Extracto
pulmón (LC) con sus diferentes subtipos se conoce generalmente como un cáncer resistente a la terapia con el más alto tasa de morbilidad en todo el mundo. resistencia a la terapia de un tumor se cree que está relacionado a las células madre de cáncer (CSC) dentro de los tumores. Ha habido indicios de que el cáncer de pulmón se propaga y mantenido por una pequeña población de células madre cancerosas. Para estudiar esta cuestión se estableció un panel de 15 líneas celulares de cáncer de pulmón primarios (PLCCLs) de 20 tumores primarios frescos utilizando un robusto sistema de cultivo libre de suero. Posteriormente, nos hemos centrado en la identificación de células madre cancerosas de pulmón mediante el estudio de estas líneas celulares derivadas de 4 subtipos de cáncer de pulmón representativos como el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), carcinoma de células grandes (LCC), carcinoma de células escamosas (SCC) y adenocarcinoma (AC). Hemos identificado una pequeña población de células fuertemente positivas para CD44 (CD44
alto) y una población principal, que era ya sea débilmente positivo o negativo para CD44 (CD44
baja /-). Co-expresión de CD90 se redujo más abajo en la población de células madre putativa en PLCCLs de SCLC y LCC como las células que forman esferoides fueron encontrados principalmente dentro de la CD44
highCD90
+ subpoblación. Por otra parte, estos CD44
highCD90
+ células mesenquimales morfología de revelado, el aumento de la expresión de marcadores mesenquimales
N-cadherina
y
La vimentina
, aumento de los niveles de mRNA de los genes relacionados con células madre embrionarias
Nanog
y
Oct4 Opiniones y aumento de la resistencia a la radiación en comparación con otras sub-poblaciones estudiadas, lo que sugiere la CD44
highCD90
+ población un buen candidato para las células madre cancerosas de pulmón. Tanto CD44
highCD90
+ y CD44
highCD90
- células en el PLCCL derivados de esferoides SCC formada, mientras que el CD44
bajos /- células fueron que no tienen este potencial. Estos resultados indican que CD44
highCD90
+ subpoblación pueden representar células madre cancerosas en SCLC y LCC, mientras que en el subtipo de cáncer de pulmón SCC, los potenciales de CSC se encontraron dentro de la CD44
alta subpoblación.
Visto: Wang P, Q Gao, Suo Z, Munthe E, S Solberg, Ma L, et al. (2013) Identificación y caracterización de las células con cáncer Propiedades de celda en líneas celulares de cáncer de pulmón primario humanos de células madre. PLoS ONE 8 (3): e57020. doi: 10.1371 /journal.pone.0057020
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 26 de Junio, 2012; Aceptado: January 21, 2013; Publicado: 4 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca del Consejo de investigación de Noruega (SFI-CAST). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la teoría "cáncer de células madre" (CSC) implica una organización jerárquica dentro del tumor en el que las CSC representa el ápice de la jerarquía. De manera similar a las células madre normales, células madre cancerosas tienen la capacidad de someterse a la auto-renovación, así como la división celular asimétrica. Estas características permiten a los CAC clave para iniciar y mantener los tumores. Además del término clásico, es decir, CSC, varios términos se han utilizado en la literatura científica reciente para describir las características esenciales de los CAC, tales como la auto-renovación y el tumor de iniciar /mantenimiento de la propiedad. Entre otros son términos tales como célula de iniciar tumor (TIC), cáncer de la iniciación de células (CIC) y tumor de células que se propagan (TPC). En este informe vamos a utilizar el término CSC para caracterizar las células que fueron capaces de iniciar y sostener la formación de tumores en animales y cultivo líquido a largo plazo.
Los estudios actuales en el campo de la investigación de células madre del cáncer han proporcionado evidencia creciente de la existencia e identificación de células madre cancerosas utilizando varios marcadores biológicos específicos, tales como CD44, CD133 y CD90. Estos marcadores han sido ampliamente aceptados para el aislamiento de células madre cancerosas en tumores malignos hematológicos humanos [1], [2], así como en tumores sólidos [3] - [11]. Además, los CAC se han encontrado para ser más resistentes a la quimioterapia convencional y radioterapia que la principal población de células cancerosas más diferenciadas, lo que indica que la CSC puede permanecer en tumores residuales después del tratamiento y contribuir a la recurrencia del cáncer y la difusión. Los CCC, por lo tanto, los nuevos tratamientos dirigidos pueden llegar a prevenir la recurrencia del tumor y prolongar la supervivencia de los pacientes. La transición epitelial-mesenquimal (EMT) juega un papel importante en el desarrollo embrionario [12]. Hace que las células epiteliales a perder su comportamiento epitelial, cambiar su morfología y propiedades celulares para parecerse a células mesenquimales [13]. EMT se ha sugerido para contribuir al crecimiento invasivo y metastásico de muchos tipos de cáncer [14] - [17]. Un estudio reciente mostró que las células similares a las células madre a partir de los cánceres epiteliales que tiene un fenotipo mesenquimal marcadores asociados con expresas EMT [15].
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, y tiene un mal pronóstico con las tasas de supervivencia a 5 años de aproximadamente el 15%. De acuerdo con la heterogeneidad histológica, los carcinomas de pulmón se clasifican en cuatro subtipos principales: cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), carcinoma de células grandes (LCC) y adenocarcinoma (AC). En este estudio, siguiendo la hipótesis "El cáncer de células madre", nos hemos centrado en la identificación y caracterización de células madre cancerosas en los subtipos mencionados anteriormente de cáncer de pulmón.
El marcador de superficie celular CD133 ha sido identificado como un marcador fiable para Los CCC en algunos de los subtipos de cáncer de pulmón [18]. Sin embargo, la fiabilidad de este marcador como un marcador para el cáncer de pulmón CSC recientemente se ha cuestionado [19]. Por lo tanto, nos centramos en otro marcador, es decir CD44, que se ha sugerido para caracterizar células madre cancerosas en mama, próstata, cabeza y cuello, colorrectal, de páncreas y cáncer gástrico [3], [4], [9] - [11], [ ,,,0],20].
en este estudio, nos aprovechamos de los tejidos de cáncer de pulmón primario retirados durante la resección y se centró en el establecimiento de PLCCLs de tumores recién aisladas. Asumimos que PLCCL puede proporcionar una fuente más representativo y adecuado de las células de cáncer que se pueden utilizar para la identificación de células o poblaciones de células con propiedades de células madre. Establecimos primero con éxito un panel de las líneas celulares de cáncer de pulmón primarios de muestras recién obtenidas de los subtipos principales de cáncer de pulmón. Sobre la base de fenotípica detallada y el análisis funcional de líneas celulares representativas de SCLC, LCC y SCC, proporcionamos evidencia que indica que CD44
alta población puede albergar células madre cancerosas en estos subtipos de cáncer. Además, la co-expresión de CD90 se redujo más abajo en la población de células madre cancerosas en SCLC y LCC. La imagen de AC, sin embargo, sigue siendo menos claro, y en la actualidad no tenemos ninguna evidencia convincente de que cualquiera de los marcadores, es decir, CD44 y CD90, es característico de los CAC en este subtipo de cáncer en particular.
Materiales y Métodos
Recogida de muestras de tumor y el establecimiento de líneas celulares de cáncer de pulmón primario
Este estudio fue aprobado por el Comité regional de ética y la Junta del hospital Universitario de Oslo de Revisión Institucional y se realizó de acuerdo con las directrices de la Convenio de Helsinki. Tras la firma del consentimiento informado, los tejidos de cáncer de pulmón humano se obtuvieron de 20 pacientes con cáncer de pulmón primario (rango de edad 55-81 años) sometidos a lobectomía o neumonectomía en el Hospital Universitario de Oslo a partir de julio de 2007 a octubre de 2009. El diagnóstico histológico se determinó con base en las características microscópicas de células de carcinoma (Tabla 1).
tejido tumoral obtenido recientemente (dentro de 1-2 horas después de la extirpación quirúrgica) se lavaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, EE.UU.) que contiene penicilina-estreptomicina (PS, penicilina 100 U /ml y estreptomicina 100 mg /ml; Lonza, Bélgica). Los vasos sanguíneos y el tejido conectivo se retiraron cuidadosamente y luego la parte cancerosa se desmenuzó en trozos pequeños a menos de 1 mm
3 Uso de bisturí, seguido de un lavado extenso en medio RPMI-1640 y centrifugación a 300 g durante 5 min. Finalmente, las células se resuspendieron en medio RPMI-1640 que contiene medio de colagenasa II (Invitrogen, EE.UU.) a la concentración de 200 U /ml y se digirieron durante 2-4 horas a 37 ° C en un incubador humidificado. La digestión enzimática se detuvo cuando la mayoría de las células se encontraban en la única suspensión de células. Tras el lavado en medio RPMI-1640 y 3x centrifugación a 300 g durante 5 minutos, las células se transfirieron a matraces de cultivo tisular estándar recubiertas (Corning Life Sciences, EE.UU.) y se cultivaron en la Definido de queratinocitos medio libre de suero (DK-SFM) complementado con L -glutamine (Invitrogen, EE.UU.), EGF 20 ng /ml, FGF-básico 10 ng /ml (PeproTech Inc., USA), 2% B27 (Invitrogen, EE.UU.), PS y anfotericina B (0,25 mg /ml; Invitrogen, ESTADOS UNIDOS). Las culturas de todos los PLCCLs se mantuvieron a 37 ° C en un incubador humidificado con un 5% de CO
2. El medio de cultivo se cambió cada 2-3 días. Las células se pasaron después de la separación con TrypLE ™ Express (Invitrogen, EE.UU.), cuando las células alcanzaron un 80-90% de confluencia. Se realizaron todos los estudios con los cinco pasajes iniciales de PLCCLs establecidos.
El aislamiento de ácidos nucleicos y la huella de ADN de ensayo
Para establecer una huella genética de cada una de las nuevas líneas de células, ensayo de la huella dactilar genética se realizó en las PLCCLs representativos (LC004, LC006, LC007 y LC021), así como en una línea celular de re-establecida a partir de xenoinjerto de LC021. ADN genómico se aisló de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Invitrogen) sedimentos de células lavadas. Se obtuvo DNA genómico total usando el kit de tejido NucleoSpin (Macherey-Nagel, Alemania) según el protocolo del fabricante. La identidad de los perfiles de ADN se determinó por un perfil de STR usando Powerplex 16 System (Promega, Madison, WI). Este kit amplifica loci STR 15 y amelogenina para la identificación de género: Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, la SVA, Amelogenina, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818. Los productos de PCR eran de un tamaño determinado en un MegaBace 1000 (Applied Biosystems, EE.UU.) utilizando el software Fragmento de perfiles (GE Healthcare). Estas huellas fueron comparados con los perfiles de ADN en una base de datos de huellas dactilares de líneas celulares de cáncer de pulmón previamente establecido para asegurar su singularidad.
La inmunohistoquímica
Las líneas celulares de cáncer de pulmón de cultivo primario fueron embebidos en bloques de parafina de el método siguiente: las células del cultivo líquido se separaron y se lavaron con DPBS y posteriormente se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos. El sobrenadante se retiró cuidadosamente antes de que se añadieron 3 gotas de plasma y 2 gotas de trombina y se mezclaron por rotación del tubo. Se añadió formalina tamponada (4%) después de la mezcla se coagula. A continuación, la masa coagulada se coloca en el papel de lino antes de ser embebido en bloques de parafina por procedimiento estándar. Algunas secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para evaluar la morfología celular, mientras que otras secciones se utilizaron para el análisis de inmunohistoquímica (IHC). Cuatro secciones gruesas micrómetro se dewaxed y se hidrataron en etanol clasificado. Para desenmascarar los epítopos, las secciones fueron calentados a continuación, en diferentes tampones optimizados para diferentes anticuerpos. El pH bajo 10 mM de tampón de citrato (pH = 6,0) se utilizó para anticuerpos P53, Ber-EP4 y CD44. Para inhibir la peroxidasa endógena, las secciones fueron incubadas con 3% de peróxido de hidrógeno (DakoCytomation, EE.UU.) durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Las secciones fueron incubadas con el ratón primario anti-humanos p53, CD44 y Ber-EP4 (Dako, 1:1000, 1:100 y 1:300 diluciones, respectivamente) y (/1 dilución 1:40 Miltenyi Biotec, AC133 clon) CD133 anticuerpos durante 30 minutos a RT, seguido de incubación con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 30 minutos a RT y se tiñeron con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (Dako EnVision + System ™ peroxidasa (DAB) (K4007, DakoCytomation, EE.UU.)) antes de que se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron en Diatex. Todas las secciones fueron lavadas a fondo con tampón de lavado TBS-Tween (Dako Cytomation, EE.UU.) después de cada etapa de incubación. Las secciones de bloques de parafina que contienen seminoma y de cáncer de mama espécimen humano se utilizaron como controles positivos para anticuerpos P53, Ber-EP4 y CD44, respectivamente; Las secciones de la línea celular de cáncer de colon bloque de parafina que contiene células Caco-2 se utilizaron como control positivo para el anticuerpo CD133. anticuerpos de control de isotipo a la misma concentración se utilizaron como controles negativos. Todos los controles se realizaron y la reactividad de los anticuerpos se verificó antes de las aplicaciones experimentales de anticuerpos. Cada sección teñida fue revisado de forma independiente por dos patólogos.
Los experimentos con animales
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por y realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por el Consejo de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Oslo. NOD hembra /ratones SCID (NODSC-L-V /M-M NOD Homocigótica /mrkBOMTac-Prkdcscid; Taconic, Dinamarca) fueron adquiridos. Después de mantenerse en cuarentena de una semana para la vigilancia en el entorno estéril de la instalación para animales en el Hospital de la Universidad de Oslo, Rikshospitalet, edad NOD /SCID se utilizaron 4-5 semanas en todos los experimentos. Para evaluar la tumorigenicidad de PLCCLs establecidos, 3 × 10
6 células de cada línea celular suspendida en DK-SFM se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones NOD /SCID (3 ratones en cada grupo) en un volumen máximo de 100 l. Los ratones fueron inspeccionadas dos veces a la semana y el tamaño del tumor se midió con un compás. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical cuando el tamaño del tumor alcanzó un diámetro de 15 mm. Los xenoinjertos se retiraron a continuación y se utilizaron para el análisis histológico y el establecimiento de cultivos de células de líquidos. De serie xeno-trasplantes se realizaron con la línea celular LCC LC006 al implantar piezas de la vía subcutánea en ratones de xenoinjerto primaria secundaria NOD /SCID receptor. Se tomaron xenoinjertos derivados de cada pasaje a cabo y se fijaron en formalina al 4% tamponada para el análisis histológico.
La citometría de flujo y análisis de células activadas por fluorescencia (FACS)
La citometría de flujo se realizó un análisis sobre PLCCLs en la fase de crecimiento logarítmico. Las células se separaron primero con TrypLE ™ Express y se lavaron con DPBS. Resuspendieron las células se contaron y se transfirieron a 75 mm de poliestireno tubos de ensayo de fondo redondo (BD Falcon, EE.UU.) a una concentración de células de 1 x 10
6 células /ml, y posteriormente se tiñeron con anticuerpos en diluciones determina por valoración anterior. Se añadió tampón de tinción de inmunoglobulina humana (DPBS + 0,1% de albúmina de suero humano (Octapharma, Estocolmo, Suecia)) y 5 l de 10 mg /ml de globulina gamma (Gammagard, Baxter, Reino Unido) a las células para bloquear el FcR y minimizar la unión inespecífica de anticuerpos. Se añadieron fluorocromo anticuerpos monoclonales (mAb) acoplados a los tubos de ensayo a concentraciones de saturación y se incubaron las células durante 20 minutos en hielo, evitando exposición a la luz. Una evaluación de los marcadores se realizó con un panel de anticuerpos monoclonales (ver datos detallados en la Tabla 2) en cuatro PLCCLs que representan a cada subtipo de cáncer de pulmón. Las células teñidas con mAbs isotipo (BD Pharmingen, USA) sirvieron como controles negativos. Diferentes poblaciones de células se ordenan en función de las expresiones de CD44 por sí solos, o en combinación con CD90 usando un clasificador de células FACSAria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). datos de flujo se adquirieron en el FACSAria LSR II o II citómetro (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Los resultados se analizaron usando el software BD FACSDiva (versión 6.1.3). La viabilidad de las células clasificadas se revisa de manera rutinaria usando azul de tripano (Invitrogen, EE.UU.) tinción y por lo general era & gt; 70%
La proliferación celular ensayo
FACS CD44
alta. y CD44
baja /- las células a una densidad de 150 o 500 células por pocillo se sembraron por triplicado en 200 l DK-SFM con suplementos en placas de 96 pocillos revestidas estándar. Los pocillos que contenían medio solamente se usaron como un control de fondo negativa. Se dejó que las células se adhirieran a 37 ° C en un 5% CO
2 incubador humidificado durante un día antes de que se utilizaron en el ensayo de proliferación. La proliferación celular se midió durante los siguientes 8 días utilizando Una solución CellTiter 96® acuosa Ensayo de proliferación celular kit (Promega, Madison, WI) según el protocolo proporcionado por el fabricante. La absorbancia a 490 nm se midió en un lector de placas Wallac Victor2 (Perkin Elmer, Waltham, MA). Las curvas de crecimiento se elaboraron de acuerdo con el valor medio de absorbancia, en relación con el fondo.
2 dimensiones (2D) de formación de colonias de células individuales y la heterogeneidad de ensayo
CD44high y CD44
baja /- células de la LC004 línea de células SCLC y la línea celular LCC LC006 fueron ordenados y se sembraron a una sola célula por pocillo en estándar recubierto placas de 96 pocillos que contienen 200 l DK-SFM suplementado con EGF 20 ng /ml, básico-FGF 10 ng /ml, y 2% B27. chapado de células individuales fue validado por el microscopio de contraste de fase (Nikon, Alemania). Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C en un incubador humidificado de CO2 al 5%. Después de 2 semanas se contó el número de pocillos positivos que contienen colonias y se evaluaron las características morfológicas de las colonias. Para el estudio de auto-renovación y diferenciación de las células individuales, las colonias de diferentes tipos, es decir, holoclones, meroclones y paraclones, se sometieron a pases en serie por recoger y volver a sembrarlas por primera vez en 24 pocillos, a continuación, placas de 6 pocillos (Corning Ciencias de la Vida , EE.UU.), y, finalmente, en los frascos (Corning Life Science, USA) donde se ampliaron aún más. Se observó el crecimiento de colonias de ensayo de formación de colonias 2D sola célula y los cultivos líquidos a largo plazo derivados de estas colonias mediante microscopio de contraste de fase (Nikon, Alemania).
colonia 2D formación de ensayo de la eficiencia
FACS CD44
alta, CD44
baja /- y CD44
highCD90
+ y CD44
highCD90
- las células de las líneas celulares de SCLC LC004 y LCC LC006 se sembraron por triplicado en una densidad de 200 células por pocillo en una placa de recubrimiento estándar de 6 pocillos (Corning Life Science, EE.UU.) que contiene 5 ml DK-SFM con suplementos por pocillo. Las células clasificadas se mantuvieron en cultivo a 37 ° C en 5% de CO
2 incubador humidificado para ~ 10 días. Cuando las colonias generadas eran visibles y contenían & gt; 100 células, el sobrenadante se aspiró y los pocillos se enjuagaron dos veces con DPBS, se fijaron en 4% de formalina tamponada durante 15 min a RT seguido de tinción con cristal violeta durante otros 15 min a TA. Después de enjuagar el tinte, el número de colonias fue contado y la eficiencia de formación de colonias (CFE), es decir, el número de colonias por célula plateado, se calculó y se comparó entre los diferentes subpoblaciones.
esferoide ensayo de formación de
FACS ordenados células se sembraron a una densidad de 100 células por pocillo en una baja unión de ultra (ULA) placa de 96 pocillos (Corning Incorporated) que contienen 200 l DK-SFM con suplementos y se cultivaron a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora humidificada hasta que las células comenzaron a formar esferoides. El medio se cambió cada 2 días mediante la eliminación cuidadosamente 50 l de la capa superior del medio y reemplazándolo con un volumen igual de medio fresco. Los pozos fueron inspeccionados cada 2 días usando el microscopio de contraste de fase. Cuando los esferoides eran lo suficientemente grandes (la mayoría de los esferoides de células fueron & gt; 200 micras)., Se contaron y se fotografiaron (Nikon, Alemania) |
extracción de RNA y PCR en tiempo real análisis
ARN total fue extraído a partir de 10
células 5 FACS ordenados y posteriormente a transcripción inversa utilizando el kit Taqman-Cell-a CT (Applied Biosystems, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema de Taq-Man Ensayo del gen Expresión (Applied Biosystems, EE.UU.) en 7900HT sistema de PCR rápida en tiempo real (Applied Biosystems, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante y los datos fueron analizados por el 2.3 del software SDS ( Applied Biosystems, EE.UU.). Cada muestra, incluyendo no controles de plantilla, se realizó por duplicado. reacción de PCR sin plantilla sirvió como control negativo. condiciones de ciclado térmico fueron 50 ° C durante 2 min y 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, seguido de 1 min a 60 ° C. Los niveles de expresión se determinaron para los siguientes genes
Nanog gratis (ensayo ID 8S02387400_gl),
Oct4 gratis (ensayo ID Hs03005111_g1),
Sox2 gratis (ensayo ID Hs01053049_sl),
E-cadherina gratis (ensayo ID Hs01023895_m1),
N-cadherina gratis (ensayo ID Hs00169953_m1),
La vimentina gratis (ensayo ID Hs00958111_ml),
grupo de alta movilidad AT-gancho 2 (HMGA2) gratis (ensayo ID HS00171569_ml) y
fosfoglicerato quinasa 1 gratis (
PGK1
) (ensayo ID Hs99999906_m1). La expresión de los genes diana estaba relacionada con la expresión de
PGK1
y normalizado a las células de control no clasificados utilizando el método DDCT.
Se sembraron
Radiación sensibilidad del ensayo
células clasificadas
FACS a una densidad de 500 células por pocillo por duplicado en placas de 96 pocillos revestidas estándar (Corning Incorporated) que contiene 200 l DK-SFM con suplementos. Después de 24 horas de incubación convencional, las células en los cultivos de monocapa se irradiaron a temperatura ambiente con dosis de 1Gy, 2Gy y 4Gy, respectivamente, utilizando una unidad de rayos X Siemens Stabilipan, operado a 200 kV, 20 mA, con la filtración de cobre 0,5 mm (Siemens , Alemania). Después las células se cultivaron en condiciones de cultivo habituales durante 5 días adicionales con cambio de medio cada 2 días. El efecto de la irradiación en diferentes poblaciones de células se ensayó por el Una solución CellTiter 96® acuosa Ensayo de proliferación celular como se describió anteriormente. El efecto de la irradiación sobre la proliferación se da como la relación de inhibición y se calculó según la fórmula:. Relación de inhibición = ((no irradiado así el control de la absorbancia - irradiado bien absorbancia) de control /no irradiado bien absorbancia) x 100%
> 1. líneas celulares de cáncer de pulmón primario
Para proporcionar una base para el presente estudio, se estableció una novela, método robusto para el cultivo de células de cáncer de pulmón de los carcinomas de pulmón recién resecados (ver materiales y métodos). Quince líneas celulares de cáncer de pulmón primarios se establecieron con éxito a partir de 20 tejidos de cáncer de pulmón eliminado. Estos incluyen 7 CCAA, 6 CCE, 1 LCC y 1 SCLC (Tabla 1). El-tasa de éxito del establecimiento de cultivos primarios fue de 75%. La mayoría de los fallos se produjo en la primera parte del estudio, antes habían sido determinadas las concentraciones óptimas de los factores de crecimiento. El DK-SFM hizo apoyar el crecimiento selectivo de células epiteliales típicos, inhibiendo claramente el crecimiento de fibroblastos coexistentes. Esto fue en contraste con los cultivos que contienen suero utilizado en el principio, en que se produjo un rápido crecimiento excesivo por los fibroblastos (datos no mostrados). Se obtuvieron células en monocapa con una morfología epitelial típica a muy alta pureza en cada uno de los PLCCLs establecidos (Figura 1). Las líneas celulares primarios mantenidos en estas condiciones se hicieron pasar por varias generaciones con el paso más largo hasta ahora más de 30 generaciones, sin ningún signo de disminución del crecimiento.
A. La línea de células LC004 SCLC; línea de células B. La LCC LC006; C. El AC línea de células LC007; D. El SCC línea celular LC021. Todas las imágenes fueron representativas de las líneas celulares de cáncer de pulmón de cultivo primario en el segundo pasaje. magnificación microfotografía, × 200.
Para asegurar que las líneas celulares establecidas eran de origen único y no contaminados por las líneas celulares establecidas previamente [21], se generaron perfiles de ADN utilizando un conjunto de marcadores microsatélites altamente polimórficos de un subconjunto de las líneas celulares que representan los cuatro tipos diferentes de cáncer de pulmón. Los resultados demostraron que las cuatro líneas celulares eran únicas y no relacionado (Sl Tabla).
2. Fenotipo de cáncer PLCCLs y los padres tienen tejidos similares /son comparables para la expresión de P53, Ber-EP4 y CD44
Nos hemos centrado nuestro trabajo en cuatro PLCCLs que representan los cuatro subtipos de cáncer de pulmón: la línea de células LC004 SCLC, el LCC línea de células LC006, LC007 la línea celular de CA y la línea de células LC021 SCC. De los PLCCLs representativos seleccionados, hemos preparado los bloques de parafina y las secciones de estas líneas celulares fueron teñidas con H & amp; E. Evaluación morfológica de los PLCCLs confirmó su origen epitelial con signos de transformación maligna. Por otra parte, las líneas celulares primarios derivados de cada uno de los cuatro subtipos de cáncer de pulmón eran morfológicamente heterogénea tanto en el nivel celular y nuclear (Figura 2A).
A. H & amp; E tinción de las 4 líneas celulares de cáncer de pulmón primarios representativos de los diferentes subtipos de cáncer de pulmón: la línea de células LC004 SCLC; LC006 la línea celular LCC; LC007 la línea celular de CA y la línea de células LC021 SCC. Las células derivadas de los cuatro subtipos de cáncer de pulmón mostraron heterogeneidad en la morfología celular y nuclear. Las células de cada línea celular primaria tenían la morfología del epitelio. magnificación microfotografía, × 200. B. Análisis de la expresión de P53, Ber-EP4 y CD44 en las 4 líneas de células primarias y tejidos tumorales sus correspondientes archivos de los pacientes. Todas las líneas celulares primarios investigados mostraron tinción positiva difusa para P53, excepto el tejido original de SCC LC021 línea celular. antígeno de membrana epitelial Ber-EP4 era ampliamente positivo en todos los tejidos originales de cáncer de pulmón y difusa positivo en todas las líneas de células primarias. CD44 mostró tinción positiva difusa con diferente intensidad en las líneas de células primarias y tejidos de cáncer de sus correspondientes archivos de los pacientes, excepto débilmente positivo en el tejido tumoral original de la línea de células LC007 AC. Las secciones de bloques de parafina que contienen seminoma y de cáncer de mama espécimen humano se utilizaron como controles positivos para anticuerpos P53, Ber-EP4 y CD44, respectivamente. magnificación microfotografía, × 200.
supresores de tumores mutaciones de la proteína p53 es un sello distintivo del cáncer y es por lo general hasta reguladas [22]. A continuación comparó los niveles de expresión de p53 en las secciones de serie a partir de tejidos tumorales los archivos de los pacientes y los PLCCLs recién establecidas utilizando IHC. Los cuatro PLCCLs mostraron tinción positiva difusa para P53. El mismo tipo de tinción se observó en tejido de cáncer del paciente original con la excepción de que el tejido parental SCC, que fue negativa para p53 (Figura 2B). Curiosamente, la línea celular derivada de la SCC (LC021) expresó P53. Los niveles de expresión de la Ber-EP4 y CD44 se investigó de la misma manera. Los tejidos tumorales de archivo de los pacientes y sus correspondientes PLCCLs mostraron tinción positiva en términos generales para el marcador pan-epitelial Ber-EP4. Difusa tinción positiva con diferente intensidad en los tejidos tumorales de los archivos de los pacientes y sus líneas de células correspondientes se veía con la tinción de CD44, excepto para el tejido tumoral de los padres AC, que fue débilmente positivo sobre la mayor parte de la sección estudiada (Figura 2B, Tabla S2). La expresión de CD133 en los tejidos tumorales parentales también se investigó mediante tinción IHC. CD133 muestra un patrón más variable, con todos los tumores parentales ser negativo, excepto el SCLC (LC004), donde se observó la expresión en zonas aisladas (datos no mostrados). Todos PLCCLs derivados de los correspondientes tejidos de cáncer de los padres fueron uniformemente negativas para la expresión CD133 mediante tinción IHC.
En conjunto los experimentos resumidos sugieren que los PLCCLs en los primeros pasajes (hasta 5) son representativas del tejido tumoral de los padres en los cuatro subtipos de cáncer.
3. Los cultivos primarios de células de cáncer de pulmón son tan tumorigénico como xenotrasplantes
potencial maligno de las PLCCLs se investigó en un modelo animal experimental. Un ensayo de tumorogénesis se realizó en ratones de 5 a 6 semanas de NOD /SCID hembra. Siete de los PLCCLs se ensayaron en los primeros pasajes y todos eran capaces de generar los xenoinjertos dentro de 3 semanas después de la inyección. Las cuatro líneas celulares de SCLC LC004-P4, LCC LC006-P2, SCC LC021-P2 y P3-LC007 AC, fueron elegidos para estudios posteriores, la propagación de los tumores subcutáneos a granel en 2/2, 3/3, 2/2 y 2/2 animales, respectivamente. Por otra parte, hemos sido capaces de volver a PLCCLs establecidos
in vitro
de los xenoinjertos tomadas de estos animales (Figura S1). Además, la huella de ADN fue útil para realizar un seguimiento de las líneas de células individuales a partir de los xenoinjertos de LC021 (Tabla S1 y Figura S1).
Sobre la base de estos resultados se concluye con las PLCCLs la capacidad tumorigénesis en ratones inmunodeficientes puede fácilmente y de forma reproducible generarse a partir de los cuatro subtipos de cáncer de pulmón y que se propaga en
in vitro
cultivo líquido.
secundaria xenotrasplantaciones se llevó a cabo mediante la implantación subcutánea piezas del xenotrasplante LCC primaria (LC006) en destinatario secundario . principal receptor trasplantado con células LC006 reveló metástasis pulmonares, además de tumor subcutáneo. Sin embargo, en los siguientes xeno-trasplantes de serie, se formaron solamente por vía subcutánea tumores. Cuando se compararon las características morfológicas de la PLCCL y los xenoinjertos de serie y los tejidos de los padres, que muestran una alta similitud apoyo a la observación de que PLCCLs y xenotrasplantes representan el tumor original.
4. La expresión de CSC marcadores de superficie celular asociada es dinámico en el cultivo a largo plazo de PLCCLs
Para identificar las subpoblaciones de células madre del cáncer de pulmón putativos en las líneas celulares de cáncer primario, se determinó la expresión de un amplio panel de marcadores previamente descrito como diferencialmente expresado en una variedad de células madre de cáncer humano. Los datos de seis PLCCLs representativos analizados en diferentes pasajes se dan en la Tabla S3. El perfil de expresión reveló un patrón variable con algunas características comunes. En dos líneas de células pequeñas (SCLC LC004 y LC021 SCC) probado en varias ocasiones durante el fenotipo cambió a largo plazo
in vitro en Francia culture (Tabla S3). Algunos marcadores (CD29, CD49b y CD49f) se expresaron de manera uniforme en altos niveles en todos los pasajes y todas las líneas celulares estudiadas, mientras que otros, tales como CD44, CD166 y CD142, mostraron una mayor expresión en más tarde en comparación con pasajes anteriores. se observó lo contrario para CD90 y CD326 expresión, donde la proporción de células positivas disminuyó con el aumento de número de pases. Curiosamente, distintas subpoblaciones menores que expresan CD117, CD184 y CD15 estaban presentes en cada una de las líneas celulares ensayadas. CD24 y CD326 mostraron nivel de expresión variable en diferentes PLCCLs. La expresión de CD133 fue baja, como prueba de dos anticuerpos diferentes, y varió entre 0 a 2,4% de confirmar los resultados obtenidos por IHC.
Por lo tanto, el nivel de expresión y la frecuencia de CD44 y /sub positivo o CD90 -populations era dinámico, revelando la expresión diferencial de los antígenos en diferentes puntos temporales. Estos distintos cambios que se produjeron durante el cultivo a largo plazo indican ya sea posible selección de ciertas subpoblaciones en la cultura o la respuesta a largo plazo a
in vitro
condiciones de cultivo in.
Con todo, nuestros resultados (SEGUNDO). a. segundo. do. a. segundo.