Extracto
Antecedentes
terapia de privación de andrógenos (ADT) es el tratamiento de primera línea para el cáncer de próstata metastásico (PCA). Sin embargo, sostenida expresión y función del gen del receptor de andrógenos (AR) contribuir a la progresión de los cánceres de próstata resistentes a la castración (CRPC). Además, los tumores pueden adaptar el /AKT vía de supervivencia PI3K escapar ADT. AR co-orientación y señalización /AKT PI3K se ha propuesto ser un medio terapéutico más eficaces para los pacientes CRPC. Muchos ensayos clínicos están en curso para poner a prueba si los inhibidores de PI3K /AKT son beneficiosos para los pacientes con CaP. Sin embargo si estos inhibidores tienen ningún impacto sobre las expresiones de AR de larga duración (AR-FL) y su variante de empalme (AR-V7) sigue sin estar claro.
Métodos
Cuatro líneas celulares de cáncer de próstata humano (LNCaP, LNCaP95, VCAP y 22Rv1) con diferentes antecedentes genéticos fueron tratados con inhibidores de cinco PI3K /AKT (LY294002, wortmanina, BKM120, Akti y AZD5363) y AKT o siRNA. los niveles de proteína y ARNm de AR y AR-V7 se midieron mediante ensayos de PCR de inmunotransferencia y en tiempo real. AR inicio de la transcripción de genes, empalme de ARN alternativo y las tasas de degradación de ARNm de AR se determinó también.
Resultados
PI3K /AKT inhibidores tuvieron varias repercusiones sobre las expresiones de proteínas AR principalmente a través de alteraciones de iniciación de la transcripción del gen AR y empalme de ARN. Sin embargo, estos efectos se mantuvieron sin cambios en el silenciamiento de ARN presencia de los genes AKT.
Conclusión
PI3K /AKT inhibidores tienen fuera de objetivo efectos sobre la expresión génica AR en células de cáncer de próstata, que será considerados cuando se apliquen estos inhibidores para pacientes con CaP, en particular los pacientes bajo tratamiento ADT
Visto:. Liu L, X Dong (2014) Impactos complejos de PI3K inhibidores /AKT a receptor de andrógenos de la Expresión génica en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (10): e108780. doi: 10.1371 /journal.pone.0108780
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Julio, 2014; Aceptado: 3 de septiembre de 2014; Publicado: 31 Octubre, 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu, Dong. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo ha recibido una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (RP-137007) y un premio Rising Star de cáncer de próstata Canadá (RS2013- 58) para Xuesen Dong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
terapia de privación de andrógenos (ADT) es el tratamiento estándar para el cáncer de próstata metastásico (PCA). Sin embargo, la progresión a cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) se produce a mayoría de los pacientes [1]. tumores CRPC sostienen la expresión de AR y sus genes regulados, lo que indica que la señalización AR sigue funcionando [2] - [5]. Se han propuesto varios mecanismos para la AR re-activación aberrante posterior ADT incluyendo: i) la amplificación del gen AR y las mutaciones de ganancia de función [4], [6] - [9]; ii) alteraciones en la expresión y la función de AR co-reguladores clave [10] - [12]; y iii) importante, la generación de la unión del ligando de dominio truncado variantes de empalme AR (AR-V) [13] - [16] que activan constitutivamente la señalización AR. Entre estas variantes, AR-V7 (también llamado AR3) es el AR-V más abundantemente expresado en el CaP [13], [14], [17]. los niveles de proteína AR-V7 son significativamente elevados en los tumores CRPC y estrechamente asociados con una menor supervivencia de los pacientes [13], [14], [18]. Estos resultados enfatizan que el bloqueo de la expresión del gen AR y la función sigue siendo una terapia importante.
Además, el fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt /mamíferos objetivo de la señalización de la rapamicina (mTOR) se activa con frecuencia en el CaP y ha sido demostrado que desempeñan un papel importante para la progresión CRPC y la resistencia a la muerte celular inducida por el tratamiento [19], [20]. Las alteraciones genéticas de componentes de la vía PI3K /AKT /mTOR ocurrieron en 42% de los tumores de próstata primarios y 100% de los tumores metastásicos [19]. Más importante, la activación de retroalimentación recíproca de las vías /Akt AR y PI3K se había demostrado, que permite a las células cancerosas para adaptarse ya sea vía para la supervivencia cuando el otro es farmacológicamente inhibido [21], [22]. Estos resultados proporcionan un fundamento que co-dirigida tanto a las vías pueden lograr mejores resultados para los pacientes CRPC.
Hay varios inhibidores dirigidos a diferentes componentes clave de la vía PI3K /AKT incluyendo PI3K, AKT y mTOR. Sin embargo, los inhibidores de PI3K como LY294002 también se han demostrado para unirse e inhibir otras quinasas que no pertenecen a la señalización de PI3K /AKT [23], [24]. Además, los estudios han demostrado que cuando la actividad de mTOR es inhibida por algunos inhibidores de AKT, que puede desencadenar un mecanismo de retroalimentación que resulta en re-activación de AKT o proteínas activadas por mitógenos [25], [26]. En conjunto, estos hallazgos indican que más allá de la supresión de los efectores AKT, fuera de objetivo efectos de los inhibidores de AKT podría producir un impacto profundo a las células cancerosas. La pregunta que queda por responder es si los inhibidores de PI3K /AKT pueden alterar las expresiones de longitud completa AR (AR-FL) y AR-V7 en células de CaP, lo que podría contrarrestar la eficacia de ADT.
En este estudio, cuatro líneas celulares de PC fueron tratados con inhibidores /AKT cinco PI3K. Medimos tanto ARNm del RA y los niveles de proteína y la iniciación de la transcripción del gen AR determinado, corte y empalme de ARN y las tasas de degradación de ARNm de AR. Hemos informado existía impactos complejos de inhibidores de PI3K /AKT a AR expresión de genes que son independientes a la caída de AKT. Estas fuera de objetivo efectos sobre la expresión génica AR deben tenerse en cuenta al aplicar inhibidores /AKT PI3K a los pacientes con CaP.
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer de próstata, inhibidores de PI3K /Akt y transfección de siRNA
LNCaP, VCAP y 22Rv1 líneas celulares de cáncer de próstata humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). células LNCaP fueron entre 42-50 pasajes. LNCaP95 línea celular fue proporcionado por el Dr. Plymate (Universidad de Washington) y se informó en estudios anteriores [14], [27], [28]. Se deriva de células LNCaP y se ha obtenido la resistencia a las condiciones de agotamiento de andrógenos. Tanto LNCaP y LNCaP95 expresan AR mutante (T877A) que puede activar AR por una amplia gama de esteroides o análogos de esteroides. También expresan mutantes de la fosfatasa y tensina gen homólogo (PTEN) que activa constitutivamente AKT. VCAP células expresan AR de tipo salvaje y PTEN. Pero poseen la amplificación del gen AR resulta en niveles más altos de AR-FL y expresiones AR-V7. 22Rv1 células expresar de tipo salvaje PTEN, pero tienen reordenamiento del gen del gen AR resultante altos niveles de expresión AR-V7. En conjunto, estas cuatro líneas de células de CaP representan una amplia gama de alteraciones genéticas de células de CaP. LY294002 y wortmanina se compraron a Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). NVP-BKM120 y AZD5363 eran de Selleck Químicos (Houston, TX). Akti (CAT#124005) era de Merck Millipore (Billerica, MA). Control y AKT siRNAs (CAT #: J-003000, 003001-J y J-003002 de AKT 1-3 isoformas respectivamente) eran de Dharmacon (Ottawa, Ontario). SiRNAs se transfectaron en células de CaP utilizando siLentFect Lipid reactivo de Bio-Rad (Mississauga, ON) según el protocolo del fabricante.
ensayos de inmunotransferencia
Proteína lisados se recogieron con tampón de lisis (50 mM Tris pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% de NP40, 0,5% desoxicolato de sodio y 0,1% de SDS) complementado con inhibidores de proteasa y de fosfatasa de Roche (Laval, QC) a medida que se describe [29]. La concentración de proteína de cada muestra se determinó usando el kit BCA de Pierce (Rockford, IL) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de proteína se separaron mediante geles de SDS-PAGE, transferidos a membranas de difluoruro de polivinilo (PVDF) y se transfirieron con los anticuerpos indicados. Los experimentos se repitieron al menos tres veces y se muestran un conjunto de las transferencias representativas. Anticuerpos información aparece en la Tabla S1.
se realizaron PCR en tiempo real
ensayos de PCR en tiempo real como lo hemos descrito [30], [31]. El ARN total se extrajo utilizando Purelink RNA mini kit de Invitrogen (Burlington, ON) según las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se llevó a cabo por triplicado usando Applied Biosystems7900HT con 5 ng de ADNc, 1 mM de cada par de cebadores y mezcla maestra SYBR Green PCR de Roche (Laval, QC). Todos los ensayos de PCR en tiempo real se llevaron a cabo utilizando tres repeticiones técnica y tres síntesis de ADNc independientes. Primer información aparece en la Tabla S1.
Nuclear carrera de ensayo
Nuclear de la marcha en los ensayos se realizaron como se describe [32], con modificaciones menores. células LNCaP y LNCaP95 fueron tratados durante 18 horas con vehículo, LY294002, AZD5363 o siRNA contra isoformas AKT1-3. Totalmente 6 × 10
6 células se lavaron con PBS frío, cosechadas y lisadas en hielo en Nonidet P-40 tampón de 0,5% de lisis [Tris 10 mM · HCl (pH 7,4), NaCl 10 mM, 3 mM MgCl2] y se centrifugó a 500 xg durante 10 min. Los sobrenadantes se eliminaron y los núcleos se incubaron en tampón de reacción [Tris 10 mM · HCl (pH 8,0), MgCl2 5 mM, KCl 0,3 mM] que contiene NTP 2,5 mM más mezcla biotina-16-UTP de Roche (Laval, QC) durante 45 min a 30 ° C. Biotinilados transcritos de ARN nacientes se precipitaron mediante estreptavidina perlas de oro Biotecnología (St. Louis, MO) y se lavaron con tampón salino citrato de sodio más 15% de formaldehído. Precipitado de ARN se eluyó de perlas de estreptavidina y se utilizó como plantillas para análisis en tiempo real PCR con los cebadores de amplificación de ARNm total de rRNA 18S o AR (18RS) como se describe en la Tabla S1. Los resultados se representan como media ± SEM de tres repeticiones independientes de cada condición experimental.
ensayo de empalme de ARN del gen AR
El ARN total fue extraído por medio de Purelink ARN mini kit de Invitrogen (Burlington, ON ). PCR en tiempo real se llevó a cabo para medir gen AR empalme de ARN. La relativa eficiencia de empalme AR-FL y AR-V7 se determinó mediante la normalización con un producto de PCR interno dentro de los exones 2 y 3. AR Primer información se enumeran en la Tabla S1. Todos los ensayos de PCR en tiempo real se llevaron a cabo utilizando tres repeticiones técnica y tres síntesis de ADNc independientes.
Estadísticas
Los resultados se expresan como la media ± SEM. Para determinar las diferencias entre los grupos experimentales, ANOVA de un factor seguido por el estudiante de
t
-test se llevó a cabo utilizando GraphPad Prism (versión 4) con el nivel de significación de P & lt; 0,05 como *, P & lt; 0,01 como ** y P & lt;. 0,001 *** como
Resultados
Impactos de inhibidores /AKT PI3K a AR niveles de proteína en células de CaP
LY294002 es un fuerte inhibidor competitivo a PI3K y evita PI3K de fosforilación y la activación de efectores aguas abajo de AKT [33]. La wortmanina es un inhibidor covalente de PI3K que suprime de manera irreversible la fosforilación de Akt [34]. LY294002 reprime los niveles de proteína AR-FL en células LNCaP (Fig. 1A), inhibió tanto AR-FL y los niveles de proteína AR-V7 en células LNCaP95 (Fig. 1B). Tanto las células LNCaP y LNCaP95 son células deficientes en PTEN, en el que Akt es constitutivamente activa en su forma fosforilación (p-AKT). Tanto LY294002 y wortmanina inhibió fuertemente los niveles de P-Akt en ambas líneas celulares. análisis de densitometría en las expresiones de proteína de AR-FL, AR-V7 y p-AKT se midieron (Fig. 1C). Curiosamente, tanto LY294002 y wortmanina suprimidos AR-FL y expresiones AR-V7 de proteínas en células VCAP (Fig. 2A). Sin embargo, LY294002 aumentó AR-FL, pero disminuyó los niveles de proteína AR-V7 en 22Rv1 células (Fig. 2B). Wortmanina inhibe tanto AR-FL y expresiones de proteínas AR-V7 en las células VCAP y 22Rv1. Densitometría análisis sobre las expresiones de proteína de AR-FL y AR-V7 fueron analizados (Fig. 2C). Dado que las células VCAP y 22Rv1 son PTEN suficientes células, en donde p-AKT se encuentra en niveles muy bajos /indetectables a menos que se activan sus receptores de tirosina quinasa aguas arriba, los efectos de LY294002 a AR expresión de la proteína en las células VCAP y 22Rv1 no era probable relacionados con la activación de AKT . BKM120 es un inhibidor de pan-PI3K, pero no a mTOR [35]. BKM120 suprime eficazmente los niveles de P-Akt tanto en células LNCaP y LNCaP95. Sin embargo, no tuvo efectos BKM120 a AR-FL y los niveles de proteína AR-V7 en las cuatro líneas celulares de CaP (Fig. 1-2). Akti es un análogo de éter fosfatidilinositol competitiva que se acopla en la homología pleckstrin (PH) de dominio de AKT, evita la translocación de AKT a PI3K en la membrana plasmática de este modo inhibe la fosforilación de AKT y la activación [36]. Akti no mostró efectos supresores a AR-FL o los niveles de proteína AR-V7 (Fig. 1-2). AZD5363 es un inhibidor de la ATP-competitiva de AKT [37], [38]. Aumentó tanto AR-FL y los niveles de proteína AR-V7 y niveles inducidos p-AKT en las células LNCaP y LNCaP95 (Fig. 1). Sin embargo, disminuyó AR-FL y AR-V7 niveles de proteína en PTEN suficiente VCAP y 22Rv1 células (Fig. 2).
células (A) LNCaP y (B) LNCaP95 fueron tratados con dosis crecientes de PI3K /inhibidores de AKT LY294002 (0, 25, 50 uM), wortmanina (0, 0,5 y 1 uM), BKM120 (0, 0,5 y 1 uM), Akti (0, 5 y 10 uM) o AZD5363 (0, 2,5 y 5 uM ) durante 18 horas. Proteína lisados se sometieron a inmunotransferencia con AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fósforo-AKT (Ser473) y anticuerpos beta-actina. (C) Los resultados se repitieron al menos tres experimentos independientes. análisis de densitometría de las bandas de proteínas se midieron por el software Image J y se representa como media + SEM. ANOVA de un factor seguido por test t de Student se realizó con * como P & lt; 0,05, ** como P & lt; 0,01 y *** como P. & Lt; 0,001
(A) VCAP y (B ) 22Rv1 células fueron tratadas con dosis crecientes de inhibidores de PI3K /Akt LY294002 (0, 25, 50 uM), wortmanina (0, 0,5 y 1 uM), BKM120 (0, 0,5 y 1 uM), Akti (0, 5 y 10 uM) o AZD5363 (0, 2,5 y 5 uM) durante 18 horas. Proteína lisados se sometieron a inmunotransferencia con AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fósforo-AKT (Ser473) y anticuerpos beta-actina. (C) Los resultados se repitieron al menos tres experimentos independientes. análisis de densitometría de las bandas de proteínas se midieron por el software Image J y se representa como media + SEM. ANOVA de un factor seguido por test t de Student se realizó con * como P & lt; 0,05, ** como P & lt; 0,01 y *** como P. & Lt; 0,001
Impactos de inhibidores /AKT PI3K de AR niveles de mRNA en células de CaP
niveles de ARNm de AR se midieron también en líneas celulares de CaP bajo tratamientos de inhibidores /AKT PI3K. Los cambios de AR-FL y los niveles de AR-V7 de ARNm (Fig. 3) fueron consistentes a lo que se observó en los niveles de proteína de AR, como se muestra en la Figura 1 y 2. LY294002 y wortmanina disminuyó tanto a nivel AR-FL y AV-7 mRNA en todas las líneas celulares de CaP, excepto que LY294002 aumento de los niveles de ARNm de AR-FL en 22Rv1 células. BKM120 y Aktí no tuvieron un impacto significativo en los niveles de ARNm de AR. AZD5363 aumentó los niveles de AR-FL y AR-V7 de mRNA en células LNCaP y LNCaP95, pero disminuyó sus niveles de mRNA en células VCAP y 22Rv1 con significación estadística. Estos resultados sugieren que los inhibidores de PI3K /Akt afectados la expresión génica AR principalmente a nivel de mRNA.
células LNCaP, LNCaP95, VCAP y 22Rv1 fueron tratados con dosis crecientes de inhibidores /Akt PI3K LY294002 (0, 25, 50 uM) , wortmanina (0, 0,5 y 1 uM), BKM120 (0, 0,5 y 1 uM), Akti (0, 5 y 10 uM) o AZD5363 (0, 2,5 y 5 uM) durante 18 horas. AR-FL (A) y AR-V7 (B) los niveles de expresión de mRNA en relación con 18RS se determinaron mediante PCR en tiempo real. Los resultados fueron de tres extracciones de ARN independientes con los ensayos de PCR en tiempo real por triplicado en cada muestra de ARN. Los datos se representan como la media ± SEM. ANOVA de un factor seguido por test t de Student se realizó con * como P & lt; 0,05, ** como P & lt; 0,01 y *** como P. & Lt; 0,001
Los impactos de caída AKT a AR gen
expresión
Para investigar más a fondo si los impactos de LY294002 y AZD5363 en AR proteína y los niveles de mRNA fueron mediadas por AKT, hemos realizado ensayos de AKT desmontables utilizando agrupado siRNA contra las tres isoformas AKT1-3. Eficiencia de AKT siRNA se demostró por Western Blot (Fig. 4A-B). Hemos observado que, independientemente de la presencia de caída AKT, LY294002 todavía puede disminuir drásticamente los niveles de AR-FL y la proteína AR-V7 (Fig. 4A) y el ARNm (Fig. 4C) en las células LNCaP, LNCaP95 y VCAP. LY294002 aumentó la expresión de AR-FL, pero disminuyó la expresión AR-V7 en 22Rv1 células. Además, se observó que AZD5363 aumentó significativamente expresiones AR-FL en células LNCaP y LNCaP95 y la disminución de AR-FL y AR-V7 en células VCAP y 22Rv1, que efectos permanecieron sin cambios, incluso en presencia de eficiente desmontables AKT (Fig. 4B y 4D). En conjunto, estos resultados indican que los efectos de LY294002 y AZD5363 a AR expresiones eran independientes de AKT y sus efectores.
células LNCaP, LNCaP95, VCAP y 22Rv1 fueron transfectadas con siRNA control o agruparon para AKT 1-3 isoformas durante 36 horas. Las células fueron entonces tratados adicionalmente con 50 uM LY294002 (A) o 5 uM AZD5363 (B) durante otras 18 horas. Proteína lisados se sometieron a inmunotransferencia con AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, p-AKT (Ser473) y anticuerpos beta-actina. Los resultados se repitieron en más de tres experimentos independientes. análisis de densitometría de las bandas de proteínas se midieron por el software Image J y se representa como media + SEM. los niveles de (C) AR-FL y de expresión de ARNm (D) AR-V7 relativos a 18RS se determinaron mediante PCR en tiempo real. Los resultados fueron de tres extracciones de ARN independientes con los ensayos de PCR en tiempo real por triplicado en cada muestra de ARN y se representaron como media + SEM. Se realizaron pruebas t de Student comparando entre el vehículo y tratamientos LY294002 /AZD5363 con * como P & lt; 0,05; ** Como P & lt; 0,01 y *** como P. & Lt; 0,001
LY294002 y AZD5363 afectan AR inicio de la transcripción de genes, empalme de ARN y AR ARNm de estabilidad
Los impactos de LY294002 y AZD5363 en los niveles de ARNm de AR podría ser en múltiples niveles posibles, incluyendo iniciación de la transcripción del gen AR, empalme pre-mRNA y la degradación del ARNm de AR. Usando nuclear de ejecución de ensayo, que mide tanto las tasas de inicio de la transcripción de genes AR y 18RS en presencia de vehículo o inhibidores de PI3K /Akt (Fig. 5A). El gen 18RS se utilizó como un control interno como sus niveles de ARNm no se vieron afectados por los inhibidores /Akt PI3K. Hemos demostrado que inhibe LY294002, mientras que AZD5363 mejorada AR tasas de inicio de la transcripción de genes en relación con 18RS tanto en las células LNCaP y LNCaP95. Por otra parte, derribando AKT no alteró AR genes tasas de transcripción.
células (A) y LNCaP LNCaP95 fueron tratados con vehículo, 50 uM LY294002 o 5 uM AZD5363 durante 18 horas (a la izquierda). células LNCaP y LNCaP95 también fueron transfectadas con el control o AKT1-3 siRNAs durante 48 horas (derecha). Se llevaron a cabo ensayos de marcha en inercia nucleares como se describe en la sección de Material y Método. (B) células LNCaP y LNCaP95 fueron transfectadas con control o agruparon siRNA para AKT 1-3 isoformas durante 36 horas. Celulares se trata adicionalmente con 50 uM LY294002 o 5 uM AZD5363 durante otras 18 horas. Los ensayos de corte y empalme de ARN de AR-FL y AR-V7 se midieron como se describe en la sección de Material y Método. células LNCaP y LNCaP95 (C) se trataron previamente con 2 uM actinomicina D durante 2 horas. Las células se trataron entonces con vehículo, 50 uM LY294002 o 5 uM AZD5363 para 0, 2, 4, 6, 8, y 16 horas. los niveles de AR-FL y de expresión de mRNA de AR-V7 relativos a 18RS se determinaron mediante PCR en tiempo real. células LNCaP y LNCaP95 (D) se transfectaron con el control o agruparon siRNA para AKT 1-3 isoformas durante 36 horas. Las células se pre-trata con 2 uM actinomicina D durante 2 horas y después se trató con vehículo, 50 uM LY294002 o 5 uM AZD5363 durante 6 horas. los niveles de AR-FL y de expresión de mRNA de AR-V7 relativos a 18RS se determinaron mediante PCR en tiempo real. Los resultados fueron de tres extracciones de ARN independientes con los ensayos de PCR en tiempo real por triplicado en cada muestra de ARN. ANOVA de un factor seguido de test t de Student se realizó con * como P & lt; 0,05, ** como P & lt; 0,01 y *** como P. & Lt; 0,001
Para medir la
bona fide
efectos de LY294002 y AZD5363 en AR-FL y AR-V7 empalme de ARN, pero excluir a sus impactos en la iniciación de la transcripción del gen AR, hemos diseñado tres conjuntos de cebadores para medir las tasas de empalme relativas para AR-FL y AR-V7 . Desde AR-V7 empalme de ARN es un mutuamente excluyentes proceso de empalme de ARN de 3b exón y el exón 4 de la AR pre-ARNm, un conjunto de cebadores cubre el exón 3 y 4 de unión del gen AR para la medición de los niveles de AR-FL de ARNm, una conjunto de cebadores cubre el exón 3 y 3b para los niveles de ARNm de AR-V7 y el otro conjunto de cebadores están dentro de los exones 2 y 3 para el total de los niveles de ARNm de AR. Hemos demostrado que la AR-FL empalme de ARN no fue afectada por LY294002, AZD5363 o desmontables AKT. Sin embargo, LY294002 inhibió de manera espectacular, mientras que AZD5363 aumentó AR-V7 empalme en las células LNCaP95 (Fig. 5B). Los cambios de AR-V7 empalme inducidos por LY294002 o AZD5363 no se alteraron en presencia de caída AKT.
AR-FL y estabilidades de ARNm de AR-V7 también se estudiaron en células LNCaP y LNCaP95 pre-tratados con actinomicina D (Fig. 5C). LY294002 mejorada AR-FL y la degradación AR-V7 mRNA en células LNCaP95 dentro de 16 horas. AZD5363 mejorado AR-FL y la degradación o AR-V7 ARNm tanto en las células LNCaP y LNCaP95. Sin embargo, los impactos de LY294002 y AZD5363 en estabilidades de ARNm de AR no se vieron afectados por la caída de AKT (Fig. 5D). Dado que el total de los niveles de mRNA de AR-FL y AR-V7 en las células LNCaP y LNCaP95 se incrementaron en AZD5363 (Fig. 3), estos resultados indican que los impactos de AZD5363 en la iniciación de la transcripción del gen AR y empalme de ARN con sobrepeso sus efectos a AR ARNm degradación.
LY294002 y AZD5363 afectan la actividad transcripcional AR-V7
AR-FL y para investigar más a fondo si las alteraciones de AR-FL y los niveles de proteína AR-V7 por LY294002 y AZD5363 impactarían AR transcripcional actividades, se midió la expresión de dos genes AR-FL regulados (PSA y OPRK1) y un gen regulado por AR-V7 (UGT2B17). En ambas células LNCaP y VCAP, AR-FL agonista R1881 estimuló la expresión de PSA, que acciones fueron suprimidos por LY294002 (Fig. 6A-B). Por el contrario, AZD5363 fortaleció el efecto R1881 en la regulación positiva de la expresión de PSA en células LNCaP, pero redujo la acción R1881 en células VCAP. Estos cambios fueron consistentes con los impactos de LY294002 y AZD5363 en los niveles de proteína AR-FL en estas células. La expresión de gen OPRK1 fue suprimida por ligando activado AR-FL [39]. El tratamiento de LY294002 disminuye AR-FL inhibición mediada a OPRK1 expresión tanto en las células LNCaP (supresión de 69% de reducción de 35%) y las células VCAP (94% de supresión reducido a 42%). AZD5363 fortaleció AR-FL en la supresión de la expresión OPRK1 en las células LNCaP (supresión de 69% aumentó a 79%), pero reduce AR-FL mediada por la inhibición de la expresión en las células OPRK1 VCAP (94% de supresión reducido a 86%). Sin embargo, tanto los impactos de LY294002 y AZD5363 en PSA y OPRK1 expresiones no fueron alterados significativamente por la caída de AKT. Para estudiar la actividad transcripcional AR-V7, se midió la expresión de UGT2B17 en células VCAP y LNCaP95 que fueron tratados con MDV3100 para bloquear la actividad AR-FL. Tanto las células VCAP y LNCaP95 expresan tanto AR-FL y AR-V7. Hemos demostrado anteriormente que en presencia de bloqueo funcional AR-FL, la regulación al alza de la expresión de UGT2B17 se determinó por AR-V7 [27]. LY294002 inhibió la expresión UGT2B17 tanto en células VCAP LNCaP95 y (Fig. 6C-D). AZD5363 estimulado expresión UGT2B17 en las células LNCaP, pero redujo su expresión en células VCAP. Estos cambios en la expresión génica UGT2B17 fueron consistentes con los niveles de proteína AR-V7 bajo tratamientos LY294002 y AZD5363. Sin embargo, estos impactos no fueron alterados por caída AKT.
Células VCAP
(A) LNCaP y (B) se transfectaron con el control o AKT1-3 siRNAs durante 48 horas y se trataron con vehículo o 1 nM R1881. Las células fueron también co-tratados con vehículo, 50 uM LY294002 o 5 uM AZD5363 durante 18 horas. Los ensayos de PCR en tiempo real y los niveles de PSA medido OPRK1 ARNm. células VCAP (C) LNCaP95 y (D) se transfectaron con el control o AKT1-3 siRNAs durante 48 horas y se trataron con vehículo, 50 uM LY294002 o 5 uM AZD5363 en presencia de 5 uM MDV3100 durante 18 horas. Los ensayos de PCR en tiempo real midieron los niveles de ARNm UGT2B17. Los resultados fueron de tres extracciones de ARN independientes con los ensayos de PCR en tiempo real por triplicado en cada muestra de ARN. Se realizaron pruebas t de Student comparando entre el vehículo y tratamientos LY294002 /AZD5363 con * como P & lt; 0,05; ** Como P & lt; 0,01 y *** como P. & Lt; 0,001
Discusión
activación aberrante de la vía PI3K /AKT través de cualquiera de los mecanismos genéticos o epigenéticos se produce con frecuencia en los tumores, renderizado esta vía una atractiva diana terapéutica para una amplia gama de tipos de cáncer. Muchos inhibidores están disponibles para bloquear la señalización de PI3K /AKT y algunos están bajo los primeros ensayos clínicos. Sin embargo, la heterogeneidad de los cánceres de próstata es una característica especial, que hace que sea difícil de prever si la inhibición de la señalización de PI3K /AKT beneficiaría a los pacientes con CaP. Además, muchas secuelas biológica posible de inhibición /AKT PI3K puede debilitar aún más el potencial de ganancia terapéutica. Este estudio tiene como objetivo investigar si los inhibidores de PI3K /AKT tienen efectos fuera de la meta a la expresión del gen AR en un panel de líneas celulares de CaP que representan las células de tumor de próstata con una amplia gama de variaciones genéticas. Es importante documentar el perfil de expresión de AR-FL y empalme variantes AR bajo tratamientos de inhibidores de PI3K /Akt, ya que la expresión AR sostenida y función son uno de los mecanismos moleculares críticos por los que los tumores de próstata progresan en CRPC. Nos informaron de que los inhibidores de PI3K /AKT tenían impactos complejos sobre la expresión génica AR que eran independientes de AKT, lo que sugiere que estos inhibidores de PI3K /AKT señalización podrían afectar más allá de la vía PI3K /Akt en células de CaP pendientes sobre sus antecedentes genéticos. Estos efectos fuera de objetivo advirtieron aplicación potencial de los inhibidores de PI3K /Akt a cierto, si no todas, las poblaciones de pacientes con CaP.
fuera de objetivo efectos de los inhibidores /Akt PI3K habían sido bien documentados y repetidamente observada en este estudio. LY294002 y wortmanina se demostró que se unen muchas otras quinasas que no estaban relacionados con PI3K /AKT señalización [23], [24]. Por lo tanto, no es sorprendente que LY294002 y wortmanina habían mostrado efectos negativos dominantes sobre la expresión del gen AR incluso bajo condiciones AKT desmontables. Aunque tanto BKM120 y Aktí suprimidos de manera espectacular la fosforilación de AKT y la activación, no mostraron ningún impacto a las expresiones de genes AR en las cuatro líneas celulares de CaP. Estos resultados excluyen la posibilidad de que la activación de AKT fue directamente responsable de los cambios de expresión de los genes AR. Ellos sirvieron como controles negativos para apoyar aún más los efectos fuera de la meta de LY294002, wortmanina y AZD5363 en las expresiones de genes AR. Curiosamente, AZD5363 puede alterar AR-FL y expresiones AR-V7 pendientes sobre la base genética de líneas celulares de CaP. Sin embargo, varias evidencias indican de forma ubicua los efectos fuera de la meta de AZD5363 a la expresión del gen AR. En primer lugar, aunque LNCaP y LNCaP95 células mutante expresa constitutivamente PTEN y AKT activo, AZD5363 aumentó tanto AR-FL y expresiones AR-V7 incluso cuando AKT endógeno se agotaron de manera significativa por el silenciamiento de ARN (Fig. 4). Estos resultados indicaron que la activación de retroalimentación de AKT por AZD5363 no contribuyó a los cambios de expresión de AR. En segundo lugar, las células VCAP y 22Rv1 expresan PTEN tipo salvaje con niveles bajos /indetectables de p-AKT en ausencia de activación de los receptores de tirosina quinasa aguas arriba (Fig. 1-2). Los impactos de AZD5363 en la reducción de AR-FL y AR-V7 en líneas VCAP y 22Rv1 por lo tanto no estaban relacionados con la activación de AKT. Pasado, AZD5363 puede mejorar AR iniciación de la transcripción de genes (Fig. 5A), el empalme de ARN de AR-V7 (Fig. 5B), AR-FL y la degradación AR-V7 mRNA independiente para AKT desmontables (Fig. 5C-D).
Tanto AR y la señalización /AKT PI3K habían demostrado ser importante para células de CaP a desarrollar resistencia a la terapia. Desarrollo de inhibidores a estos señalización proporciona nuevas oportunidades para pacientes con CaP. El contrapeso de estas oportunidades es el reto del mismo paciente heterogeneidad celular CaP [40]. Múltiples clones de células de cáncer con diferentes antecedentes genéticos podrían coexistir en el mismo paciente [41]. Por lo tanto un inhibidor de PI3K /AKT podría ser eficaz para una población de células cancerosas, pero posiblemente proporcionar privilegio de crecimiento para otros a través de proceso de selección clonal. Co-dirigido AR y PI3K /AKT vías pueden ser aún más difícil. la activación recíproca de señalización /AKT AR y PI3K en los cánceres de próstata podría complicar la evolución de los pacientes que reciben tratamientos con CaP combinadas de inhibición /AKT AR y PI3K. Los antiandrógenos posiblemente pueden reducir la eficacia de los inhibidores /AKT PI3K. A la inversa, los inhibidores /Akt PI3K pueden contrarrestar la eficacia de anti-andrógenos. Estudios recientes utilizando modelos de ratón knockout PTEN más mostraron que aunque los tumores sensibles a la castración respondieron el AR señalización y PI3K /AKT, los tumores resistentes a la castración derivados se someten a la plasticidad fenotípica lo que aumenta la heterogeneidad intratumoral y la pérdida de la independencia del tumor de señalización PI3K [42]. Nuestros estudios previos habían demostrado que las condiciones de castración inducir la transcripción del gen AR y empalme de ARN de AR-V7 [27]. Hemos demostrado que los inhibidores más aquí como AZD5363 pueden aumentar la iniciación de la transcripción del gen AR y AR-V7 empalme de ARN. Co-tratamiento de anti-andrógenos y AZD5363 podría posiblemente como resultado la expresión AR-V7 mejorada y promover AR-V7 tumores dirigidos en un subgrupo de pacientes con CaP.
En resumen, nuestros estudios demostraron inhibidores de PI3K /Akt tienen diferentes fuera de objetivo efectos sobre la expresión de los genes AR en células de CaP con diferentes antecedentes genéticos. Esta información debe ser considerada en el tratamiento de pacientes con CaP que estos inhibidores.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Información de anticuerpos y cebadores utilizados en este estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0108780.s001 gratis (DOCX)