Extracto
Dado que los cambios en las membranas basales son los indicadores críticos para la diferenciación de lo normal, precanceroso, y tejidos cancerosos del colon, la visualización directa de estas señales de advertencia es esencial para el diagnóstico precoz y el tratamiento de cáncer de colon. A continuación, presentamos la segunda generación armónica (SHG) microscopia puede sondear los cambios de las membranas basales en diferentes etapas de cáncer de colon. Nuestros resultados también muestran la capacidad de utilizar los análisis cuantitativos de imágenes para cuantificar estos cambios en diferentes etapas del cáncer. Estos resultados sugieren que SHG microscopía tiene el potencial en la formación de imágenes de etiquetas libremente los cambios de las membranas basales para distinguir efectivamente entre los tejidos de colon normales, precancerosas y cancerosas. A nuestro entender, esta es la primera demostración de la dinámica de los cambios de la membrana basal en diferentes etapas del cáncer de colon utilizando fuente enteramente intrínseca de contraste
Visto:. Zhuo S, Yan J, Chen G, H Shi, Zhu X , Lu J, et al. (2012) Imaging-etiqueta libre del sótano Membranas diferencia normales, precancerosas y cancerosas del colon, tejidos por microscopía de generación del segundo armónico. PLoS ONE 7 (6): e38655. doi: 10.1371 /journal.pone.0038655
Editor: R. Mitsunobu Kano, Universidad de Tokio, Japón
Recibido: 13 Enero, 2012; Aceptado: May 8, 2012; Publicado: June 8, 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhuo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El proyecto fue apoyado por el Programa de Changjiang eruditos y Equipo de investigación innovadora en la Universidad (Grant No. IRT1115), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (. subvención Nº 60908043, 30970783, 81101209), y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Fujian (Grant núms . 2011J01341, 2010J01136, 2010J01321). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de colon es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en humanos [1]. En general, se trata fácilmente si se diagnostica en una de las etapas de pre-invasiva [2], [3]. Sin embargo, la detección de las lesiones tempranas sigue siendo un reto. Con el desarrollo del cáncer de colon, las células malignas alteran las membranas basales (interfaces de cripta y lámina propia), tales como las variaciones en el tamaño de la membrana basal y la densidad, la pérdida de la membrana basal [4], [5]. Los cambios en la membrana basal son algunos de los indicadores más importantes para el desarrollo del cáncer de colon [5], [6]. Sin embargo, estas señales de advertencia han sido hasta el momento sólo detectable mediante examen histológico de muestras de biopsia [4], [7]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos y no invasiva
In situ
modalidad de imagen para sondear estas señales de advertencia es de gran importancia médica.
mucosa del colon contiene la cripta, la membrana basal y la lámina propia, como se muestra en la Fig. 1. También se ve en la figura 1 que el
en la cara
sección de la mucosa del colon puede observar simultáneamente la cripta, la membrana basal y la lámina propia. Desde la cripta se compone principalmente de células epiteliales columnares y células caliciformes que no es efectivo en la generación de señales de segunda generación armónica (SHG) y la lámina propia está compuesta principalmente de colágeno que es capaz de emitir señales fuertes de SHG [8] - [10], la microscopía SHG puede ser útil para sondear los cambios de la membrana basal que no son accesibles por otras modalidades de imagen. microscopía SHG es una técnica óptica no lineal y tiene las ventajas de ser de la etiqueta libre, inherente resolución en tres dimensiones, en el infrarrojo cercano de excitación para la penetración óptica superior, inferior fotodaño, y capaces de proporcionar información cuantitativa [11] - [15]. Hasta ahora, no hay informes para poner a prueba el potencial de esta técnica para la etiqueta libremente visualizar las membranas basales como indicadores para diferenciar normales, precancerosas y cancerosas tejidos del colon, y esto es lo que nos motivó a realizar este trabajo utilizando esta técnica.
resultados
resultados de patología
de las 72 muestras de biopsia de colon fotografiados, 20 fueron diagnosticados como normales, 28 con adenoma, y 24 con adenocarcinoma. Para el análisis estadístico, las muestras de tejido se dividieron en caso normal (n = 20), precáncer (adenoma, n = 28), y el cáncer (adenocarcinoma, n = 24).
GAA Imágenes
para investigar los cambios en las membranas basales en diferentes etapas del cáncer de colon, el representante en face imágenes SHG de lo normal, precanceroso, y tejidos cancerosos del colon se muestran, respectivamente, en la Fig. 2. Como era de esperar, la técnica de formación de imágenes SHG también puede visualizar el contorno de las membranas basales (círculos rojos). Se ve en la Fig. 2 que las grandes diferencias morfológicas en el contorno de las membranas basales se observan en las diferentes etapas de cáncer de colon. En caso normal, se observa una disposición de panal de las membranas basales regulares de forma redonda con un tamaño uniforme. En las lesiones precancerosas, las membranas basales de forma tubular con un tamaño mayor y menor densidad de población se obtienen en comparación con el caso normal. En el cáncer, las membranas basales que se encuentran en estado normal faltan.
Análisis cuantitativo de las membranas basales
La Tabla 1 muestra la media y la desviación estándar de la longitud del círculo de la membrana basal y la población la densidad de las membranas basales de los tejidos del colon normales, precancerosas y cancerosas. En detalle, la longitud del círculo de la membrana basal en condiciones normales es 342,7 ± 27,2 micras (n = 60 zonas de 20 biopsias), en el precáncer es 695,8 ± 79,1 micras (n = 84 áreas de 28 biopsias), y en el cáncer es 1767.8 ± 166.3 m (n = 72 zonas de 24 biopsias). Además, la densidad de población de las membranas basales en condiciones normales es de 103,2 ± 10,6 /mm
2 (n = 60 zonas de 20 biopsias), en el precáncer es 27,1 ± 6,3 /mm
2 (n = 84 zonas de 28 biopsias), y en el cáncer es 0,3 ± 1,2 /mm
2 (n = 72 zonas de 24 biopsias). Estos resultados presentan la longitud del círculo de la membrana basal y la densidad de población de las variables de las membranas basales, que mostró diferencias significativas (
P Hotel & lt; 0,05) entre la normal, precanceroso, y cancerosas categorías tejidos basado en pruebas suma de rangos de Wilcoxon unparired .
Discusión
Este trabajo presenta los grupos de autoayuda que puede microscopía de sonda de manera efectiva los cambios en las membranas basales en diferentes etapas de cáncer de colon. En particular, los grupos de autoayuda microscopía permite la identificación de dos características morfológicas (la longitud del círculo de la membrana basal, la densidad de población de las membranas basales), que muestran diferencias significativas en las diferentes etapas del cáncer de colon. Estas observaciones son consisten con resultados inmunohistoquímicos (que se muestra en la Fig. 3), y también confirmar el hecho de [4], [16] que antes de que el cáncer se convierta en invasiva, en etapas conocidas como lesiones precancerosas, células malignas alteran el contorno de la membrana basal, pero no lo hacen destruir la membrana basal; como el cáncer de convertirse en células malignas invasivas, (no hay señales de SHG) sustituyen a las fibras de colágeno, lo que lleva a la pérdida de la membrana basal.
Como se ha señalado, los grupos de autoayuda microscopía es capaz de visualizar la etiqueta-libremente los cambios de las membranas basales en diferentes etapas de cáncer de colon y, como tal, puede actuar como un
In situ
herramienta histológico que está libre de la obligación de etiquetado de los métodos convencionales. Por otra parte, sobre la base de los análisis de la imagen, hemos sido capaces de obtener alguna información cuantitativa en diferentes etapas del cáncer. Por lo tanto, SHG microscopía nos da tanto un morfológica, así como cuantitativo, herramienta mediante la cual para sondear los cambios de las membranas basales en diferentes etapas de cáncer de colon. La importante de esta capacidad surge del hecho de que los cambios en la membrana basal desempeñan un papel importante en el desarrollo del cáncer de colon [5], [6], y estos cambios han hasta ahora sólo ha sido detectable mediante examen histológico de muestras de biopsia [4], [7]. SHG microscopía hace que sea posible la observación de estas variaciones, y midiendo el tamaño les permite membrana basal y la densidad de población que se determinen. Estos resultados indican la promesa de imágenes SHG para las clínicas, y como herramienta de investigación biomédica para estudiar la dinámica de los cambios de la membrana basal en diferentes etapas de cáncer de colon. Además, debe señalarse que aunque las lesiones inflamatorias no se consideraron en este trabajo, de formación de imágenes SHG debe ser capaz de distinguir entre lesiones cancerosas e inflamatorias debido a la pérdida de las membranas basales en los tejidos cancerosos. En este contexto, se ve que la microscopía SHG tiene el potencial en la visualización de etiqueta libremente los cambios de las membranas basales como indicadores para diferenciar los tejidos del colon normales, precancerosas y cancerosas.
En conclusión, este trabajo demuestra el potencial de SHG microscopía para etiquetar-libremente la imagen de los cambios en las membranas basales, incluyendo el tamaño de la membrana basal y la densidad de población, los indicadores importantes del desarrollo del cáncer de colon. Para nuestro conocimiento, este es el primer momento de mostrar cómo las imágenes SHG se puede utilizar para visualizar cuantitativamente la dinámica de los cambios de la membrana basal en diferentes etapas de cáncer de colon. En el trabajo futuro, se llevará a cabo un estudio a gran escala para determinar la sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo, el valor predictivo positivo con respecto al análisis histológico tradicional. La ventaja de esta técnica sobre los procedimientos de diagnóstico convencionales es que los tejidos no están obligados a someterse a corte en rodajas, la inclusión en parafina, o proceso de congelación-descongelación, reservando así el potencial de
in vivo
imágenes. Con la capacidad de cuantificar los cambios de la membrana basal, como se muestra en el presente estudio, es previsible que una endoscopia basada en los grupos de autoayuda [17] - [19] podría facilitar y beneficiar a
in vivo
estudios y diagnósticos en los años por venir.
Materiales y Métodos
Tejido de muestras
se obtuvieron un total de 72 muestras de biopsia de colon frescos de treinta y dos pacientes fueron sometidos a biopsia endoscópica. Antes de la participación en el estudio, todos los pacientes firmaron un consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Tumores del Hospital Provincial de Fujian de la opinión. La muestra de biopsia se colocó en el plato de fondo de vidrio (MatTek, cubreobjetos: 0,085-,13 mm) para obtener imágenes de SHG. En este trabajo, la preparación de las muestras y las imágenes SHG se completaron dentro de 1 hora después de la biopsia endoscópica.
Imaging Instrumentación
microscopía de SHG se logró mediante un sistema óptico no lineal que se ha descrito anteriormente [20] . En pocas palabras, las imágenes de los GAA fueron adquiridos utilizando un sistema comercial de escaneo láser microscópico de imagen (Zeiss LSM 510 META, Jena, Alemania) acoplado a un femtosegundo Ti: zafiro láser (Coherente Mira 900-F) que opera a 800 nm. La dirección de polarización de la luz láser es la polarización horizontal. Se empleó un objetivo de inmersión en aceite (× 63 y NA = 1,4) para enfocar el haz de excitación en muestras de tejido (potencia media inferior a 15 mW) y también se utilizó para recoger las señales de los grupos de autoayuda intrínsecas de retrodispersión. Las imágenes se obtuvieron a 2,56 mu s por píxel. Una etapa de concentración de la multa (200 HRZ etapa, Carl Zeiss) se utiliza para traducir las muestras después de la exploración XY de las muestras para obtener una imagen de gran superficie, y para cambiar la posición de enfoque para la grabación de varias secciones ópticas.
Análisis histología
Después de imágenes SHG, las muestras de tejido fueron fijadas en formol al 10% y se preparó para el examen patológico utilizando protocolos estándar. H & amp; secciones y las secciones teñidas con anticuerpos primarios de colágeno IV se obtuvieron de cada espécimen E-manchadas, y revisados por un patólogo certificado
La cuantificación de las membranas basales
Para cuantificar mejor los cambios. se seleccionaron las membranas basales en diferentes etapas del cáncer de colon, tres 415 micras por 490 micras áreas rectangulares en cada biopsia para el análisis cuantitativo. En este trabajo, se realizaron dos análisis. En primer lugar, se midió la longitud del círculo de la membrana basal. Por otra parte, para representar mejor este valor, si hay una pérdida de las membranas basales, la longitud del círculo de la membrana basal se establece en la longitud del círculo de la sección rectangular seleccionado. En segundo lugar, se calculó el número total de las membranas basales por unidad de superficie, es decir, la densidad de población de las membranas basales. En este trabajo, cada análisis cuantitativo se realizó en todas las biopsias examinadas.
Análisis estadísticos
Los datos cuantitativos se resumen con la media y la desviación estándar (SD), que se muestran como "media ± SD" . Resumen estadístico de la longitud del círculo de la membrana basal y la densidad de población de las membranas basales (en relación con la determinación patológica) surgir en múltiples secciones de cada una de las 72 muestras de biopsia de colon tomadas de treinta y dos pacientes. para los fines del análisis estadístico, la mediciones de las secciones individuales se supone que constituyen observaciones independientes. con los datos de este estudio (que se caracteriza por la aparente homogeneidad de valores dentro de las categorías de diagnóstico), las técnicas estadísticas más complejas se consideraron innecesaria, ya que no cambiarían las medias de la muestra, ni habría que conducen a las desviaciones estándar de muestra más grandes. en este trabajo, las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon se llevaron a cabo para determinar si existen diferencias significativas en la longitud del círculo de la membrana basal y la densidad de población de las membranas basales entre individuos normales, precancerosas, y tejidos cancerosos (la comparación no apareado ). pruebas no paramétricas de Wilcoxon fueron elegidos para la comparación no apareado, debido al tamaño pequeño de la muestra. Exacta
P-valores se calcularon
, y las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los
P
-valores fueron inferiores a 0,05.
Reconocimientos
los autores desean agradecer al editor y dos revisores anónimos por sus comentarios constructivos, que eran muy útiles para el fortalecimiento de la presentación de este documento.