Extracto
La metástasis es una causa importante de mortalidad en pacientes con cáncer. Invadopodios se consideran estructuras cruciales que permiten a las células cancerosas para penetrar a través de la matriz extracelular (ECM) mediante el uso de metaloproteinasas de la matriz (MMPs). Anteriormente, hemos aislado una sublínea altamente invasiva A431-III a partir de células A431 parentales mediante el ensayo de cámara de Boyden. Las células A431-III poseen habilidades superiores invasivas y migratorias, niveles elevados de MMP-9 y una transición epitelio-mesenquimal fenotipo mejorado (EMT). En este estudio, hemos descubierto que las células A431-III tenían un mayor potencial para formar invadopodios y una capacidad mejorada para degradar ECM en comparación con las células A431 originales. También observamos los niveles de fosforilación mejoradas de Cortactin y Src en células A431-III; estas proteínas fosforiladas se han notificado a ser los principales reguladores de la formación invadopodios. Flavonoides, casi distribuidos de forma ubicua en plantas de alimentos y productos alimenticios vegetales, se ha documentado que presentan propiedades antitumorales. Por lo tanto, fue de gran interés para explorar los efectos de los antioxidantes de flavonoides sobre la actividad metastásica de las células A431-III. La exposición de células A431-III a dos potentes flavonoides en la dieta, a saber, la luteolina (Lu) y quercetina (Qu), causó inhibición de la formación invadopodios y decremento en la degradación de ECM. Llegamos a la conclusión de que Lu y Qu atenúan la fosforilación de cortactin y Src en células A431-III. Como consecuencia de ello, sobreviene una interrupción de la generación de invadopodios y la supresión de la secreción de MMP. Estos cambios, en conjunto, lograr una reducción en la metástasis
Visto:. Lin Y-C, Tsai P-H, Lin C-Y, Cheng C-H, Lin T-H, Lee KPH, et al. (2013) Impacto de los flavonoides en la secreción metaloproteinasas de la matriz y de la Formación invadopodios en células altamente invasivas A431-III de cáncer. PLoS ONE 8 (8): e71903. doi: 10.1371 /journal.pone.0071903
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 6 Abril 2013; Aceptado: 4 Julio 2013; Publicado: 21 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Academia Sinica de Taiwán proyecto temático (AS-96-TP-B06 para MTL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses: Dra. C. Chithan Kandaswami es empleado por Castle Hills Salud. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La metástasis, la propagación del cáncer desde el lugar de origen a los tejidos distales en el cuerpo , se considera que el contribuyente principal de mortalidad en la mayoría de los tipos de cáncer [1]. Más del 90% de las muertes asociadas al cáncer se deben a la metástasis y sin embargo, los mecanismos que controlan la metástasis aún no se han dilucidado aún más [2]. MMPs son las enzimas proteolíticas críticos mejor documentados que están asociados con la metástasis del tumor [3]. Para facilitar la metástasis, las células tumorales dependen de la actividad de más de una MMP y de otras enzimas degradantes más generales con el fin de que puedan cruzar las barreras de tejidos que se encuentran durante el proceso de invasión. Se cree que las MMP degradan la ECM, y que esta acción permite a las células tumorales para migrar, invadir y extenderse a varios sitios secundarios en el cuerpo donde forman metástasis. MMPs regular el microambiente del tumor, y su expresión y la activación se incrementan en casi todos los cánceres humanos en comparación con aquellos en el equivalente de tejido normal a la del cáncer [4]. Una gran cantidad de información acumulada recientemente sugiere que las MMP son reclutados para estructuras superficiales únicas, que se denominan invadopodios, y que son capaces de someterse a la secreción de [5], [6].
invadopodios fueron descubiertos por primera vez en los fibroblastos transformado por el oncogén v-src, que codifica una tirosina quinasa no receptor constitutivamente activa [7] v-src, y el término fue acuñado en 1989 [8]. Invadopodios están especializados salientes de membrana a base de actina que se encuentran en las células cancerosas que degradan el ECM a través de la localización de las proteasas [9]. Su capacidad para mediar la degradación de ECM sugiere un papel crítico para invadopodios en la invasión del cáncer y la metástasis. Invadopodios constan de muchas proteínas reguladoras, tales como actina cortactin, N-WASP, Arp2 /3 y cofilina [10]. Aunque estas proteínas reguladoras de actina también son componentes de otros salientes de membrana a base de actina, la capacidad degradante de la matriz se destaca como un índice importante, esencial y predecible de identificación invadopodios. Tres MMP-2, MMP, MMP-9 y MMP-MT1 [11], se informa a ser reclutados para invadopodios con el fin de llevar a cabo su capacidad degradante. Sin embargo, los mecanismos de aplicación por parte MMP son transportados y dirigidos a la invadopodios, y aún más secretadas siguen siendo en gran parte desconocido.
En los últimos años, varios jugadores moleculares operativos en invadopodios han sido definidas por los estudios mutacionales, investigaciones de interferencia de ARN o por el despliegue de anticuerpos inhibidores. Entre estos, el papel central de la no receptor de tirosina quinasa Src en la regulación invadopodios ha deducido; estudios posteriores han demostrado que la actividad quinasa Src es esencial para la formación y el funcionamiento invadopodios [12], [13]. En efecto, esta actividad de Src quinasa en sí misma llevó al descubrimiento de invadopodios. La fosforilación de sus proteínas componentes es fundamental para la regulación invadopodios y esto implica principalmente por la fosforilación de la tirosina quinasa Src. Un número de sustratos Src, tales como cortactin, Tks5, dynamin2, AMAP1 /ASAP1 y N-WASP, se han localizado en el invadopodios y se requiere por ellos para ser activo [10], [14], [15]. Una vez Src quinasa es activada por la señalización de integrina aguas arriba o el factor de estimulación del crecimiento, estas proteínas se someten a la fosforilación de tirosina; esto entonces regula su función como adaptadores o les permite interactuar entre sí durante el montaje de las redes de actina [12], [16]. La mutación de los sitios de fosforilación de la tirosina en estas proteínas inhibe la formación de invadopodios y en funcionamiento [15], [17], que apoya aún más la importancia de la fosforilación de la tirosina a la formación invadopodios. Además de tirosina fosforilación por Src, proteína quinasa C también se ha informado que en sinergia con Src y para participar en la regulación de invadopodios mediante la fosforilación de serina o treonina [16].
Cortactin, una proteína reguladora de actina que funciona durante ambas etapas de activación y estabilización de la actina de ramificación, ha sido recientemente llamar la atención prominente debido a su papel en la formación invadopodios [18]. Cortactin se identificó inicialmente como un sustrato de tirosina quinasa Src [19]. Fue nombrado Cortactin ya que se localiza en las estructuras de actina cortical. cortactin humanos está codificada por
CTTN
(anteriormente
EMS1
) en el cromosoma 11q13, que a menudo se amplifica en varios tipos de cáncer, como el de mama, cabeza y cuello [20]. La amplificación de genes que resulta en una sobreexpresión de cortactin se ha encontrado que se asocia con una mayor metástasis /invasión y un mal pronóstico [21]. De acuerdo con su capacidad de unión a actina, cortactin se ha encontrado para localizar a las estructuras de células periféricas, tales como lamellipodia y invadopodios. Estudios recientes destinados a la exploración de los mecanismos moleculares que regulan la polimerización de actina antes del reclutamiento MMP han sugerido que la fosforilación cortactin es crucial para la formación y maduración invadopodios [22] Estos hallazgos sugieren que la Src tirosina quinasa y su sustrato cortactin juntos juegan papeles muy importantes en el cáncer la invasión y la migración [23]
.
para determinar cómo las células controlan la formación invadopodios, varios investigadores han proyectado una colección de compuestos farmacológicamente activos con el fin de identificar productos químicos que son capaces de inhibir el proceso. flavonoides de plantas han sido reconocidos desde hace tiempo como que poseen efectos anti-tumorales y anti-diferenciación [24] - [27]. Anteriormente, hemos identificado dos constituyentes flavonoides en la dieta, Lu, una flavona, y Qu, un flavonol, ya que algunos de los flavonoides vegetales más potentes en términos de sus
in vitro
actividades biológicas. Exhiben una variedad de efectos contra el cáncer, tales como la atenuación de las actividades de crecimiento celular y la quinasa, la inducción de la apoptosis, el deterioro de la diferenciación, la supresión de la secreción de MMP, la reducción de la adhesión de células tumorales, la inhibición de la metástasis y la disminución de la la angiogénesis [28] - [31]. Aunque estos dos flavonoides son potencialmente eficaces como compuestos anti-invasivos, hasta la fecha ningún estudio ha evaluado la influencia de Lu y Qu sobre la formación y el funcionamiento invadopodios. En estudios anteriores, hemos documentado que tanto Lu y Qu son capaces de mitigar las actividades de la tirosina quinasa y en gran medida deprimir la secreción de MMP en células tumorales [26]. La apreciación de la relevancia e importancia de la inhibición de la actividad quinasa y la secreción de MMP por estos flavonoides nos ha llevado a evaluar su impacto en acontecimientos que rodean la formación invadopodios y en funcionamiento.
Materiales y Métodos
Materiales
línea celular de cáncer humano epidérmico A431 se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Se aislaron las células altamente invasivos A431-III en nuestro laboratorio a partir de las células parentales tumorales A431 (A431-P) [32]. suero bovino fetal (FBS) y RPMI-1640 se obtuvieron de GIBCO (Grand Island, NY). MMP-9 siRNA se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA). Los cebadores de PCR se adquirieron de Purigo Biotech (Taipei, Taiwán). La quercetina se adquirió de Nacalai Tesque (Kyoto, Japón). La luteolina se obtuvo de EXTRASYNTHESE (Genay, Francia). El anticuerpo anti-cortactin se obtuvo de Epitomic (Burlingame, CA). El anticuerpo anti-fosfo-cortactin (Y421) fue adquirido de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). anticuerpo anti-Src fue adquirido de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). -Src Anti-fosfo anticuerpo (Y418) se adquirió de Abcam (Cambridge, MA). El anticuerpo anti-Tks5 y GM6001 se obtuvieron de Millipore (Billarica, MA). Anti-MT1-MMP, TIMP1, los anticuerpos fueron adquiridos de TIMP2 Genetex (Irvine, CA).
Preparación de lisados de células
Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia y después se lavaron con PBS. Las células se lisaron con tampón de lisis de oro como se describe anteriormente [26]. El material insoluble se recogió por centrifugación a 14.000 ×
g
durante 20 min a 4 ° C. La concentración de proteína cuantificada usando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Hercules, CA). Las muestras se dividen en 50 alícuotas y se almacenaron a -80 ° C para su posterior estudio.
La transfección de ARN pequeño de interferencia
células A431-III (2,5 × 10
5) se sembraron en placas de cultivo de 60 mm y se dejaron adherir durante la noche. Se añadieron 6 l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) a 300 l de medio libre de suero, mezcló a fondo y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. En paralelo, se añadieron 12 l de siRNA madre (10 mM) para separar 300 l de medio libre de suero, mezclado a fondo. El siRNA diluido y Lipofectamine 2000 se combinaron y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió el complejo de ARNsi /Lipofectamine al plato 60 mm que contiene 2,4 ml de suero libre de medio de dar una concentración final de 40 nM. Después de 24 h el medio que contiene el complejo de transfección se cambió y medio fresco que contenía 10% se añadió FBS; las células se incubaron entonces durante otras 24 h. Todos los ensayos se llevaron a cabo 48 horas después de la transfección.
Cuantitativo PCR en tiempo real
El ARN total se aisló mediante el uso de alta Pure RNA Kit de aislamiento (Roche, Basilea, Suiza), y la transcripción inversa mediante el uso de la MMLV de alto rendimiento de la transcriptasa inversa kit (Epicentre, Madison, WI). La cuantificación de los niveles de transcripción de genes diana se llevó a cabo en el sistema LightCycler (Roche) utilizando un comercial SYBR Premezcla Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japón) y conjuntos de cebadores específicos.
Expresión génica análisis de microarrays
El procedimiento de análisis de microarrays de expresión génica fue proporcionado por el fabricante Welgene Biotech (Taipei, Taiwán). En resumen, tanto las células A431-A431 III-P y (1 × 10
6) se sembraron en placas de 100 mm y se dejaron crecer en medio completo. Después de 24 h, el RNA totales de ambas células se extrae por 3 ml de reactivo Trizol. El análisis de microarrays de expresión génica de células A431-A431 III-P y se realizaron por Welgene Biotech. Los datos mencionados en esta publicación se han depositado en Gene Expression Omnibus de NCBI y son accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE47996 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE47996) .
gelatina Zymography
se recogió el medio acondicionado y se separó por 8% de SDS-PAGE que contiene 0,1% de gelatina. Después de la electroforesis, el gel se lavó en 2,5% de Triton X-100 durante 20 minutos, dos veces, para renaturalizar las gelatinasas y después se incubaron en tampón de reacción (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, que contiene 5 mM CaCl
2, 0,02 NaN%
3) a 37 ° C durante 24 a 48 h. A continuación, el gel se tiñó con azul de Coomassie y se destiñó con tampón de decoloración tal como se describe anteriormente [33]. La actividad de la gelatinasa fue visible como zonas claras en el gel.
Western Blotting
Las muestras de lisados de células se mezclaron con tampón de muestra de 5 × y se hirvieron durante 5 min, se separó en 10% de SDS-poliacrilamida geles (PAGE), y después se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Millipore). Las manchas de transferencia de membrana se bloquearon en PBS que contenía 5% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente, y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Después de lavar con TBST que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,8% (w /v) de NaCl y 0,25% de Tween-20, las transferencias se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Millipore). Las membranas se lavaron con TBST, y se detectaron bandas de inmunorreaccionar con reactivos ECL y se expusieron en FUJIFILM.
In Vitro Ensayo de Invasión
El filtro de un pocillos 24 unidad Transwell se recubrió con 0,1 ml de 0,6 mg /mL EHS Matrigel. El compartimento inferior contenía RPMI-1640 con 10% de FCS como un quimioatrayente. Las células se colocaron en el compartimento superior (10
5 células /0,5 ml de RPMI-1640 que contiene 0,1% de BSA) durante 24 h. Después de la incubación, los filtros se fijaron con glutaraldehído al 3% en PBS y se tiñeron con cristal violeta. Las células en la superficie superior del filtro se rasparon suavemente, y los que penetró a través de la Matrigel a la superficie inferior del filtro se contaron bajo un microscopio (20 x).
inmunofluorescencia
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos que contienen cubreobjetos recubiertos de gelatina 18 mm durante 18-24 h con el fin de adherirse. El medio se desechó y las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 15 min, se lava con PBS, y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 durante 10 minutos. Después de lavar con PBS, los cubreobjetos se bloquearon con 1% de BSA en PBS durante 30 min. Las células fueron incubadas con anticuerpos anti-cortactin o anti-Tks5, que se diluyeron en tampón de bloqueo durante 1 h 1% de BSA. Esto fue seguido por la incubación con el anticuerpo secundario apropiado conjugado con Alexa Fluro 555 (Invitrogen) durante 1,5 h. Las mismas células también se tiñeron con Alexa Fluro faloidina 488-conjugado y DAPI para detectar los núcleos de F-actina y la célula, respectivamente. Los cubreobjetos se montaron en glicerol al 50% en PBS y se analizaron por microscopía de imagen confocol.
Matrix Degradación Ensayo
Se realizó el ensayo de degradación de la matriz de acuerdo con un procedimiento descrito anteriormente [34], y todo el procedimiento para el ensayo de degradación de la matriz se realizó en la oscuridad. En resumen, 18 mm cubreobjetos se recubrieron primero con 0,2 mg /ml Oregon Green® gelatina 488 conjugado (Molecular Probe). Los cubreobjetos tenían 200 l de glutaraldehído al 0,5% enfriado en hielo en PBS añaden en ellos y, a continuación las mezclas se incubaron durante 15 min a 4 ° C. Después de lavar con PBS, los cubreobjetos se incubaron con fresco 5 mg /ml NaBH
4 en PBS durante 3 min a temperatura ambiente. A continuación, los cubreobjetos se lavaron con PBS y se esterilizan en 70% de etanol. Después de inactivar con medio libre de suero durante 1 h, 1 × 10
5 células fueron sembradas en cubreobjetos de 5 h, y se desliza fueron procesados para el análisis de inmunofluorescencia usando faloidina para detectar F-actina y DAPI para detectar los núcleos de las células. Las imágenes se visualizaron mediante microscopía confocal. Para cuantificar la formación y la función invadopodios, los invadopodios se cuantificaron de forma manual mediante el recuento del número total de células productoras de invadopodios en al menos cinco campos individuales (& gt; 300 células). El área de la matriz alrededor de las células que habían sido degradados también se midió usando un umbral de señal idéntico para el Oregon Green® fluorescencia 488-gelatina para cada imagen. La zona degradada medido fue el área donde la señal de fluorescencia era inferior al umbral tal como se mide por ImageJ. El área cuantificada se normalizó frente al número de células.
Microscopía Confocal
Fluorescente imágenes fueron capturados utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM510 con una lente de inmersión en aceite de 63 ×, un objetivo NA 1.25 y el pin orificio de la unidad de 0,1 aireado. Análisis de imágenes se realizó utilizando el software ImageJ.
Análisis estadístico
Los datos cuantitativos de al menos tres experimentos independientes se expresan como medias (± SEM). pruebas t de Student no pareada se utilizaron para comparar las diferencias entre grupos. Un
Red de p. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Las células A431-III se forman más invadopodios y degradar el ECM con eficacia
Tenemos anteriormente muestran que las células A431-III exhiben mayores capacidades invasivas y migratorias junto con niveles elevados de MMP-9 [32]. Esto nos proporciona un modelo fiable para estudiar el mecanismo de la metástasis /invasión mediante la comparación de las células A431-III con las células parentales (A431-P). Para determinar si las células A431-P y A431-III son capaces de formar invadopodios, se realizó primero inmunofluorescencia para detectar y comparar la formación de invadopodios por células A431-A431 III-P y. Las células A431 y A431-P-III se sembraron en placas de 6 pocillos recubiertos con gelatina durante 4 h. Invadopodios se pudo observar como Cortactin y puntos de actina-positivas localizadas en el sitio ventral de células. Como se muestra en la figura 1A, invadopodios se encuentran fácilmente en las células A431-III. Hubo pocas o ninguna invadopodios detectable visible en células A431-P. Siguiente, el ensayo de degradación de la matriz se realizó para evaluar la capacidad de degradación de ECM de invadopodios en A431-P y las células III. Se encontró que las células A431-III a tener una mayor capacidad degradantes de gelatina en comparación con las células A431-P (Fig. 1A). Estos datos sugieren que la mayor capacidad degradantes de gelatina encontrado para ser asociado con células A431-III es paralelo a su mayor capacidad para formar invadopodios
A, Panel superior:. Células A431-P y A431-III se tiñeron con cortactin ( rojo), F-actina (verde) y DAPI (azul). Las puntas de flecha, los ejemplos de invadopodios que se identifican como cortactin y actina-positivas puntos. Imágenes representativas tomadas de ambas células. Panel inferior: Tanto las células se sembraron en Oregon Green® gelatina 488-conjugado. ECM degradada fue identificada como una zona oscura en la gelatina. el panel B, superior: La cuantificación de células asociadas con la degradación de la matriz. Panel inferior: La cuantificación de la degradación de la zona normalizado contra el número de células. C, se realizaron ensayos de invasión. *
p Hotel & lt; 0,05. Las barras de error representan el error estándar de la media. La barra de escala son 22 micras. P (A431-P); III (A431-III).
Para cuantificar la formación de invadopodios y su capacidad para degradar el ECM, se calculó el porcentaje de células con puntos lagrimales invadopodios que se asociaron con parches de gelatina degradadas. Como se muestra en la figura 1B, se encontró que más del 35% de las células A431-III para formar invadopodios y para degradar la gelatina. Esto difiere con los resultados de A431-P, en donde se encontraron sólo el 5% de las células A431-P para formar invadopodios. También cuantificado el área de los parches degradados y normalizado esto contra el número de células. células A431-III exhibieron un 10 veces mayor capacidad para degradar la gelatina que hizo células A431-P. Esta mayor capacidad de formación de invadopodios y función degradantes correspondió con la capacidad invasora de estas células (Fig. 1C). En resumen, estos resultados sugieren que, en comparación con las células A431-P, células altamente invasivos A431-III exhiben una capacidad mucho mayor para formar invadopodios y que esto conduce a una mayor degradación de ECM y un aumento de la capacidad invasiva.
la fosforilación cortactin promueve la formación y degradación de la matriz invadopodios
Recientemente, varios informes han aprobado que la sobre-expresión de los reguladores invadopodios o proteínas componentes invadopodios son capaces de mejorar la formación de invadopodios. Para confirmar aún si estos reguladores están reguladas en las células A431-III, hemos realizado los análisis de microarrays y qPCR para dilucidar este evento. Para nuestra sorpresa, no hubo aumento significativo de cualquier regulador invadopodios o proteína componente conocido (amp Fig 2A y;. 2B). Estos datos sugieren que la diferencia entre A431 y A431-P-III, en términos de invadopodios, es probable que sea a nivel de la transducción de señales en vez de a nivel de la expresión de la proteína.
A, la expresión de los reguladores invadopodios, componentes básicos y MMP /TIMP en A431-P y A431-III se analizaron por microarray. B, La expresión de los reguladores invadopodios, componentes y MMP /TIMP fueron validados por qPCR. C, lisados de células totales fueron sometidos a análisis de inmunotransferencia. Se determinó el estado activo de la quinasa Src y la fosforilación de cortactin.
Src quinasa juega un papel fundamental en la regulación de la formación invadopodios [12], [13]. Varias proteínas componentes son conocidos para someterse a la fosforilación de tirosina durante génesis invadopodios, incluyendo cortactin [9], [35]. La fosforilación de cortactin por Src quinasa es un interruptor de llave que permite la remodelación de los filamentos de actina y la activación de la formación de invadopodios y funcionamiento [17], [22]. Para probar el papel de Src en la formación y la función invadopodios, examinamos la actividad de quinasa Src por el anticuerpo anti-Src fosforilada en A431-P y las células III. Como se muestra en la figura 2C, se encontró que Src quinasa se activa de manera significativa en las células A431-III, y seguido por un aumento en la fosforilación de la diana aguas abajo, cortactin. Estos hallazgos sugieren que la actividad de la quinasa Src, en lugar de la inducción transcripcional de Src o de cualquier otro regulador invadopodios /componente, es probable que sea responsable del aumento de la formación de invadopodios por células A431-III, en concordancia con nuestra inferencia respecto de datos de microarrays.
Para confirmar aún más el papel de Src quinasa y la fosforilación cortactin en la formación invadopodios en células A431-III, que después se trataron las células con SU6656, un inhibidor de quinasa Src selectiva. El resultado mostró que la formación de invadopodios fue suprimida de manera espectacular por el tratamiento con SU6656 (Fig. 3A), así como las capacidades invasores detectados por ensayos de invasión (Fig. 3D). Cuantificación del porcentaje de células invadopodios-positivo y la zona de la degradación relativa se muestra en la figura 3B. Estos hallazgos demuestran que una reducción en la fosforilación de Src resulta de la inhibición de la actividad quinasa Src por SU6656, mientras que también acompañado por un nivel más bajo de la fosforilación de cortactin (Fig. 3C). Estos datos sugieren que la actividad de quinasa Src es necesaria para la formación invadopodios y el potencial invasivo.
A, las células A431-III se sembraron en gelatina o Oregon Green® gelatina 488 conjugado y tratados con SU6656 DMSO o 5 M durante 5 h para investigar la formación de invadopodios y degradación de la matriz. B, Cuantificación de células asociadas con degradación de la matriz (panel superior). La cuantificación de la degradación de la zona normalizó en contra del número de células (panel inferior). C, lisados de células totales se prepararon para el análisis de inmunotransferencia. Se analizaron activa Src y aguas abajo de destino cortactin (Y421). D, se realizaron ensayos de invasión. *
p Hotel & lt; 0,05. Los valores de p se comparan con el control de A431-III. Las barras de error representan el error estándar de la media. La barra de escala son 22 micras.
MMP actividad se requiere para invadopodios Formación y degradación de la matriz
Para hacer metástasis, las células tumorales se basan en la formación invadopodios y MMP para llevar a cabo la digestión de la MEC, que facilita la penetración de células a través de la barrera de ECM. La implicación de MMPs en la actividad invadopodios es esencial si la proteólisis fuera a ocurrir. Para determinar la correlación de las MMP y la formación de invadopodios en A431-III, primero mide la capacidad de las células A431-III para formar invadopodios y degradar el ECM en presencia de GM6001, un inhibidor de amplio espectro de MMP. Nuestro estudio utilizó Tks5 como un marcador para detectar la formación invadopodios y funcionamiento. El tratamiento de células A431-III con 25 M GM6001 degradación de la gelatina completamente abolida (Fig. 4A). No hay estructuras en forma de puntos invadepodia detectables en las células A431-III se observó después del tratamiento con GM6001. Este efecto podría ser debido a un fallo de invadopodios para formar una estructura estable cuando la actividad de MMP se inhibe. Cuantificación del porcentaje de células invadopodios-positivas y de las áreas de degradación relativas se presenta en la figura 4B. Los efectos de GM6001 sobre las actividades y TIMPs MMPs se midieron por Western blot y zimografía (Fig. 4C). En conjunto, nuestros resultados muestran la importancia crítica de la actividad de MMP en la capacidad degradante de las células A431-III, y cómo la actividad de MMP influye en la formación de la estructura invadopodios.
A, las células A431-III se sembraron en gelatina o Oregon Green® gelatina 488 conjugado y se trató con DMSO o GM6001 25 M durante 5 h para observar la formación de invadopodios y la capacidad de degradar la matriz. Tks5, la proteína componente invadopodios, se utilizó como un marcador. B, Cuantificación de células asociadas con degradación de la matriz (panel izquierdo). La cuantificación de la degradación del área normalizó contra el número de células (panel derecho). C, Efecto de GM6001 en 'actividades y TIMPs' MMP expresión se midió por zimografía y Western Blot. D, las células se trataron con 40 nM MMP-9 siRNA o controlar siRNA. eficiencia desmontables se mide por qPCR (izquierda) o zimografía de gelatina (a la derecha). E, células A431-III (que expresan de control o MMP-9 knockdown siRNA) se sembraron en gelatina o Oregon Green® gelatina 488 conjugado para investigar la formación de invadopodios y la capacidad de degradar la matriz. . F, La cuantificación de células asociadas con la degradación de la matriz (panel izquierdo) y la zona de la degradación normalizado contra el número de células (panel derecho) *
p Hotel & lt; 0,05. Las barras de error representan el error estándar de la media. La barra de escala son 22 micras.
Tres MMP, MT1-MMP (MMP14), MMP-2 y MMP-9, se ha informado a asociarse con invadopodios funcionando en diversas líneas celulares [13], [36], [37]. Hemos demostrado que la actividad de MMP-9 es la clave MMP que aumenta notablemente en las células A431-III (Fig 2A & amp;. 2B) [32], y que esta proteína juega un papel importante en la migración, invasión y la EMT [33]. Debido al hecho de que MT1-MMP y MMP-2 se someten a poco o ningún cambio en las células A431-III, por lo que es probable que una elevación en el nivel de MMP-9 es el principal factor que contribuye para el aumento de la actividad proteolítica invadopodios. Para confirmar si MMP-9 contribuye a proceso de formación de invadopodios, un bloqueo de la actividad endógena de MMP-9 en células A431-III se llevó a cabo por siRNA desmontables. Desmontables de MMP-9 en células A431-III fueron confirmados por qPCR y análisis de zimografía (Fig. 4D). La pérdida de la MMP-9 dio lugar a una falta de detección de puntos lagrimales invadopodios en células A431-III (Fig. 4E). Desmontables de MMP-9 en células A431-III fue suficiente para impedir la formación de invadopodios en aproximadamente un 60% y causar una reducción del 70% de la superficie total degradado por estas células como se muestra en la figura 4F. En general, desmontables de MMP-9 en células A431-III tuvo un resultado similar a la de la exposición a GM6001. En ambos casos hay era o bien un fallo en la detección invadopodios o una reducción significativa en el número de estructuras de puntos-como invadopodios. En conjunto, estos hallazgos indican que la MMP-9 juega un papel importante en la inducción de la generación invadopodios y la posterior degradación de la MEC.
La luteolina y quercetina inhiben la actividad quinasa Src y afectó a la Aguas abajo de destino Cortactin
En nuestros estudios anteriores, hemos identificado dos de los flavonoides conocidos más potentes, es decir, Lu y Qu. Estos flavonoides presentan una variedad de efectos anti-cáncer, tales como la inhibición del crecimiento celular y la actividad quinasa, la supresión de la expresión de MMPs y la secreción, la disminución de la migración /invasión, y la inversión de EMT [26], [29], [38], [39]. Aunque estos dos flavonoides son potencialmente eficaces como compuestos anti-invasivos, hasta la fecha ningún estudio ha evaluado la influencia de Lu y Qu sobre la formación y el funcionamiento invadopodios. Sobre la base de sus efectos sobre la actividad quinasa y MMPs [26], que postula que Lu y Qu podrían tener la capacidad de alterar la formación y funcionamiento de invadopodios. Se han hecho sugerencias de que Src, una vez activado, es capaz de transducir señales a abajo objetivos que a continuación modulan el crecimiento celular, la supervivencia, la migración y la invasión [40]. Estos resultados nos llevó a investigar si el tratamiento con cualquiera de Lu o Qu tendría un efecto inhibidor directo sobre la actividad tirosina quinasa Src, y el deterioro de la fosforilación Cortactin como consecuencia.
El tratamiento con Lu o Qu fue encontrado para disminuir fosforilación src y la fosforilación de cortactin (Fig. 5A). Además del efecto inhibidor de la Src y la fosforilación cortactin, que también investigó los efectos de estos dos flavonoides sobre la actividad MMP. Como se muestra en la Fig. 5B, Lu o Qu suprimida la secreción de MMP-2 y MMP-9, pero no tuvo efectos significativos sobre MT1-MMP, TIMP1 y TIMP2.
Las células fueron tratadas con 20 mM Lu o Qu en el suero libre medio de 24 h. A, lisados de células totales fueron sometidos a análisis de inmunotransferencia. Se determinó activa Src y aguas abajo de destino Cortactin (Y421). B, se analizaron los medios condicionados y lisado de células de 'actividades' y TIMPs MMP expresión usando zimografía de gelatina y Western Blot. C, Imágenes representativas de A431-III tratado con Lu o Qu. Panel izquierdo: Las células se tiñeron con Cortactin (rojo) y F-actina (verde). Panel derecho: células A431-III se sembraron en Oregon Green® gelatina 488 conjugado para investigar la capacidad de la matriz degradantes. D, la cuantificación de células asociadas con degradación de la matriz (panel izquierdo). La cuantificación de la degradación del área normalizó contra el número de células (panel derecho). E, se realizaron ensayos de invasión. *
p Hotel & lt; 0,05. Los valores de p se comparan con el control de A431-III. Las barras de error representan el error estándar de la media.