Extracto
Antecedentes
En Taiwán, el cáncer oral ha sido causalmente asociada con agentes carcinógenos ambientales . Según los informes, la anhidrasa carbónica 9 (CA9) se sobreexpresa en varios tipos de carcinomas y en general se considera un marcador de malignidad. El presente estudio exploró el efecto combinado de
CA9
polimorfismos de genes y la exposición a carcinógenos ambientales sobre la susceptibilidad de desarrollar carcinoma oral de células escamosas (COCE) y las características clínico-patológicas de los tumores.
Metodología y principales conclusiones
Cuatro polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) del
CA9
de genes de 462 pacientes con cáncer oral y 519 controles sin cáncer se analizaron mediante una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR ). Mientras que los SNPs estudiados (
CA9
rs2071676, rs3829078, rs1048638 y 376 Del) no se asociaron con la susceptibilidad al cáncer oral, el haplotipo de GAA 3
CA9
SNPs (rs2071676, rs3829078, y rs1048638) se relacionó con un mayor riesgo de cáncer oral. Por otra parte, los cuatro
CA9
SNP combinado con mascar betel y /o el consumo de tabaco robusta podría elevar la susceptibilidad al cáncer oral. Por último, los pacientes con cáncer oral que tenían al menos un alelo G del
CA9
rs2071676 estaban en mayor riesgo de desarrollar metástasis en nódulos linfáticos (p
=
0,022), en comparación con aquellos pacientes homocigotos para AA.
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que el haplotipo de rs2071676, rs3829078, rs1048638 y combinado tiene importancia potencial predictivo en la carcinogénesis oral. las interacciones entre genes y entorno de
CA9
polimorfismos, fumar y masticar betel quid podrían alterar la susceptibilidad al cáncer oral y la metástasis
Visto:. Chien MH, Yang JS, Chu YH, Lin CH, Wei LH, Yang SF, et al. (2012) Impactos de CA9 polimorfismos genéticos e factores ambientales en la susceptibilidad al cáncer oral-y características clínico en Taiwán. PLoS ONE 7 (12): e51051. doi: 10.1371 /journal.pone.0051051
Editor: Sevtap Savas, Memorial University of Newfoundland, Canada |
Recibido: 27 Agosto, 2012; Aceptado: 29 de octubre de 2012; Publicado: 4 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Chien et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca de la Universidad de Taipei-Wan hospital de colmillo médica (concesión no. 101swf03 al Dr. Chien y el Dr. Yang). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer oral puede originarse en cualquier tejidos de la boca, pero aproximadamente el 90% son carcinomas de células escamosas (SCC). Dichos cánceres son conocidos en todo el mundo por su mal pronóstico y los principales problemas oncológicos [1]. La susceptibilidad de un individuo al cáncer oral está mediada por factores genéticos y comportamientos carcinógeno-exposición [2], [3]. Entre los factores genéticos, los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son el tipo más común de variación de la secuencia de ADN que influyen en la aparición y progresión de las enfermedades relacionadas con los genes. Un SNP es una variación en la secuencia de ADN que se produce cuando un nucleótido (A, T, C, o G) se cambia en al menos 1% de una población determinada. Cuando un SNP cae en una secuencia de codificación, se puede determinar un cambio de un aminoácido en la secuencia de la proteína relacionada. Tal SNP se llama nonsynonymous. De acuerdo con las reglas de la degeneración del código genético, un SNP también puede generar el mismo aminoácido, que a continuación se llama un SNP sinónimos. Es de destacar que varios grupos indicaron que un SNP en una región no codificante (región 3 'no traducida; UTR) de un gen también puede afectar los procesos biológicos [4]
cáncer es una enfermedad gen de defectos, y SNPs. posiblemente, puede predecir el riesgo de cáncer oral [5]. Por lo tanto, las estrategias de SNPs relacionados genotipado y el análisis de sus frecuencias de distribución en una comunidad a menudo se utilizan para predecir el riesgo y el pronóstico de los cánceres. mascar betel quid, el consumo de tabaco y el consumo de alcohol son conductas 3-cancerígeno de exposición comunes. Las combinaciones de estos carcinógenos ambientales y ciertos polimorfismos del gen pueden aumentar la susceptibilidad de una persona para el cáncer oral [5]. Por lo tanto, los SNP en ciertos genes pueden afectar la respuesta de uno a la estimulación hacia la carcinogénesis promovida por factores ambientales.
La hipoxia es una característica común de los tumores sólidos humanos [6]. La hipoxia tumoral hace que las células tumorales a someterse a cambios de adaptación que les permiten sobrevivir y proliferar [7]. tumores hipóxicos se asocian con el crecimiento agresivo del tumor, la metástasis, y el fracaso del tratamiento en varios tipos de tumores sólidos humanos [8]. El desarrollo de un marcador de tumores hipóxicos podría permitir la evaluación de la agresividad biológica de los tumores individuales, lo que podría, a su vez, facilitar tratamientos personalizados
.
La anhidrasa carbónica 9 (CA9), una glicoproteína que pertenece a una familia de zinc que contiene enzimas, no se expresa en la mayoría de los órganos o tejidos, sino que se expresa abundantemente en numerosos tipos de cáncer y se ha investigado como un marcador endógeno para la hipoxia tumoral [9], [10].
CA9
está localizado en el cromosoma 9p12-13, que comprende 11 exones y codifica para la proteína de 459 aminoácidos, CA9. CA9 es una proteína asociada a la membrana que cataliza la reacción reversible H
2O + CO
2↔H
++ HCO
3
-, que es crucial para una amplia variedad de procesos, incluyendo la regulación del pH [11]. A través de esta actividad, CA9 ayuda a mantener un pH normal en las células tumorales en un microambiente hipóxico, lo que puede permitir la proliferación de células tumorales [12]. Estudios anteriores demostraron que la expresión CA9 representa la agresividad del tumor biológico y se asocia con pobres resultados clínicos en varios tumores incluyendo cabeza y el cuello, el cuello uterino, riñón y los cánceres de pulmón [13] - [16]. Más recientemente, la expresión aberrante de CA9 en COCE también fue demostrado que se correlaciona con metástasis ganglionar y un mal pronóstico [17] - [19]. Todos estos descubrimientos sugieren que CA9 juega un papel importante en la progresión del COCE.
Antes de investigación informó que las variaciones polimórficas en la región de exón
CA9
estaban asociados con la supervivencia global para el carcinoma de células renales metastásico [11 ]. Aparte de ese estudio, no hay informes se centraron en la relación entre el
CA9
polimorfismos y el desarrollo de tumores sólidos. El presente estudio investigó las relaciones entre los SNPs (rs2071676, rs3829078, y 376del393) en el exón y regiones 3'-UTR (rs1048638) del
CA9
gen y el riesgo de cáncer oral (Figura 1). Las influencias de estos SNPs combinados con betel-tuerca y el consumo de tabaco, que conducen a una susceptibilidad al cáncer oral, se evaluaron. También se investigó la relación entre las influencias genéticas y las características clínico-patológicas de cáncer oral. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio en demostrar una asociación significativa entre
CA9
polimorfismos y la carcinogénesis oral en Taiwán.
Los números en los diamantes representan la pares
D '
valores. Esta parcela se ha generado por el programa Haploview.
Resultados
El análisis estadístico de las características demográficas se muestran en la Tabla 1. Se encontró significativamente diferentes distribuciones de edad (
p
= 0,023), el sexo (
p Hotel & lt; 0,001), betel quid de mascar (
p Hotel & lt; 0,001), el consumo de alcohol (
p Hotel & lt; 0,001 ), y el consumo de tabaco (
p Hotel & lt; 0,001) entre los participantes del grupo control y los pacientes CCCA. Para disminuir la posible interferencia de los factores ambientales, los AORs con IC del 95% se calcularon mediante múltiples modelos de regresión logística después de controlar por otras variables en cada comparación.
Todos los marcadores de genes analizados en nuestro grupo control fueron estadísticamente verificado que estar en HWE (
p Hotel & gt; 0,05). Los datos de la Tabla 2 muestran que tanto para los pacientes y los controles CCCA, alelos con la frecuencia de distribución más alto fueron los siguientes: heterocigoto A /G para el locus 201 (rs2071676) y homocigotos para A /A, C /C, e Ins /Ins , respectivamente, para el 1081 (rs3829078), 1584 (rs1048638), y 376 (376del393) loci de la
CA9
gen. Después de ajustar por las variables, no hubo diferencia significativa en tener cáncer oral en individuos con la rs2071676, rs3829078, rs1048638, y 376del393 polimorfismos de
CA9
gen en comparación con el de tipo salvaje (WT) individuos.
efecto de la interacción entre los factores de riesgo ambientales y los polimorfismos genéticos de
CA9
se muestran en las Tablas 3 y 4. entre los fumadores, 598 sujetos con al menos 1 G alelo de rs2071676, 1 G alelo de rs3829078 , 1 alelo A de rs1048638, o 1 del alelo de
CA9
376 y el hábito nuez de betel masticar tenían respectivos riesgos de 23.90- (IC del 95%: 8.84-64.61), 14.25- (95% IC: 5,18-39,17), 16.80- (IC del 95%: 5,82 a 48,46) y 12,85 veces (IC del 95%: 6,19 a 26,68) de tener cáncer oral. Los individuos con cualquiera de al menos 1 G alelo de rs2071676, 1 G alelo de rs3829078, 1 alelo A de rs1048638, o uno Del alelo de
CA9
376 o que se mastica la nuez de betel tenía respectivos riesgos de 4.36- (95 % IC: 1,67 a 11,42), 15.18- (IC del 95%: 8,92 a 25,83), 10.65- (IC del 95%: 6,39 a 17,77) y 11,30 veces (IC del 95%: 6,50 a 19,64) de tener cáncer oral compararon a los individuos homocigotos con WT que no mascan nuez de betel (Tabla 3).
Entre 444 consumidores nuez de betel en nuestra cohorte, el consumo de tabaco elevado significativamente el riesgo de cáncer oral en los participantes polimórficos para el rs2071676, rs1048638, y 376del393 polimorfismos de
CA9
, en comparación con las personas con el gen WT que no fumaban cigarrillos (Tabla 4). Por otra parte, las personas que, o bien polimórficos para
Hoteles en CA9 4 loci (201, 1081, 1584, y 376) o que fumaban tenían un riesgo 4.13~22.71 veces (
p
& lt; 0,001) de desarrollar cáncer oral, en comparación con las personas con el gen WT que no fumaba (Tabla 4). Los resultados anteriores sugieren que
CA9
polimorfismos genéticos ejercen una fuerte influencia en la susceptibilidad-cáncer oral que mastica la nuez de betel y /o fumar cigarrillos.
Además, exploramos los haplotipos para evaluar la efectos combinados de los 3 polimorfismos en la susceptibilidad del cáncer oral. Las frecuencias de distribución de la
se analizaron CA9
rs2071676, rs3829078, rs1048638 y haplotipos en nuestros individuos reclutados. El haplotipo más común en el control fue de AAC (46,6%), y por lo tanto se eligió como referencia. En comparación con la referencia, 1
CA9
haplotipo, GAA, significativamente (
p Hotel & lt; 0,001) aumentó los riesgos para la CCCA por 5,27 veces (IC del 95%: 1,13 a 24,55) (Tabla 5).
Para explorar los efectos de los genotipos polimórficos de
CA9
sobre el estado clínico de la CCCA, se clasificaron los pacientes en 2 subgrupos CCCA. En el primer subgrupo, los pacientes tenían alelos homocigotos WT; en el otro subgrupo que tenían al menos 1 alelo polimórfico. Para las frecuencias genotípicas de los SNPs, solamente
CA9
rs2071676 mostró una asociación significativa con las variables patológicas clínicas en pacientes CCCA. En comparación con el genotipo WT (A /A), los pacientes con al menos 1 polimórficos alelo G del rs2071676 mostraron un riesgo más alto (1,69 veces; IC del 95%: 1,00 a 2,84). Para la metástasis de los ganglios linfáticos (Tabla 6)
Discusión
en comparación con el grupo control, una mayor proporción de pacientes con cáncer oral usada betel, tabaco o alcohol (Tabla 1). Este hallazgo sugiere que estos 3 carcinógenos ambientales pueden estar asociados con riesgos para el cáncer oral. Betel quid y el consumo de tabaco parecen estar particularmente fuertemente asociado con el cáncer oral, un hallazgo que es congruente con investigaciones anteriores [20]. Se encontró de mascar betel-quid para estimular el nivel de proteína de la metaloproteinasa de matriz (MMP) -9 en la saliva de las personas sanas [21]. Cal-Piper betel también puede aumentar los niveles de la proteína c-fos y c-jun proto-oncogenes [22]. El consumo de tabaco puede inducir de forma significativa la expresión de -1α factor nuclear inducible por hipoxia (HIF), que es un factor pronóstico desfavorable en el cáncer oral [23]. Estas líneas de evidencia sugieren que la exposición a carcinógenos ambientales está implicada en la formación o la patogénesis del cáncer oral.
expresión CA9 es muy sensible a las condiciones de hipoxia [24]. Se observó que la expresión aberrante de CA9 en las propias células cancerosas o tejidos estromales asociadas a tumores en pacientes CCCA y se correlaciona con un mal pronóstico y la metástasis ganglionar [17], [18], [25]. CA9 cataliza la hidratación reversible del dióxido de carbono a ácido carbónico. Esto conduce a alcalosis intracelular y acidosis extracelular en el microambiente del tumor, que permite a los tumores para sobrevivir en condiciones de hipoxia. Además, acidosis extracelular puede contribuir a la capacidad de invasión y mal pronóstico de tumores que expresan CA9 alta del estroma mediante la activación de las proteasas extracelulares e interrumpir la función celular molécula de adhesión [26] - [28]. CA9 reduce la adhesión celular E-cadherina-mediada por una interacción competitiva con beta-catenina [28]; esto puede mejorar el fenotipo metastásico y contribuir a la asociación entre la expresión CA9 alta del estroma y las metástasis de ganglios linfáticos. Así, la expresión CA9 por tumores puede indicar la presencia de células hipóxicas con un comportamiento más agresivo y la resistencia al tratamiento debido a los cambios celulares inducidos por la hipoxia [29], [30].
aumento de la evidencia indica que los cambios genómicos alteran progresivamente el fenotipo celular y las células podrían conducir a evolucionar a partir de una etapa preneoplásicas en cáncer con mayor facilidad [31]. Se informó de que la mucosa oral de los individuos con el
murino doble minuto 2 (MDM2)
SNP 309 genotipo GG es más susceptible a la exposición carcinógeno ambiental y los resultados en un inicio más temprano de la formación de tumores [32]. El polimorfismo alélico más largo del dinucleótido GT en el
hemoxigenasa (HO) -1
promotor y polimorfismo funcional en el
factor nuclear kappa B1 (NFKB1)
promotor están ambos relacionados con los riesgos de betel quid- o relacionada con el tabaquismo CCCA [5], [33]. Polimorfismos de varios genes fueron identificados como asociados con el riesgo de cáncer oral [34], [35]. Está claro que los componentes genéticos desempeñan papeles fundamentales en la carcinogénesis. En nuestro estudio,
CA9
genes SNPs (rs2071676, rs3829078, rs1048638, y 376del393) por sí solo no contribuir a la susceptibilidad del cáncer oral (Tabla 2). El efecto sinérgico de factor ambiental (betel y el tabaquismo) y
CA9
polimorfismos genéticos en el riesgo de cáncer oral (Tablas 3 y 4) están bien probados. Betel quid y los carcinógenos del tabaco podrían aumentar la expresión de HIF-1α, y luego alterar
CA9
actividad promotora y regular al alza la expresión CA9. En consecuencia, se puede regular al alza las proteasas extracelulares o regular por disminución de E-cadherina para promover el desarrollo de cáncer oral.
Se informó que la alta expresión de CA9 fue más frecuente con la metástasis de los ganglios linfáticos en varios tipos de tumores sólidos, incluyendo cáncer oral [25], [36], [37]. En el presente estudio, una frecuencia significativamente mayor distribución de la metástasis en nódulos linfáticos se exhibió en pacientes con COCE al menos 1 polimórficos alelo G del
CA9
201 en comparación con aquellos con el genotipo WT (Tabla 6). El 201 A /G polimorfismo se sabe que causa una sustitución no sinónima (valina a metionina), pero la expresión y función de CA9 que se ve afectada por este SNP todavía no están confirmados. Aunque un estudio de De Martino et al. mostró que este no sinónimo SNP no tuvo ningún efecto significativo sobre la expresión de la proteína CA9 [11], pensamos que el tamaño de la muestra en el estudio de De Martino (
n
= 54) era demasiado pequeño para determinar si el
CA9
201 SNP tuvo un efecto significativo en la expresión de CA9 y debe ser confirmada en estudios prospectivos más grandes.
una variedad de SNPs podría estar en silencio, es decir, sin ningún efecto directo sobre los productos génicos. Sin embargo, en virtud de desequilibrio de ligamiento (LD) que existe en todo el genoma humano, aún pueden ser utilizados como marcadores genéticos para localizar variantes funcionales adyacentes que contribuyen a la enfermedad. Cuando cada SNP construcción de los haplotipos tiene una contribución real a la susceptibilidad de la enfermedad, aunque no aparente, los análisis de haplotipos pueden proporcionar mayor potencia estadística y son a veces ventajoso sobre análisis de SNPs individuales para la detección de una asociación entre alelos y un fenotipo de la enfermedad [38]. Se analizaron las contribuciones de diferentes combinaciones de haplotipos de 3
CA9
SNPs (rs2071676, rs3829078, rs1048638 y) con el riesgo de cáncer oral y, finalmente, se encontró que el
GAA
haplotipo mostró un alto riesgo de CCCA (Tabla 5). Es posible que el
GAA
haplotipo de
CA9
es en LD con otros polimorfismos funcionales que son responsables de la susceptibilidad a la CCCA.
Las interpretaciones de este estudio está limitado debido información sobre ciertos factores de riesgo de cáncer bucal, tales como el fumar marihuana (cannabis), el consumo de nicotina medicinal, la herencia y los riesgos familiares, no estaban disponibles para los especímenes reclutados, y esta limitación puede limitar el ajuste de estas posibles influencias. En este estudio, sin embargo, los principales factores de riesgo para el cáncer oral, el consumo de alcohol y tabaco y mascar betel quid, se ajustaron para el fin de estimar los efectos de los polimorfismos de genes en el desarrollo clínico-patológico de la CCCA. Algunos ajustes indirectos, tales como la edad, el sexo y área geográfica, también se utilizaron para evaluar los efectos de los polimorfismos de genes en el cáncer oral entre los sujetos de control sanos y pacientes con COCE para reducir la posibilidad de resultados falsos positivos. En un futuro estudio, el aumento de la muestra (sangre y tejido tumoral) número y teniendo más factores de riesgo CCCA en cuenta en el análisis podría validar precisamente estos hallazgos.
En conclusión, nuestros resultados sugieren que las interacciones entre genes y medio ambiente
CA9
polimorfismos y masticar betel quid con el tabaquismo puede alterar la susceptibilidad al desarrollo del cáncer oral. El
GAA
haplotipo de los 3
CA-9
SNPs (rs2071676, rs3829078, rs1048638) y combinados también mostró una asociación de alto riesgo de CEI. Los pacientes de cáncer oral con el
CA9
201 A /G polimorfismo tienen un mayor riesgo de tener metástasis cervical de los ganglios linfáticos que hacer portadores WT.
Materiales y Métodos
sujetos y Recogida de las muestras
Se reclutaron 462 pacientes (444 hombres y 18 mujeres, con una edad media de 54,4 ± 11,4 años) al Chung Shan del hospital Médico Universitario de Taichung, y el hospital cristiano de Changhua y el hospital Memorial en Mostrar Chwan Changhua, Taiwán. Los pacientes se inscribieron como un grupo de casos en 2007-2010. Entre los 462 casos, los tumores estaban localizados en la mucosa bucal (n = 189), la lengua (n = 148), encía (n = 48), el paladar (n = 30), el suelo de la boca (n = 21), y otros (n = 26). Mientras tanto, los controles se inscribieron en el examen físico durante esos tres hospitales, que son también las instalaciones que se han recogido casos de. Al final de la contratación, se incluyeron un total de 519 participantes (425 hombres y 94 mujeres, con una edad media de 52,4 ± 14,7 años) que tenían ni la historia de auto-reporte de cáncer de sitios. Además, los sujetos con enfermedad precancerosa oral, tales como fibrosis submucosa oral de, leucoplasia, eritroplasia, hiperplasia verrucosa, etc. fueron excluidos del grupo de control. Antes del comienzo de este estudio, se obtuvo la aprobación del Consejo de Mostrar el Hospital Memorial Chwan de Revisión Institucional y el consentimiento informado por escrito para participar en el estudio se obtuvo de cada persona.
En ambos casos y controles, se utilizó una cuestionario para obtener información sobre la exposición del paciente a masticar betel quid, el tabaquismo y consumo de alcohol. La información médica de los casos se obtuvo de la historia clínica, e incluyó estadificación TNM clínico, el tamaño del tumor primario, los ganglios linfáticos y el grado histológico. Los pacientes de cáncer oral se organizaron clínicamente en el momento del diagnóstico de acuerdo con el sistema de estadificación TNM del Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC) Staging Manual (7ª ed.) [39]. Los tumores se clasifican como estadio I y II (n = 213) y la etapa III + en estadio IV (n = 249). se detectó metástasis en los ganglios linfáticos en 164 casos (35,5%). especímenes de sangre completa obtenidos de los controles y los pacientes CCCA se colocaron en tubos que contienen el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), inmediatamente se centrifugaron y se almacenaron a -80 ° C.
Selección de CA9 polimorfismos
En dbSNP base de datos, más de 30 SNPs se ha documentado en la región de 11 exones del gen
CA9
, incluyendo tres SNPs localizados en las secuencias codificantes del gen (exones 1, 7 y 11). Para obtener la potencia adecuada para evaluar la posible asociación, se investigó rs2071676 (G201A en el exón 1), rs3829078 (A1018G en el exón 7) y rs1048638 (C1584A en 3'UTR), los que tienen frecuencias de alelos menores ≥ 5%. Por otra parte, otro de los SNP
CA9
gen (un joven de 18 pb supresión /inserción; 376 Del). Fue seleccionada en este estudio, ya que este SNP se encontró en los pacientes con cáncer [11]
Extracción de ADN genómico
ADN genómico fue extraído por medio de kits de mini sangre QIAamp DNA (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Disolvimos DNA en tampón TE (Tris 10 mM y EDTA 1 mM; pH 7,8) y después se cuantificó por medición de la OD260. La preparación final se almacenó a -20 ° C y se utilizó para actuar como plantillas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
discriminación PCR en tiempo real
alélica de la
CA9
201 (rs2071676), 1081 (rs3829078) y rs1048638 (+1584) alélicas de los polimorfismos se evaluaron con un ABI StepOne ™ sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), y se analizaron con SDS vers. software 3.0 (Applied Biosystems) usando el ensayo de TaqMan. Además, los polimorfismos alélicos 376del393 se evaluaron con PCR. Los productos se separaron en un gel de agarosa al 3% y después se tiñeron con bromuro de etidio. Las secuencias de los cebadores y sondas para el análisis de los
CA9
genes polimorfismos se describen en la Tabla 7. El volumen final para cada reacción fue 5 l, que contiene 2,5 l TaqMan Genotipado Master Mix, 0.125 l TaqMan mezcla de sondas, y 10 ng de ADN genómico. En nuestro estudio preliminar, tal mezcla de reacción (5 l) se ha demostrado proporcionar resultados idénticos a la de con un volumen final de 20 l que se recomiendan en las instrucciones del fabricante. La PCR en tiempo real incluye una etapa de desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a de 95 ° C durante 15 s y luego a 60 ° C durante 1 min. Para validar los resultados de PCR en tiempo real y PCR, alrededor del 10% de los ensayos se repitieron y varios casos de cada genotipo fueron confirmados por el análisis de la secuencia de ADN.
Análisis estadístico
Las diferencias entre los 2 grupos se consideraron significativos los
p
valores eran & lt; 0,05. Hardy-Weinberg (HWE) se evaluó mediante una bondad del ajuste
Χ
2
-test para los marcadores bialélicos. El Mann-Whitney
T-test
y la prueba exacta de Fisher se utilizó para comparar las diferencias en la distribución de las características demográficas de los pacientes entre los libres de cáncer (de control) y los grupos de cáncer oral. Las odds ratio ajustada (AORs) y los intervalos de confianza del 95% (IC) de la asociación entre el genotipo y frecuencias de riesgo, además de las características clinicopatológicas se estimaron utilizando múltiples modelos de regresión logística, después de controlar por otras variables. Se analizaron todos los datos con sistema estadístico analítico (SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.) software (vers. 9.1, 2005) para Windows.