refiere a la adición covalente de un grupo metilo a la posición 5 de las citosinas, por lo general en un contexto dinucleótido CpG en células diferenciadas de mamífero [18]. regiones genómicas con una alta densidad de CpG son islas CpG denomina y son a menudo los sitios de metilación del ADN regulador. Teniendo en cuenta que el 16% de los miRNAs humanos anotados se encuentran dentro de 1000 pb de una isla CpG [19], suponemos que la regulación epigenética de miRNAs podría ser más común de lo reportado hasta el momento. Los estudios anteriores se basaron en la expresión diferencial de miRNAs para identificar candidatos para la evaluación posterior epigenética. Este enfoque introduce un sesgo que limita el número de miRNAs epigenetically reguladas que pueden ser descubiertos. Por ejemplo, miRNAs específicos de tejido que están regulados por la metilación del ADN pueden ser equivalente metilado en los tejidos normales y tumores, dando como resultado una falta de expresión diferencial entre los especímenes normales y cancerosas. Además, miRNAs con bajos niveles de expresión no se pueden identificar de forma fiable debido a que las diferencias en la expresión entre normal y cáncer o entre las condiciones de línea de base y desmetilados es probable que caer por debajo de los puntos de corte convencionales (entre 2 y 1,5 veces). Por último, la metilación residual persiste tanto en las células demethylated farmacológica y genética [20]. Tal metilación puede ser crítico en el mantenimiento de la viabilidad celular, potencialmente a través de la represión persistente de miRNAs clave. Esto daría lugar a este tipo de miRNAs no ser identificados a través de estrategias basadas en la expresión.
Para eliminar el sesgo introducido por el descubrimiento estrategia de identificación basados en la expresión, se utilizó directamente los patrones de metilación del ADN global para identificar miRNAs regulados por la metilación del ADN en HCT116 y las células de cáncer de colon DKO. Hemos mapeado previamente la metilación del ADN en todo el genoma en estas líneas celulares utilizando dominio de unión a metil CpG (MBD) -isolated de Secuenciación del Genoma (GSI) [21]. Que identificó por primera miRNAs con la metilación del ADN proximal como candidatos. A continuación, una referencia cruzada de la lista de candidatos con los datos de expresión de los genes miARN como elementos de prueba. Con este enfoque, hemos identificado con éxito tanto de ADN conocidos y nuevos miRNAs metilación regulado. Aquí proporcionamos un catálogo más amplio de miRNAs epigenetically regulados en células de cáncer de colon, lo que demuestra que la regulación epigenética de miRNAs es frecuente en estas líneas celulares de cáncer. Por otra parte, los estudios funcionales de miRNAs seleccione proporcionan relevancia biológica para tal regulación epigenética en el contexto del cáncer de colon.
Resultados
miRNAs candidatos regulados por la metilación del ADN se identificaron mediante la metilación del ADN genómico proximal y expresión de apoyo datos
migs utilizado anteriormente para construir perfiles de metilación del ADN en todo el genoma de la línea celular HCT116 y su línea celular isogénicas desmetilado, DKO [21]. células DKO son células HCT116 eliminados por ADN metiltransferasa -1 y -3b y retienen & lt; 5% genómico metilación del ADN [20]. ADN metilado fracciones del genoma se aislaron por incubación con proteínas recombinantes MBD, secuenciados en un secuenciador de Illumina GAII, y se asigna de nuevo al genoma de referencia para generar perfiles metiloma individuales. Para identificar miRNAs ADN de metilación regulado, se realizaron búsquedas de miRNAs con la evidencia de la metilación del ADN dentro de 500 pb de sus posiciones anotadas en HCT116 y células DKO. Con este enfoque, hemos identificado 64 miRNAs candidatos para su posterior análisis (Figura 1).
De los 64 candidatos miRNAs, 13 se han notificado a ser regulados por la metilación del ADN (Tabla S1). Otro 5 pertenecen a un gran grupo de miRNA ubicada en el ser humano Dlk1-GTL2 la impronta de dominio en 14q32 y son silenciados en el cromosoma paterno por la metilación del ADN [22]. Por lo tanto, nos centramos en los 46 miRNAs restantes que no hayan sido comunicados a ser regulados por la metilación del ADN para la validación detallada. En primer lugar, se seleccionaron al azar 6 miRNAs para el análisis de secuenciación de bisulfito para verificar el estado de metilación del ADN detectado por Migs (Figura 2 y Figura S1). Los datos de secuenciación de bisulfito corroboraron los datos Migs en absoluto 6 loci.
secuenciación de bisulfito se llevó a cabo para miR-941, (B) miR-1237, y (C) miR-1247 en células HCT116 los padres (A) , las células HCT116 tratados con 5 M 5-aza-dC durante 48 horas, y las células DKO. La captura de pantalla del navegador UCSC genoma muestra la señal de la metilación del ADN en cada muestra. Los rectángulos marcan las regiones validados por secuenciación de bisulfito. Cada círculo representa un dinucleótido CpG. Los círculos negros representan las citosinas metiladas mientras que los círculos blancos representan citosinas no metiladas.
A continuación, razonó que la pérdida de metilación del ADN en las células DKO en comparación con las células HCT116 debe dar lugar a una mayor expresión de los miRNAs candidatos mientras que la retención de la metilación del ADN debe correlacionarse con el silenciamiento persistente de los miRNAs candidatos. Por lo tanto, hemos examinado los datos de microarrays de expresión para los 46 candidatos en las células HCT116 y DKO (Tabla S2). El uso de 1,5 veces el cambio como nuestro umbral, se identificaron 18 miRNAs que tienen los datos de expresión compatibles con su estado de metilación del ADN en las células HCT116 y DKO (Tabla S1). Se realizó el análisis de miRNA-específica cuantitativa en tiempo real RT-PCR (miR-QRT-PCR) para seleccionar 6 miRNAs para verificar los datos de expresión determinados por el microarray (Figura S2). Los resultados de miR-QRT-PCR confirmaron los datos de microarrays para los 6 miRNAs, que incluyeron ambos miRNAs conocidos y regulados por la metilación del ADN candidato. Por lo tanto, basado en la metilación del ADN genómico empírica y el apoyo a los datos de microarrays de expresión, hemos identificado 18 nuevos miRNAs candidatos que pueden ser transcripcionalmente regulados por la metilación del ADN.
miRNAs candidatos re-expresa después de 5-aza-2'- desoxicitidina
para validar que el candidato miRNAs fueron de hecho regulados por la metilación del ADN, se trataron HCT116, RKO, y las células de cáncer de colon DLD1 con el agente de desmetilación 5-aza-2'- desoxicitidina (5-aza-dC) a determinar si estos miRNAs se re-expresaron después de tratamiento con 5-aza-dC. Como la metilación del ADN regula la expresión génica en el nivel transcripcional, se sometieron a ensayo para la expresión de los miRNAs primarios (Pri-miARN) por el tiempo real de RT-PCR [23]. incluida Pri-miR-193a, -9-3, y -375, que se sabe que es transcripcionalmente regulados por la metilación del ADN en las células HCT116 [8], como controles positivos y Pri-MIR-1224, que fue desmetilado pero permaneció silenciado en células DKO en este estudio, como un control negativo. Hemos probado 17 de los 18 nuevos candidatos porque ninguno de los cebadores diseñados para MIR-1234 produjo productos de PCR exitosas. En las células HCT116, encontramos 11 de los 17 miRNAs a ser significativamente hasta reguladas después de tratamiento con 5-aza-DC (Figura 3A). Además, confirmó de forma independiente los 11 candidatos en las células RKO (Figura 3B) y 10 de los 11 candidatos en las células DLD1 (Figura 3C). Para verificar que la sobre regulación de estos miRNAs era consecuente con la desmetilación del ADN después de 5-aza-DC tratamiento, se evaluó los cambios en el estado de metilación del ADN en las regiones proximales de miR-941-1 /3, MIR-MIR-1237 y 1247 por secuenciación genómica de bisulfito (Figura 2). La desmetilación se observó en estos loci en células HCT116 tratados con 5-aza-DC, apoyando que la re-expresión observada se debe a la desmetilación del ADN.
Análisis en tiempo real RT-PCR se llevó a cabo para evaluar principal candidato los niveles de miRNAs (Pri-miRNAs) en HCT116 (a), (B) RKO, y las células (C) DLD1 antes y después del tratamiento con 5 M 5-aza-dC durante 48 horas. miR-1224 se incluyó como un control negativo. miR-193a, miR-375 y miR-9-3 se incluyeron como controles positivos. * Indica que el aumento significativo en la expresión Pri-miARN después del tratamiento 5-aza-dC (p & lt; 0,05). Expresiones de miRNAs se normalizaron internamente a los niveles de expresión de
GAPDH
, y la expresión normalizada para cada miARN antes de los 5-aza-dC tratamientos se pone a 1.
Finalmente, los miRNAs intrónicas puede ser co-transcrito a partir de promotores de genes huésped y por lo tanto, no están regulados de forma independiente en el nivel transcripcional [24], [25]. Por lo tanto, para entender plenamente el significado de la metilación del ADN se observó para nuestros 10 candidatos miRNAs, se examinaron los contextos genómicas de los 10 candidatos más de cerca (Tabla 1). MIR-1247, miR-1826, y miR-219-2 se encuentran en regiones intergénicas y por lo tanto, es poco probable que se co-regulado por un promotor del gen de acogida. Los 7 candidatos restantes se encuentran en los intrones de RefSeq o EST transcripciones y se estudiaron más. En base a los perfiles de metilación del ADN en todo el genoma, ninguno de los genes del huésped putativo, a excepción de la no codificante del ARN
ANKRD30BL
, tiene la metilación del ADN significativa en sus promotores (Tabla 1 y la Figura S3), lo que sugiere que estos genes putativos de acogida no están regulados por la metilación del ADN del promotor.
sin embargo, postulamos que si la supuesta transcripción de genes de acogida dicta la expresión de los miRNAs candidatos incrustados, que detecta un aumento de la expresión de genes de acogida después de 5- tratamiento aza-dC en células HCT116, RKO, y DLD1. Este incremento de la expresión de genes de acogida se corresponderían con los aumentos observados para los miRNAs incrustados en estas mismas células después del tratamiento con 5-aza-DC. A la inversa, si los genes del huésped putativo no responden al tratamiento con 5-aza-dC en la misma manera que los miRNAs incrustados, los miRNAs es probable transcriben independientemente a partir de los genes del huésped putativos. En este último escenario, la metilación del ADN que descubrió cerca de los miRNAs sería más significativo en su regulación transcripcional. Sobre la base de QRT-PCR resultados, se determinó que el miR-1237, miR-602, miR-941-1, miR-941-3, y miR-663B son transcripcionalmente independientes de sus respectivos genes putativos de acogida (Figura 4). La expresión de
ANKRD30BL
, el gen huésped putativo para miR-663B, no era detectable antes o después de los experimentos 5-aza-dC y por lo tanto, no representa gráficamente en la Figura 4. Para miR-24-1 y miR 27b, los datos son menos concluyentes, y que no podía descartar que estos dos mi-ARN se pueden co-sintetizados con el gen de acogida,
C9orf3
[26]. En total, hemos identificado y confirmado por lo menos 8 nuevos miRNAs que se transcripcionalmente regulados por la metilación del ADN.
Análisis en tiempo real RT-PCR se llevó a cabo para evaluar la expresión del gen putativo de acogida en respuesta a 5-aza-dC tratamientos en HCT116 (azul), RKO (rosa oscuro), y DLD1 (amarillo). Los cambios en la expresión de los genes miARN incrustado también se representaron para las comparaciones de lado a lado. Todas las expresiones se normalizaron internamente a los niveles de expresión de
GAPDH
y normalizada de expresión de cada gen huésped y miARN antes de los tratamientos 5-aza-dC se estableció en 1.
miR 941 y miR-1247 suprimir el crecimiento celular y la migración de las células de cáncer de colon
Se procedió a probar las funciones biológicas de estos miRNAs epigenetically regulados para hacerse una idea de la relevancia de su metilación del ADN en las células de cáncer de colon. Para determinar si la expresión de estos miRNAs epigenetically silenciados afectaría el crecimiento de células cancerosas y la migración, las células transfectadas con HCT116 imita miARN de miR-941 (la forma madura de miR-941-1 y -3), MIR-1237, miR-1247 y un control negativo no codificante (de AllStars Neg.).
en primer lugar, se realizó un análisis de crecimiento curva (Figura 5A) y el ensayo de MTT (Figura 5B) para evaluar el crecimiento celular y la condición metabólica. Se encontró que la expresión ectópica de miR-1247 resultó en una disminución significativa en el crecimiento de células HCT116 y la actividad metabólica medida por los dos ensayos respectivamente. ensayo de incorporación de BrdU verificada independientemente de que la disminución del crecimiento y el metabolismo es probablemente una consecuencia de la disminución de la proliferación en estas células (Figura 5C). Se ha observado una disminución similar en la proliferación celular y la función metabólica en las células de cáncer de colon DLD1 transfectadas con miR-1247 mímica (Figura S4A y B). Por el contrario, en las células DKO, en los que el miR-1247 ya está desmetilado y re-expresa, la transfección con imita el miR-1247 adicionales no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento celular y el metabolismo (Figura S5a y B). Estas observaciones sugirieron que miR-1247 puede ser-tumor supresor en el cáncer de colon y por lo tanto su silenciamiento epigenético es beneficioso para el crecimiento del cáncer.
Las curvas de crecimiento (A) y (B) ensayos de MTT de las células HCT116 transfectadas de manera simulada y HCT116 Las células transfectadas con no codificante control negativo miARN (de AllStars Neg.), miR-941, miR-1237, o imita el miR-1247. ensayo de incorporación (C) BrdU de células HCT116 transfectadas de manera simulada y células HCT116 transfectadas con no codificante control negativo miARN (de AllStars Neg.), miR-941 o miR-1247. Se muestra un campo representativo para cada condición experimental. El gráfico de barras representa el porcentaje medio (%) de las células BrdU positivas. (D) ensayo de curación de heridas de modelo de transfectadas las células HCT116 y células transfectadas con el control negativo (de AllStars Neg.), MiR-941, miR-1237, o imita el miR-1247. Las fotografías fueron tomadas inmediatamente después de la herida y 16 horas más tarde. Los resultados se cuantificaron y se normalizó a las células transfectadas falsamente. ensayos (E) Transwell migración de células transfectadas falsamente HCT116 y células transfectadas con el control negativo (de AllStars Neg.), miR-941, o imita miR-1247. se muestran campos representativos de células invasoras en la membrana. El gráfico de barras que representa el número medio de células en la parte inferior de las membranas en cada tratamiento normalizado para burlarse de las células transfectadas.
Por otra parte, los objetivos informáticos predijeron de miR-941 y miR-1247 incluyen varios genes implicados en la migración celular y la invasión. Por ejemplo, ADAM metalopeptidasa dominio 15 (
ADAM15
) es un objetivo previsto de miR-1247 y codifica una glicoproteína transmembrana importante para la adhesión celular [27]. Postulamos que la baja regulación de estos objetivos previsto por la expresión ectópica de miR-941 y miR-1247 que afectaría negativamente a la migración celular. Por lo tanto, hemos probado los efectos de la expresión ectópica de miR-941, miR-1237, y miR-1247 relativa a la movilidad celular en las células HCT116. En los ensayos de curación de heridas, las células HCT116 transfectadas con el miR-941 y miR-imita 1247 fueron significativamente afectada en su capacidad para repoblar áreas heridas en comparación con fingida, control negativo, o células miR-1237 transfectadas (Figura 5D). Estas observaciones se confirmaron posteriormente mediante el ensayo de migración transwell (Figura 5E). Por último, efectos supresores similares sobre la migración celular se observaron de forma independiente en las células DLD1 (Figura S4C) y células DKO (Figura S5C) transfectadas con el miR-941 y miR-imita 1247. En conjunto, estas observaciones sugieren que el silenciamiento epigenético de miR-941 y miR-1247 puede facilitar la migración de células de cáncer de colon y la invasión.
Discusión
Los microARN son moléculas reguladoras importantes que modulan la expresión génica en ambos procesos de desarrollo y la enfermedad. Su regulación es, por lo tanto, un componente crítico en la comprensión de cada contexto biológico. la metilación del ADN genómico se ha demostrado que regulan la transcripción de un puñado de miRNAs en el cáncer. Estos estudios previos dirigidos a la identificación de ADN miRNAs de metilación regulado se basó en la detección de miRNAs expresados diferencialmente de cáncer y comparaciones normales o re-expresión de miRNAs en el ADN desmetilado condiciones. Un enfoque basado en la expresión introduce un sesgo en contra de miRNAs descubrimiento equivalente metilados, por lo tanto, lo que es equivalente silenciados, en los grupos de comparación. Este tipo de miARN epigenetically regulado todavía podría ser importante para el desarrollo del cáncer. Por ejemplo, lo que es equivalente miRNAs silenciados en normal y el cáncer pueden ser significativas para el cáncer de una manera específica de tejido. Por otra parte, la metilación del ADN residual en condiciones inducidas desmetilación podría sostener el silenciamiento de miRNAs críticos, lo que resulta en la falta de expresión diferencial detectable y el fracaso para identificar tales miRNAs epigenetically regulados. Por último, miRNAs con expresión diferencial marginal debajo de los umbrales típicos también se echa de menos cuando la proyección se basa únicamente en la expresión diferencial.
Para superar los sesgos anteriores e identificar más completa de ADN de metilación miRNAs reguladas en el cáncer de colon, seleccionados para el candidato miRNAs basadas en la evidencia empírica de la metilación del ADN genómico en células HCT116 y de cáncer de colon DKO. Búsquedas sistemáticas en el ADN metiloma mapas generados por Migs en estas células para miRNAs ubicados dentro de 500 pb de las señales de metilación del ADN. Hemos encontrado 64 candidatos, entre ellos 5 miRNAs conocidos impresos, 13 de ADN conocida miRNAs metilación regulado, y 46 nuevos candidatos. Posteriormente, se confirmó que 8 nuevos candidatos fueron de hecho regulados por la metilación del ADN en HCT116, DKO, RKO, y las células de cáncer de colon DLD1. Junto con la detección de la metilación del ADN miRNAs regulados conocidos, nuestro estudio identificó un total de 26 miRNAs epigenetically regulados, lo que demuestra que nuestro enfoque es eficaz y eficiente.
Es importante tener en cuenta que es posible que todavía estemos pasando por alto el ADN miRNAs de metilación regulado derivados de transcritos primarios de largo. Los estudios anteriores se centraron en miRNAs con sus secuencias de tallo-bucle incrustados en o cerca de las islas CpG, y nuestro estudio actual se centró en miRNAs con la metilación del ADN proximal a las secuencias tallo-bucle. Aunque estas estrategias similares permiten la detección sistemática, que probablemente subestiman el número total de miRNAs regulados por la metilación del ADN porque iniciación de la transcripción para los miRNAs primaria puede estar lejos aguas arriba de la secuencia de tallo-bucle. Por ejemplo, el transcrito primario de miR-21 es 3.433 nucleótidos de longitud, mientras que el miR-21 madura está codificada por los residuos de +2445 a 2516 en células HeLa [28]. . Recientemente, Chim
et al
informó que el miR-34a estaba regulada por metilación del ADN promotor CpG isla situada & gt; 30 kb aguas arriba de la madurez de miR-34a [29]. Por lo tanto, más miRNAs pueden ser regulados por la metilación del promotor de ADN, pero no serán identificados fácilmente utilizando un enfoque sistemático que se basa en la anotación del genoma actual.
Además, examinó la importancia biológica del silenciamiento epigenético del ADN recientemente identificados miRNAs metilación regulado. Nos hemos centrado en dos aspectos importantes de cáncer de desarrollo, el crecimiento y la migración, y seleccionados de miR-941, miR-1237, y miR-1247 para los estudios funcionales. La expresión ectópica de miR-1247 redujo significativamente la proliferación de células de cáncer y la migración en HCT116 y células DLD1, lo que sugiere que miR-1247 puede funcionar como un supresor de tumor. Estas observaciones son consistentes con las funciones de varios objetivos de predecir miR-1247 (http://www.microrna.org). Por ejemplo, Citron (CIT), una serina /treonina quinasa, está presente en el surco de segmentación y la mitad del cuerpo durante la citocinesis y es esencial para la abscisión celular [30], [31]. CIT también regula la transición G2 /M en hepatocitos de rata [32], y derribando CIT inhibe la proliferación de células de carcinoma hepatocelular [33]. Otro objetivo potencial para miR-1247 es FosB, que dimeriza con la proteína de junio de activar la transcripción de proteasas implicadas en la migración y la invasión del tumor [34]. Por último, la glicoproteína transmembrana, ADAM15, también podría ser el blanco de miR-1247, para facilitar la metástasis del cáncer de próstata [35]. Estos objetivos informáticos predijeron tendrá que ser validado empíricamente en el futuro
.
Es interesante que en las células DKO, en los que el miR-1247 es desmetilado y expresa a niveles más altos que las células HCT116, una exposición adicional a imita el miR-1247 no lo hizo resultar en una disminución del crecimiento celular, pero causado migración alterada. Las discrepancias entre los fenotipos de expresión de miR-1247 ectópico en HCT116, las células DLD1, y DKO siempre son representativas de las diferentes concentraciones a las que distintas funciones celulares están moduladas por el miR-1247. Alternativamente, puede ser debido a la presencia de diferentes objetivos para miR-1247 en HCT116 y células DKO. Estas dos posibilidades se requieren estudios adicionales para aclarar.
Mientras que los miRNAs diferencialmente expresados metilados y son importantes para el desarrollo del cáncer, propusimos que la metilación del ADN residual en condiciones desmetilado, como en las células DKO, también puede ser crítica. Nuestro estudio funcional de miR-941 fundamenta esta hipótesis. Se encontró que la sobre expresión de miR-941 fue capaz de inhibir de manera significativa la migración de células, tanto en células HCT116 y DKO y, además, en las células DLD1. Este resultado es razonable teniendo en cuenta varios objetivos previsto de alta prioridad de miR-941 están relacionados con la migración celular. Por ejemplo, la matriz metalopeptidasa 24 (MMP24) es un objetivo predicho para miR-941, y facilita la remodelación tisular y la migración de células en el endometrio de pacientes con endometriosis [36]. tipo similar de ADN de metilación regulado miRNAs se perdió por el enfoque basado en la expresión anterior, pero podría ser capturado fácilmente por nuestro estudio de diseño. Seis de los 8 novela miRNAs epigenetically regulados identificados en nuestro estudio retienen la metilación del ADN en las células proximal DKO, donde. & Lt; se deja 5% de metilación del ADN genómico en comparación con sus células HCT116 los padres
En resumen, nuestro enfoque de Descubrir ADN de metilación regulado miRNAs produjeron un número de candidatos que no habían sido descubiertos. Hemos demostrado a través de la expresión ectópica y ensayos funcionales que al menos dos de estos miRNAs puede ser particularmente importante en la progresión del tumor. Nuestro método es un complemento útil para el enfoque tradicional de usar un esquema basado en la expresión para identificar nuevos miRNAs silenciados por la metilación del ADN.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamiento de drogas
colorrectal líneas celulares de cáncer HCT116, DLD1, RKO y DKO células [25] se cultivaron en medio de McCoy 5A (Invitrogen, San Diego, CA) que contenía suero bovino fetal al 10% (Gibco, Grand Island, NY) a 37 ° C en 5% de CO
2 atmósfera. Las células se recogieron por raspado, y los sedimentos celulares se lavaron dos veces con PBS (Gibco, Grand Island, NY). El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen, San Diego, CA) de extracción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total se trató también con DNasa I (Roche, Indianapolis, IN) para eliminar cantidades traza de ADN genómico residual. El ADN genómico se extrajo de los sedimentos celulares mediante la incubación de los pelets en soluciones que contienen 0,5 mg /ml de proteinasa K, SDS al 2%, y 20 mM Tris-HCl durante la noche a 55
oC con agitación seguido de la extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. Para 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC) tratamientos, se sembraron las células a 5 x 10
5 células por 100 mm de plato de 24 h antes de la adición de 5-aza-dC (Sigma, St Louis, MO). Las células fueron tratadas con 5 M 5-aza-DC durante 48 horas antes de la cosecha.
aislado MBD-Genome Sequencing análisis de datos
Genoma toda la metilación del ADN, se hayan obtenido los datos para las células HCT116 y DKO mediante la realización aislada-MBD de Secuenciación del Genoma (GSI) [21]. La secuenciación de bajo nivel Lee se puede descargar desde el NCBI Corto Leer archivo (SRA#SRP001414). El número mínimo de secuenciación lee indican señales de metilación del ADN significativa se determinaron como se ha descrito anteriormente. miRNAs anotados (HG18, NCBI Build 36.1) situados dentro de 500 pb de la metilación del ADN significativos fueron identificados como candidatos para su posterior análisis.
miARN análisis de microarrays
perfiles de expresión de los genes miARN basado en microarrays se realizó utilizando el Illumina expresión de microARN humano de perfiles de panel de V2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El panel de miARN humana v2 contiene 1.146 ensayos, para la detección de ~97% de los miRNAs que se describen en la base de datos miRBase (Sanger miRBase, v9.1, liberación febrero de 2007). El procesamiento de datos se realizó en GenomeStudio v2009.1 (Illumina, San Diego, CA). tres experimentos se realizaron para cada línea celular. Los datos de cada experimento se normalizaron utilizando el método descrito anteriormente [37]. Para la comparación HCT116 frente DKO,
t
prueba de Welch se realizó con un
p
punto de corte de 0,05 y múltiples pruebas de corrección-valor por la tasa de falso descubrimiento (FDR). El conjunto de datos de microARN (GEO#GSE26819) se puede acceder desde la página web de Gene Expression Omnibus.
secuenciación de bisulfito
1 mg de ADN genómico de cada muestra se bisulfito convertidos utilizando el kit EpiTect (Qiagen , GmbH, Hilden) siguiendo el protocolo del fabricante. Las condiciones de PCR y las secuencias de cebadores se proporcionan en la Tabla S3. Los amplicones de PCR se purificaron en gel y se subclonó en pCRII-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA). Al menos ocho clones fueron seleccionados al azar y se secuenciaron en un analizador de ADN ABI3730xl para determinar los patrones de metilación de cada locus.
La detección de miRNAs maduro y primarias expresión por la Expresión RT-PCR cuantitativa
de madurez miRNAs se determinó utilizando QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen, GmbH, Hilden) y se normalizó a la expresión endógena ARNsno U6 utilizando el 2
-ΔΔCt método [38]. Brevemente, se añadió 100 RNA tratado con DNasa ng de cada muestra a 10 l de la verde mezcla maestra de PCR 2 × SYBR, 0,2 l RT-mix, 200 nM de cada cebador, y agua libre de RNasa a un total de 20 l. Para la expresión de los genes miARN primaria, GAPDH fue utilizado como el control de normalización. La expresión de cada uno de los genes miARN primaria en relación con GAPDH también se determinó utilizando el 2
-ΔΔCt método. Las secuencias de los cebadores para la detección de miRNAs maduros y primarios fueron diseñados como se describe anteriormente [23], [39] y que figuran en el cuadro S3. La media de tres experimentos se graficó con desviaciones estándar representados como barras de error.
Detección de la expresión génica de acogida putativa por RT-PCR cuantitativa
La expresión de los genes putativos de acogida se determinó utilizando QuantiTect SYBR Green RT -PCR kit (Qiagen, GmbH, Hilden) y se normalizó a GAPDH internamente. La expresión relativa después de tratamiento con 5-aza-DC se calculó utilizando la 2
-ΔΔCt método. El ARN se extrajo de la misma manera como se ha indicado anteriormente. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla S3. La media de tres experimentos se graficó con desviaciones estándar representados como barras de error.
La expresión ectópica de miRNAs
El exceso de expresión de miR-941, miR-1237, y miR-1247 en HCT116, DKO y DLD1 células se logró mediante la transfección de las células con 20 nM dúplex miARN maduro que imitaban el miR-941 (MSY0004984, Qiagen), MIR-1237 (MSY0005592, Qiagen), y miR-1247 (MSY0005899, Qiagen). El siRNA de AllStars control negativo (1027281, Qiagen) se incluyó como control negativo.