Extracto
cultivos tridimensionales (3D) de células tumorales cultivadas en laminina matriz extracelular rico ( lrECM) se consideran para reflejar los tumores humanos más realista en comparación con las células cultivadas como monocapa en plástico. Aquí, hemos investigado sistemáticamente el impacto de ECM en el fenotipo, la expresión génica, la vía de señalización del EGFR, y en la inhibición del EGFR en líneas celulares de cáncer colorrectal utilizado comúnmente (CRC). LrECM on-top (3D) ensayos de cultivo se realizaron con las líneas celulares de CRC SW-480, HT-29, DLD-1, LOVO, CACO-2, COLO-205 y COLO-206F. Morfología de lrECM cultiva CRC líneas celulares se determinó mediante contraste de fase y fluorescencia láser confocal de barrido microscopía. La proliferación de células se examinó por el ensayo de MTT, la capacidad invasiva de las líneas celulares se ensayó usando cámaras de Boyden recubiertos con Matrigel, y se determinó la actividad migratoria empleando el ensayo de la cerca. La expresión génica diferencial se analizó a nivel transcripcional por la gama plataforma de Agilent. EGFR fue inhibida por el uso de la pequeña molécula inhibidor específico AG1478. Un patrón de crecimiento esferoide específica se observó para todas las líneas celulares de CRC investigados. DLD-1, HT-29 y SW-480 y Caco-2 mostraron una formación de células de tumor sólido claro, mientras que LOVO, COLO-COLO-205 y 206F se caracterizaron mediante la formación de estructuras similares a uvas. Aunque la ocurrencia de una morfología esferoidal no se correlacionó con un migratoria alterada, invasiva, o la capacidad proliferativa de las líneas celulares de CRC, la expresión génica estaba claramente alterada en las células cultivadas en lrECM en comparación con cultivos 2D. Curiosamente, en líneas celulares de tipo salvaje KRAS, la inhibición de EGFR fue menos eficaz en lrECM culturas (3D) en comparación con cultivos de células 2D. Por lo tanto, la comparación de ambos modelos de cultivo celular en 2D y 3D, nuestros datos apoyan la influencia de la ECM en el crecimiento del cáncer. En comparación con el cultivo de células 2D convencional, el (3D) modelo de cultivo celular lrECM ofrece la oportunidad de investigar líneas permanentes de células de CRC en condiciones más fisiológicas, es decir, en el contexto de dianas terapéuticas moleculares y su inhibición farmacológica
Visto.: Luca AC, Mersch S, Deenen R, S Schmidt, Messner I, Schäfer KL, et al. (2013) Impacto del microambiente 3D en el fenotipo, la expresión génica, y EGFR La inhibición de líneas celulares de cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (3): e59689. doi: 10.1371 /journal.pone.0059689
Editor: Nils Cordes, Universidad de Tecnología de Dresden, Alemania |
Recibido: 29 Agosto, 2012; Aceptado: February 17, 2013; Publicado: 26 Marzo 2013
Copyright: © 2013 Luca et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Forschungskommission de la Facultad de Medicina, Universidad de Düsseldorf (41/09 a 24/10 AK y de KLS), el Rudolf Bartling-Stiftung (II /98 a NHS) y por subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB . 728) y la escuela de graduados NRW "BioStruct" (ambas de RPP) los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. la autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
líneas celulares de cáncer permanentes pueden proporcionar un suministro casi ilimitado de células con genotipos y fenotipos [1], bastante similares, y son esencialmente la única opción para estudios sobre el mecanismo de las células cancerosas humanas en condiciones controladas [2], [3]. En consecuencia, las líneas celulares de cáncer humano han sido ampliamente utilizados como
in vitro y modelos de cáncer humano. Un ejemplo para un área de éxito y así se indique de aplicación ha sido el descubrimiento, desarrollo y ensayo de fármacos contra el cáncer [3]. Sin embargo, dependiendo de la pregunta científica también hay limitaciones evidentes en el estudio de los cambios en las células de cáncer que están asociados con la progresión del cáncer ya que la mayoría líneas celulares de cáncer permanentes se han establecido a partir de cánceres avanzados con genotipos progresados [1]. Sin embargo, uno de los problemas más importantes que limitan el valor de las líneas celulares de cáncer como un modelo para el cáncer humano es debido al método más común a las líneas celulares de cultivo
in vitro
, es decir, como monocapa homotípica en sustratos de plástico (2D ). Mientras que los cánceres primarios y metástasis son estructuras tridimensionales complejos heterotípicos incrustados en microambientes específicos de órganos distintos, es bien sabido que las células que se cultivan como cultivos 2D clásicos pierden muchas de las características de sus
in vivo
homólogos [ ,,,0],4]. Además, importantes funciones celulares tales como la proliferación y la diferenciación pueden ser alterados artificialmente [5].
Una característica común de todas las células epiteliales normales y malignas es que son fisiológicamente en estrecho contacto con la matriz extracelular (ECM) . El ECM, compuesta de proteínas y glicosaminoglicanos fibrosos, rodea a las células epiteliales en su espacio extracelular y forma su membrana basal. El ECM no sólo proporciona la fuerza física a las células epiteliales organizados [6], [7], pero también importantes estructuras y señales bioquímicas clave para la polaridad y el crecimiento [7], [8]. Un sistema simple para
in vitro
modelado ECM es una preparación solubilizada de membrana basal extraída del Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma de ratón, un tumor rico en proteínas de matriz extracelular que comprende la laminina, colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparina y entactina /nidogen [9] - [18]. Debido a su composición molecular, especialmente su alto contenido de laminina, que se considera que es un sustituto adecuado para la membrana basal. Si las células epiteliales se cultivan dentro de esta matriz extracelular rica en laminina (lrECM), que crecen como estructuras tridimensionales [15], [16], [19]. Los trabajos pioneros por el grupo Bissell y otros - hace principalmente en las células de mama primarios y líneas celulares de cáncer de mama - demostrado diferencias morfológicas y bioquímicas dramáticas, entre las células normales y malignas cultivadas 2D sobre sustratos de plástico y 3D en lrECM, respectivamente [6], [20 ], [21]. Desde un punto de vista clínico es importante tener en cuenta que lrECM cultura (3D) - como un modelo más cerca de la
in vivo
situación - puede llevar a diferentes respuestas a las terapias moleculares, como se muestra recientemente para células de cáncer de mama líneas [22], [23], [24]. Sorprendentemente, lrECM (3D) de los cultivos se sigue raramente analizan sistemáticamente utilizados en experimentos con líneas celulares de cáncer y sólo unos pocos estudios de los efectos de las culturas lrECM en líneas celulares permanentes que proporcionan información básica sobre estos modelos. Hasta ahora, este tipo de análisis sistemáticos de las culturas lrECM se centró principalmente en la caracterización fenotípica de líneas celulares de cáncer de mama crecido bajo el lrECM 3D
vs.
Condiciones 2D.
A continuación, hemos ampliado la comprensión funcional de los efectos del diferencial lrECM (3D)
vs.
condiciones de crecimiento 2D a las células de cáncer de colon. Hemos investigado sistemáticamente el impacto de lrECM en el fenotipo celular y patrones de expresión génica en líneas celulares de uso común de cáncer colorrectal (CCR). Nuestros datos indican que las líneas celulares de CRC exhiben tipos morfológicos esferoide distintas cuando se cultivan en lrECM. Aunque la morfología esferoidal de líneas CRC no se correlacionó con un migratoria alterada, la capacidad de células invasoras o proliferativa, líneas de células cultivadas bajo condiciones lrECM (3D) exhibieron un
per se
proliferación alterada en comparación con los cultivos control 2D. Por otra parte, la expresión de genes se altera claramente en las líneas celulares de CRC cuando se cultiva en condiciones lrECM /3D. Además, la eficacia de la inhibición del EGFR farmacológica se veía afectada en las células cultivadas en CRC lrECM en comparación con cultivos 2D. Por lo tanto, el microambiente 3D tiene un impacto importante en el fenotipo celular y la sensibilidad farmacológica de líneas celulares de CRC.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
LOVO se obtuvo a partir la Colección Europea de cultivos celulares (ECACC, Salisbury, Reino Unido), COLO-205 de la American Type Culture Collection (ATCC, LGC Standards GmbH, Wesel, Alemania), Caco-2, COLO-206F, DLD-1, HT-29 y SW-480 desde el Centro alemán de recursos para el material biológico (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Todas las líneas celulares se mantuvieron en condiciones de cultivo de tejidos estándar en RPMI 1640+ GlutaMAX ™ -I (Gibco /Invitrogen, Darmstadt, Alemania) que contiene 10% de suero de ternera fetal (Gibco /Invitrogen,). Las células se cultivan o bien en el plástico de cultivo de tejidos (2D) (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) culturas o 3D dentro de factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular laminina-rico (lrECM 3D) sobre la parte superior de la siembra de células en la parte superior de una delgada capa de gel de extracto de Engelbreth-Holm-Swarm tumoral (BioCoat Matrigel membrana basal, factor de crecimiento reducido, BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Las células se sembraron en el ensayo de Matrigel en-tapa a una densidad de 1,8 × 10
4 células /pocillo en placas de 24 pocillos. Esferas se cultivaron durante 7 días antes de la recuperación de Matrigel. Para los estudios de morfología, las esferas se cultivaron hasta 10 días. El medio se cambió cada dos días en cultivos 3D. 3D-esferas se recuperaron de la membrana basal Matrigel eliminando el medio del cultivo de células Matrigel y la incubación en 400 l /pocillo dispasa (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania), precalentado a 37 ° C, durante 2 horas a 37 ° C y 5% de CO
2. La activación de la dispasa se detuvo con EDTA 10 mM en 1 x PBS. Esferas se centrifugaron y se lavaron con 1 x PBS. células cultivadas 2D también se lavaron con PBS y se rasparon de la placa de cultivo. Para el aislamiento de proteínas 3D esferas fueron recuperados de Matrigel por incubación con EDTA 5 mM en PBS durante 30 min en hielo seguido de tres etapas de lavado con PBS.
KRAS y BRAF análisis de mutación
ciclo de la secuencia estándar se realizó para (re) evaluar la
KRAS
y
BRAF
estado de mutación de las líneas celulares de carcinoma de colon (Tabla 1). Los exones 2, 3 y 4 de
KRAS
fueron analizados usando los siguientes cebadores de oligonucleótidos: 5'-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 'y 5'-AAAGAATGGTCCTGCACCAG-3' para el exón 2, 5'-GGATTCCTACAGGAAGCAAGT-3 'y 5 '-GGCAAATACACAAAGAAAGC-3' para el exón 3 y 5 'AGACACAAAACAGGCTCAGGA-3' y 5'-AAGAAGCAATGCCCTCTCAA-3 'para el exón 4. para
BRAF
la amplificación del exón 15 se realizó usando el cebador 5' - TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 'y el cebador inverso 5'AGCCTCAATTCTTACCATCCA-3'. Considerando que se utilizaron cebadores inversos para el análisis de secuencia de ADN de
KRAS
Exon 2 y 4, cebadores directos se utilizaron para
KRAS
Exon 3 y BRAF Exon 15, respectivamente [25].
análisis STR
para el ADN STR análisis de huellas dactilares se aisló utilizando el Qiagen sangre y Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con instrucciones de los fabricantes. Genomic DNA (1 ng) se amplificó usando los sistemas de PCR genRES® MPX-2 y genRES® MPX-3 multiplex (Serac GmbH, Bad Homburg, Alemania) para generar 9 y 12 secuencias marcadoras STR diferentes. Los productos de PCR se analizaron en un secuenciador capilar ABI 310 y allelotyped por el software "V3.1 genotyper" (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.) [26].
viabilidad celular, proliferación y apoptosis ensayos
la viabilidad celular se midió usando el ensayo MTT. Las células se sembraron a una densidad de 2 × 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos. Mientras que las células se sembraron directamente en placas de plástico de tejidos para los cultivos 2D, 3D culturas se prepararon en placas las células en una capa fina de Matrigel. Después de un período de incubación de 48 h a 37 ° C y 5% de CO
2, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemania) se añadió a los medios de comunicación durante 4 h antes de la fijación durante la noche con MTT solución de parada que contiene 10% de SDS, 5% de 1-butanol y M HCl 0,01. La reducción de MTT a formazán se midió a 540 nm usando un lector Tecan amanecer remoto (Tecan Group Ltd., Maennedorf, Austria).
proliferación de las células cultivadas en condiciones de cultivo 2D o 3D se cuantificó por 5-Bromo 2-desoxiuracilo (BrdU) incorporación mediante el etiquetado 5-Bromo-20-desoxi-uridina y kit de detección I (Roche) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Después de un periodo de incubación de 48 horas a 37 ° C y 5% de CO
2 Se eliminó el medio y las células se incubaron durante 1 hora más a 37 ° C y 5% de CO
2 con material de etiquetado BrdU. 3D esferas fueron recuperados de Matrigel por incubación con EDTA 5 mM en PBS durante 30 min. Las células se lavaron dos veces en 1 x PBS y se centrifugaron durante 5 min a 400 rpm. esferoides recuperados se recubrieron en portaobjetos de vidrio y se secaron durante la noche a temperatura ambiente. Los núcleos se counterstained con 40,6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Hasta 200 células se contaron en cinco campos diferentes por preparación usando un microscopio Axio Alcance de fluorescencia (Zeiss, Jena, Alemania). El número de células en proliferación se calculó como un porcentaje del número total de células DAPI-positivas por campo (tres campos seleccionados al azar por cubreobjetos). El porcentaje de células apoptóticas se calcula como la relación entre el número de células DAPI-positivas con núcleos fragmentados, conocidos como una característica morfológica de apoptosis, y todas las células DAPI-positivo.
Valla de ensayo (migración Assay)
Para los ensayos de migración 7,5 × 10
3 células se sembraron en una valla de 16 mm (Aix Scientifics®, Aquisgrán Alemania). Las células se cultivaron en medio RPMI suplementado con 10% FBS hasta que se alcanzó la confluencia y se eliminó la valla. Las células se cultivaron durante cuatro días, posteriormente fijado en 10% de formaldehído y se tiñeron con solución de tinción haemalaun de Mayer. Los diámetros de las monocapas de células teñidas fueron evaluadas en mm utilizando el Sistema Versa Doc Imaging (BioRad, Munich, Alemania). Para distinguir entre la proliferación celular y la migración celular, pre-experimentos se realizaron en medio de cultivo suplementado con 1% de FBS o 10% de FBS.
Invasion Ensayo
ensayo de invasión se realizó utilizando BD BioCoat Matrigel ™ ™ Cámara Invasion (BD Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las membranas se fijaron en portaobjetos de vidrio y se tiñeron con cristal violeta. se contaron las células dentro de un área central definida de la membrana.
Tratamiento de Drogas y Ensayo de proliferación de
receptor EGF fue inhibida por el inhibidor de tirosina quinasa tirfostina AG1478 (Sigma Aldrich). Las células se sembraron a una densidad de 6 x 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con AG1478 a una concentración final de 20 mM, 10 mM, 5 mM, 2,5 M, 1 M o 0,1 M durante 48 h y 96 h en los sistemas de cultivo de células 2D y 3D. DMSO /metanol en concentraciones equimolares a las concentraciones AG1478 sirvió como control de vehículo. Cuarenta y ocho horas después de la proliferación de las células de tratamiento de drogas se midió mediante la realización de ensayos de MTT como se describe anteriormente.
Total Extracción de ARN y síntesis de ADNc
El ARN total fue aislado utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen) de acuerdo con instrucciones del fabricante. ARN se diluyó en 50-80 l de agua libre de nucleasa y estéril. La concentración de ARN se midió spectrophometrically a 260 nm y la calidad del ARN se evaluó mediante el Agilent 2100 Bioanalyzer. Para la síntesis de ADNc, transcripción inversa (RT) se realizó en un volumen final de 20 l usando 01:10 oligo diluido (dT) primer (Invitrogen), 2 ARN g, y 4 U Transcriptor transcriptasa inversa en 5 x tampón de RT (Roche , Mannheim, Alemania).
PCR en tiempo real
Los cebadores y sondas fueron diseñados utilizando acuerdo universal ProbeLibrary Ensayo Design Center (ProbeFinder versión 2.45, Roche Applied Science). Los cebadores se sintetizaron por MWG-Biotech, Ebersberg, Alemania (Tabla S1). cDNA se diluyó a una concentración final de 1 ng /l. Para la PCR, plantilla 2 l de cDNA (o agua como control negativo) se mezclaron con 12,5 l Fast Start Taq hombre sonda Master Mix (Roche), 0,25 l de cada adelante y atrás cebador (20 mM cada uno) y 0,25 sonda l (Universal ProbeLibrary Set humano, Roche). Todas las muestras se realizaron por triplicado. Para normalizar la expresión de los genes diana, se utilizó deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) como el gen de referencia interna. Se realizó cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) en la DyadDisciple Chromo 4 (BioRad) utilizando las siguientes condiciones: 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos comprendiendo cada uno de desnaturalización de 15 segundos a 95 ° C, hibridación y extensión de 1 min a 60 ° C. La expresión génica se cuantificó mediante el uso de la 2
método -ΔΔCT [27].
Immunoblotting
Las células se homogeneizaron en tampón de lisis de proteína Pb1 (NaCl 100 mM, Tris 10 mM, 1 mM EDTA, 1% P40 Nonident (Sigma) suplementado con un comprimido de cóctel comprimidos fosfatasa inhibidor y PhosSTOP fosfatasa cóctel inhibidor (tanto Roche). Las proteínas solubles se separaron por centrifugación durante 10 min a 4 ° C y 12.000 rpm. Las muestras que contienen 40 mg de clarificados lisados de proteína por carril se separaron por electroforesis en geles de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa membranas se probaron con el conejo monoclonal anti-EGF anticuerpo del receptor. (Clone C74B9; Cell Signaling, Denver, MA, EE.UU.). durante la noche a 4 ° C para detección de AKT1 conejo monoclonal anti-fosfo AKT1 anticuerpo (Ser473) (clon 193H12; Señalización celular) y el conejo anticuerpo monoclonal anti-AKT1 (Clon C73H10; Cell Signaling). se han usado p44 MAPK /42 se detectó a través de conejo monoclonal anti-fosfo p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) anticuerpo (clon 20G11; Señalización Celular) y anti-p44 /42 MAPK anticuerpo monoclonal de conejo (Clone 137F5; Cell Signaling). La detección de MEK1 /2 se realizó utilizando policlonal de conejo anti-fosfo MEK1 /2 (Ser217 /221) anticuerpo (Señalización Celular) y conejo monoclonal anti-MEK1 /2 de anticuerpos (clon 47E6; Cell Signaling). Para los no-fosfo (activo) β-catenina (Ser33 /37 /Thr41) que utiliza D13A1 anticuerpo monoclonal de conejo clon (Señalización Celular) y para el total de β-catenina D10A8 clon de anticuerpo monoclonal de conejo (Señalización Celular). Beta-actina se detectó a través del ratón monoclonal anti-β-actina de anticuerpos (clon AC-15, Sigma). El anticuerpo secundario anti-conejo (Cell Signaling) o anticuerpo anti-ratón (Sigma) unido a peroxidasa de rábano picante se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente y se detectaron utilizando el Kit de Inmune-Star ™ Western C ™ (BioRad) usando Versa sistema de imágenes Doc (BioRad).
confocal Microscopía de inmunofluorescencia
esferoides recuperados fueron recubiertas sobre portaobjetos de vidrio, se secaron durante la noche a temperatura ambiente y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. Los portaobjetos se rehidrataron en 1 × PBS y se fijaron con metanol /acetona enfriada en hielo (1:01) durante 20 min a -20 ° C seguido por dos etapas de lavado en 1 x PBS para cada uno de 5 min. El bloqueo se llevó a cabo en tampón de inmunofluorescencia que contiene 4% de albúmina de suero bovino y 0,05% de saponina en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. La tinción se realizó en PBS que contenía 1% de BSA y 0,05% de saponina durante la noche a 4 ° C. Ratón monoclonal anti-EpCAM anticuerpo BerEp4 (Dako, Hamburgo, Alemania) se utilizó a una concentración de 2 mg /ml. MOPC (Sigma) sirvió como control de isotipo y se incubó a una concentración de 2 mg /ml. A continuación, las muestras se lavaron tres veces con 1 x PBS. El anticuerpo secundario, Alexa Fluor® 488 de cabra anti-IgG de ratón (Invitrogen), se incubó durante 1 h a temperatura ambiente a una concentración de 10 mg /ml, seguido por dos etapas de lavado para cada uno de 5 min. Las células se contratiñeron con 0,1 mg /ml DAPI (Sigma) en 1 x PBS durante 4 min, se lavaron dos veces con PBS, y montado con solución Vectashield® (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal LSM510-Meta (Zeiss, Jena, Alemania) equipado con un 40 × /1.3 objetivo de inmersión y de excitación longitudes de onda de 364 nm y 488 nm. Confocal imágenes se muestran en las diapositivas ópticos individuales de 0,5 m de espesor.
Clasificación de los esferoides
En un trabajo anterior por el grupo Bissell [2] se demostró que las líneas celulares de cáncer de mama permanentes que se cultivaron en el ensayo normalizado lrECM on-top, desarrollado por este grupo, esferoides formados, que exhibe características de crecimiento-patrones según lo revelado por microscopía de contraste de fase o microscopía confocal de barrido láser. La morfología esferoidal se clasificó en cuatro grupos distintos discernibles como se describe por Kenny
et al
[2]:. "Ronda", "masa", "en forma de uva 'y' estrellado '. El tipo "redondo" forma colonias en la parte superior de los geles se caracterizan por los núcleos que se organizan regularmente alrededor del centro de la colonia. Las líneas celulares de tipo 'masa' forman colonias que también pueden tener colonia redonda se describen en la microscopía de contraste de fase, pero que tienen centros llenos y los núcleos desorganizados. Los esferoides '' uva que muestran los contactos célula-célula sueltos con una morfología típica en forma de uva. esferoides 'estrelladas' se caracterizan por un fenotipo invasivo con proyecciones estrelladas que invaden el gel [2]. Se utilizó este sistema para clasificar los esferoides de líneas celulares de CRC
Gene análisis de expresión:. Los análisis de matriz Agilent
preparaciones de ARN total fueron analizadas para la integridad del ARN mediante Agilent 2100 Bioanalyzer. Todas las muestras de este estudio mostraron alta calidad común Números de RNA Integrity (RINs) de 10. ARN se cuantificó mediante la medición fotométrica Nanodrop. Síntesis de ADNc y posterior marcaje fluorescente de cRNA se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (análisis de expresión génica basada en microarrays de un color, Low Input rápido AMP etiquetado, Vers 6.5;. Agilent Technologies). Brevemente, 100 ng de ARN total se convirtió en ADNc, seguido por
in vitro
la transcripción y la incorporación de nucleótidos marcados en Cy3 cRNA recién sintetizado. Después de la fragmentación, ARNc marcado se hibrida con Agilent Humanos 8 × 60 K de alta densidad de oligonucleótidos microarrays. Los análisis de datos se realizaron con el software GeneSpring GX (Vers 10,5;. Agilent Technologies). Distribuciones de intensidad de señal a través de muestras se normalizaron cuantil normalización. pre-procesamiento de datos de entrada se concluyó mediante la transformación de línea de base a la mediana de todas las muestras. Después de agrupamiento de muestras de acuerdo con condiciones de cultivo (lrECM 3D
vs. Francia culture 2D, 24
vs.
25 muestras, respectivamente) una transcripción dado tuvo que ser expresado en al menos 75% de las muestras en cualquiera de las dos o ambos grupos para ser analizados más. la expresión de genes detectables por encima del fondo se caracteriza por lo tanto por las banderas "presente" de acuerdo a los ajustes estándar para GeneSpring chips de Agilent. La expresión génica diferencial se determinó estadísticamente por Mann-Whitney U-test. Resultando
P
-valores fueron corregidos para múltiples pruebas de acuerdo con Benjamini-Hochberg. Las transcripciones que muestran una corregirse
P
corr-valor inferior a 0,05 se considerará que se expresa de forma diferente. Los análisis de conglomerados jerárquicos no se llevaron a cabo ya sea en muestras o en las transcripciones, respectivamente, usando métricas de distancia de Manhattan y vinculación completa.
Estadísticas
Todos los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado a menos que se indique lo contrario. Los datos representan la media ± SD a menos que se especifique lo contrario. La correlación entre la morfología esferoidal y la fuente de línea celular (tumor primario
vs.
Metástasis) se determinó utilizando la prueba exacta de Fisher (5 prisma, Graph Software cojín, Inc. La Jolla, CA, EE.UU.). Las diferencias en la viabilidad celular medida por la absorbancia del tinte a 540 nm, la proliferación celular, la apoptosis y en la expresión génica se mide por RT-PCR se analizaron utilizando una prueba t pareada o la-Whitney-U-test Mann de dos colas no paramétrico. Un
P
-valor inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. IC
50 valores se calcularon con Prism 5 (software de hoja de gráficos, Inc.).
Resultados
CRC líneas celulares exhiben dos tipos morfológicos Esferoide distintas cuando se cultivan en lrECM
en primer lugar, hemos probado si las líneas celulares de CRC que crecen en lrECM muestran una morfología específica que puede ser clasificado de acuerdo con las cuatro categorías descritas por Kenny
et al
[2]. Usando el ensayo en-tapa todas las líneas celulares de CRC investigados formaron esferoides tumorales dentro de dos días. Dentro de los tres más días los esferoides desarrollaron una morfología específica, que era replicable en al menos diez experimentos independientes. Mientras esferoides fueron creciendo lentamente en tamaño, esta morfología era estable hasta 10 días de cultivo. experimentos de observación más largos no se hicieron. Entre estas líneas celulares, tres diferentes patrones de crecimiento se observaron por microscopía de contraste de fase (Figura 1): "redondo", "masa" y "en forma de uva". En particular, Caco-2 se clasificó como "redondo", HT-29, DLD-1 y SW-480 como "masa" y LOVO, COLO-206F y COLO-205 como "uva como".
morfología A) Crecimiento de líneas celulares cultivadas en 2D CRC (panel superior) y lrECM 3D condiciones de ensayo sobre-tapa (panel inferior). Las células cultivadas en condiciones 3D ya sea mostrar una ronda (CACO-2), la masa (DLD-1, HT-29, SW-480) o una morfología en forma de uva (COLO 205, COLO-206F, LOVO) en las imágenes de contraste de fase. Barras de escala: 100 m. B) Imágenes de microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser de esferoides CRC. Los esferoides se cultivaron en microambientes lrECM 3D durante siete días. Después de aislamiento, la proteína EpCAM membranosa (verde) se tiñó utilizando Alexa Fluor® 488 de cabra anti-IgG de ratón. Los núcleos se counterstained con DAPI (azul). Las barras de escala 10 micras.
Para aumentar la resolución espacial y el aspecto morfológico de los diferentes esferoides 3D, se realizó la microscopía confocal de las células por la localización de la molécula de adhesión celular epitelial EpCAM y tinción nucleico con DAPI (figura 1B). En consecuencia, CACO-2 esferoides muestran claramente núcleos desorganizadas y una estructura compacta global con centros de colonias apareciendo densamente llenas, siendo, por tanto, re-clasificado como "masa". En todas las demás líneas celulares de imagen confocal validado su clasificación inicial por microscopía de contraste de fase. Curiosamente, se observó que las líneas celulares con diferentes morfologías muy 2D (es decir COLO-205 y LOVO) exhibieron morfologías similares en lrECM y
viceversa.
Morfología del esferoide no se correlaciona con migratorias, Invasiva o la capacidad proliferativa de líneas celulares de CRC
Después definimos las dos morfologías esferoide divergentes de líneas celulares de CRC lrECM cultivadas, es decir, "en masa" o "similares a uvas", estábamos interesados si esta observación se relaciona con diferentes propiedades celulares en términos de un potencial maligno alterada. En este contexto hay que destacar que todas las líneas celulares de CRC investigados con morfología "en forma de uva" derivado de las células metastásicas, mientras que todas las líneas celulares de CRC con morfología esferoidal "masa" se establecieron a partir de tejido tumoral primario (Fishers exacta test, p = 0,028) (Tabla 1).
En primer lugar, la viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTT. No se observaron diferencias significativas en la viabilidad celular entre las células del fenotipo "masa" en comparación con las células del fenotipo "en forma de uva" se hicieron evidentes. Curiosamente, cuando la comparación de viabilidad, la proliferación y la apoptosis de las células de crecimiento en dos dimensiones sobre plástico de cultivo de tejidos (2D) con el ensayo en-tapa lrECM 3D, se encontró una disminución significativa en la viabilidad y la proliferación celular en condiciones lrECM 3D (Figura 2A y B ). En contraste, no hay diferencia se hizo evidente cuando la cuantificación de células apoptóticas en los sistemas de cultivo lrECM 3D (Figura 2 C) y 2D.
Las células se cultivan en condiciones 2D o 3D. A) La viabilidad celular se midió 48 horas más tarde usando el ensayo MTT. Los valores representan la media de la absorbancia a 540 nm ± DE de triplicados. Las barras blancas representan las células cultivadas sobre plástico (2D); Las células cultivadas en negro bares lrECM (3D). Dos colas
P
-valores se calcularon mediante la prueba de Mann-Whitney-U (** indica un
P-valor
& lt; 0,001; ns = no significativo). B) La proliferación celular se cuantificó mediante el cálculo del porcentaje de células con incorporación de BrdU y el número total de células DAPI-positivas por campo (por lo menos tres campos seleccionados al azar por cubreobjetos). Los datos presentados son la media ± SD de tres repeticiones. Las barras blancas representan las células cultivadas sobre plástico (2D); Las células cultivadas en negro bares lrECM (3D). Dos colas
P
-valores se calcularon mediante la prueba t pareada (* indica un
P-valor
& lt; 0,05; ns = no significativo). C) El porcentaje de células apoptóticas se calculó como la proporción de células DAPI-positivas con núcleos fragmentados y todas las células DAPI-positivo. Los datos presentados son la media ± SD de tres barras representan replicates.White células cultivadas sobre plástico (2D); Las células cultivadas en negro bares lrECM (3D). Dos colas
P
-valores se calcularon mediante la prueba t pareada (ns = no significativo). D) La migración de las líneas celulares de CRC se cuantificó usando el ensayo de la cerca. Los datos representan medias ± SD de tres experimentos independientes. Las barras blancas representan las líneas celulares clasificadas como tipo de masa; barras negras de la clase en forma de uva.
De acuerdo con los tipos morfológicos observados en cultivos lrECM 3D, hemos explorado la capacidad migratoria e invasiva de las líneas celulares de CRC. El uso de un ensayo de la cerca para explorar la migración y una cámara de Boyden ensayo recubierta con Matrigel para cuantificar la invasión, estos experimentos no revelaron diferencias obvias en términos de la capacidad migratoria o invasivo cuando se compara la "masa" y las líneas celulares de CRC "como uvas" (Figura 2D y en la Tabla 2). Por lo tanto, una correlación entre la capacidad de invasión y el tipo morfológico no se hizo evidente.
Expresión génica alterada en lrECM 3D "on-top" Cultivado CRC células
La observación de que las líneas celulares de CRC no sólo formar esferoides típicos en lrECM 3D sino que también muestran una disminución de la proliferación en lrECM, sugiere una diferencia general de los niveles de expresión génica entre las culturas en 2D y 3D lrECM. Para identificar los genes expresados diferencialmente al comparar las células cultivadas en 2D y 3D lrECM, se investigó el transcriptoma de células que crecen en condiciones 2D y 3D lrECM utilizando el Agilent Humanos 8 × 60 K de alta densidad plataforma de microarrays de oligonucleótidos. Por lo tanto, se llevaron a cabo cuatro experimentos independientes en los que SW-480, HT-29, DLD-1, las células Lovo Caco-2, COLO-COLO-205 y 206F se cultivaron en condiciones 2D o 3D lrECM, respectivamente. En total, se analizaron 49 muestras a partir de 7 líneas celulares diferentes, 25 obtenidos a partir de 2D y 24 a partir de cultivos lrECM 3D. En primer lugar, se realizó un análisis de agrupamiento jerárquico de las células cultivadas en condiciones 2D o 3D lrECM. Como se muestra en la Figura 3A, cada línea celular mostró un perfil de transcriptoma característica, independiente del método de cultivo de células. Sin embargo, a excepción de HT-29 y LOVO, dentro de cada grupo de líneas celulares, el 2D frente a las condiciones de cultivo lrECM 3D se separaron claramente, indicando los genes regulados de manera diferente entre las culturas en 2D y 3D lrECM. El análisis posterior reveló que 225 genes se expresaron en niveles significativamente diferentes cuando se comparan células mantenidas en cultivos lrECM 3D (Figura 3B) y 2D. Pathway análisis usando software GX GeneSpring 10,5 identificado 14 genes regulados diferencialmente que se sabe que interactúan entre sí.