Extracto
MUC16 (CA125) pertenece a una familia de proteínas de peso de O-glicosilada de alto peso molecular conocidos como mucinas. Mientras MUC16 es bien conocido como un biomarcador de cáncer de ovario, su patrón de expresión en el cáncer de páncreas (CP), la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos, sigue siendo desconocido. El objetivo de nuestro estudio fue analizar la expresión de MUC16 durante la iniciación, progresión y metástasis de PC para su posible implicación en el diagnóstico de PC, pronóstico y tratamiento. En este estudio, se utilizó un microarray que contiene los tejidos de pacientes sanos y de PC para investigar la expresión diferencial de proteínas de MUC16 en PC. los niveles de ARNm de MUC16 también se midieron por RT-PCR en los tejidos pancreático, pancreatitis, y PC humanos normales. Para investigar su patrón de expresión durante la metástasis PC, se analizaron muestras de tejido del tumor pancreático primario y la metástasis (del mismo paciente) en los ganglios linfáticos, el hígado, el pulmón y el omento de pacientes en estadio IV de PC. Para determinar su asociación en la iniciación de PC, tejidos de pacientes de PC que contienen lesiones pre-neoplásicas de diferentes grados se tiñeron para MUC16. Por último, la expresión de MUC16 se analizó en 18 líneas celulares PC humanos. MUC16 no se expresa en los conductos pancreáticos normales y está fuertemente aumentada en PC y detectado en el tejido pancreatitis. Se detectó por primera vez en los de alto grado lesiones pre-neoplásicas precedentes adenocarcinoma invasivo, lo que sugiere que la regulación al alza es un evento tardío durante el inicio de esta enfermedad. expresión MUC16 parece ser más fuerte en las lesiones metastásicas en comparación con el tumor primario, lo que sugiere un papel en la metástasis del PC. También hemos identificado las líneas de células PC que expresan MUC16, que puede ser utilizado en futuros estudios para dilucidar su papel funcional en la PC. En conjunto, nuestros resultados ponen de manifiesto que la expresión de MUC16 es significativamente mayor en PC y podría desempeñar un papel potencial en la progresión de esta enfermedad
Visto:. Haridas D, S Chakraborty, Ponnusamy MP, Lakshmanan I, Rachagani S, Cruz E, et al. (2011) Implicaciones biopatológicos de MUC16 expresión en el cáncer pancreático. PLoS ONE 6 (10): e26839. doi: 10.1371 /journal.pone.0026839
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Julio, 2011; Aceptado: 4 de octubre de 2011; Publicado: 31 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Haridas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud (RO1 CA78590, RO1 CA131944, CA111294 UO1 EDRN y P50 CA127297 SPORE), Departamento de Defensa (BC101014), la Fundación Susan G. Komen (KG070826), del Centro del cáncer del NCI programa de subsidios para 5 P30 CA036727-2452 y el Departamento de Salud Institucional LB595 subvención para el cáncer de Nebraska y fumadores de Investigación de Enfermedades. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas (CP) es una neoplasia extremadamente letal. Según la Sociedad Americana del Cáncer, el número estimado de casos nuevos y muertes debido a la PC en los Estados Unidos en 2010 fueron 43.140 y 36.800, respectivamente, con una tasa de supervivencia a 5 años, de 6% [1]. El adenocarcinoma de los conductos pancreáticos representa casi el 95% de todos los tumores pancreáticos [2] y se asocia con una supervivencia media de sólo 3-6 meses. Las malas perspectivas de los pacientes con CP se atribuye en gran parte a la naturaleza asintomática de esta neoplasia que a menudo conduce a su diagnóstico en un estadio avanzado no resecable y con frecuencia de la enfermedad.
Se han reportado varios proteínas que están alteradas durante la iniciación y progresión de la PC. Una de estas familias de proteínas cuya expresión se upregulated de manera aberrante en PC es mucinas. Estos son de alto peso molecular, las proteínas fuertemente glicosiladas que que sirven varias funciones en los tejidos normales incluyendo la lubricación y el atrapamiento de los agentes patógenos dañinos [3] - [7]. Su expresión es aparentemente alterado en varias condiciones malignas incluyendo PC [8].
CA125 (MUC16) es una glicoproteína de superficie celular que fue identificada por primera vez por Bast
et al
en 1981 [9]. MUC16 se escinde y derramó en el torrente sanguíneo y ha sido el foco de investigación activa como biomarcador en el suero para una variedad de tipos de tumores [10]. En la actualidad es el único marcador tumoral sérico utilizado de forma rutinaria en las clínicas para el diagnóstico y el pronóstico sobre todo en la predicción de los pacientes con cáncer de ovario [11]. CA125 es el anticuerpo más conocido que reconoce MUC16 tanto en los tejidos y en los fluidos corporales y está dirigido a un epítopo localizado en la región de repetición en tándem de la proteína MUC16 [4], [12].
Estructuralmente la proteína MUC16 comprende de un dominio extracelular N-terminal que consiste en más de 22.000 residuos de aminoácidos y se cree que está fuertemente glicosilada. El dominio central contiene hasta 60 secuencias glicosiladas de péptidos repetidos en tándem (un rasgo característico de la familia de mucina), seguido de un dominio C-terminal que contiene un sitio de escisión proteolítica potencial, un dominio transmembrana y una cola citoplásmica corta con varios sitios potenciales de fosforilación [13], [14].
en el presente estudio, hemos analizado la expresión de MUC16 en tejidos y líneas celulares PC utilizando el anticuerpo monoclonal CA125. Además hemos analizado la expresión de su mRNA en tejidos aislados de pacientes de PC y pancreatitis por RT-PCR. El objetivo general de este estudio fue investigar si existe una expresión diferencial de MUC16 durante la progresión y el desarrollo de PC y para examinar una posible correlación entre la expresión de MUC16 y las características del tumor. Nuestro estudio sugiere que MUC16 no se expresa en los conductos pancreáticos normales, pero upregulated durante la progresión y el desarrollo PC, lo que sugiere un posible papel de MUC16 en la patogénesis de PC y su diagnóstico clínico.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Un consentimiento informado por escrito para todos los tejidos no archivado antes de la recogida de tejidos para todas las muestras obtenidas a través de UNMC.
muestra de tejido y líneas celulares
El cincuenta PC -ocho y 8 muestras de tejido pancreático normal (formalina fijo y embebido en parafina) se obtuvieron de Accumax (número de matriz A207IV). La matriz contenía tejidos clasificados como no neoplásicas (8 puntos), adenocarcinoma bien diferenciado (12 puntos), adenocarcinoma moderadamente diferenciado (22 puntos) y el adenocarcinoma pobremente diferenciado (24 puntos). La expresión de MUC16 se analizó por RT-PCR a partir de 2 tejidos normales humanos de páncreas, pancreatitis 6 y 17 tejidos de cáncer de páncreas que se obtuvieron después de la aprobación del protocolo por el IRB (IRB- 491-97) en la Universidad de Nebraska Medical Center, Omaha , NE. El ARNm se convierte en ADNc usando oligo dT. Los cebadores utilizados para comprobar si hay MUC16 son la expresión 'GTCCCCAACAGGCACCACACCG-3' MUC16_F-5 y MUC16_R-5'GGGCACTGTTGCTGGACGTTGTATT-3 'y el producto de PCR se verificó la secuencia en las instalaciones de secuenciación de ADN UNMC.
Además, se fija con formalina y embebidos en parafina muestras (FFPE) los tejidos PC de 34 pacientes con CP que comprenden de páncreas normal (7 puntos), PC principal (31 puntos) y metástasis en el hígado (23 puntos), los pulmones (11 puntos), los ganglios linfáticos (17 puntos) y el omento /diafragma (11 puntos) obtenido de la Universidad de programa de la autopsia rápida de Nebraska Medical Center (IRB-091-01) también fueron analizados para investigar el cambio en la expresión MUC16 durante la metástasis PC. En el marco del programa de la autopsia rápida a UNMC, tejidos de pacientes donantes son capturados dentro de tres horas después de su muerte y las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido o se colocan en formalina para la fijación inmediata. microarrays de tejidos (TMA) a base de bloques de parafina de los tejidos del programa autopsia rápida se utilizaron para MUC16 inmunotinción. Además de los núcleos de tumor, cada bloque contenía muestras de control de los no neoplásico colon, riñón y páncreas tumorales adyacentes de los mismos donantes. Los bloques TMA se cortaron en secciones de 4 micras y se montaron en portaobjetos cargados
Veinticinco muestras de tejido pancreático que contienen PC intraepitelial Neoplasias (PanIN) lesiones de diferentes grados (número de lesiones identificadas PanIN-I-163;. PanIN II-197; conductos normales-140) adyacentes a las áreas de PC también se obtuvieron después de la aprobación del protocolo por el Comité de Revisión Institucional (IRB-491-97) de la Universidad de Nebraska Medical Center, Omaha PanIN III-26 y, NORDESTE. Cuatro secciones de parafina micras de espesor fueron cortadas y teñidas con hematoxilina y eosina para la evaluación patológica. El grado de PanINs y expresión de MUC16 en cada tipo de lesión PanIN fue evaluada por el patólogo quirúrgico (SML)
.
La expresión de MUC16 ARNm y proteína también se analizó en un panel de líneas celulares PC (MiaPaca, Panc89 , Dang, HPAC, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, HUPT3, Capan1, Suit2, CD11, T3M4, FG, AsPC1, Panc1, HG625, Capan2 y BxPC3) utilizando cebadores anteriormente mencionados. Las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2 en DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal y antibióticos (penicilina y estreptomicina 100 g /ml). Todas las líneas celulares se obtuvieron a partir de ATCC.
La inmunohistoquímica
Las diapositivas fueron procesados para inmunotinción como se describe anteriormente [15], [16]. El anticuerpo anti-MUC16 ratón monoclonal (clon M11, fabricado por Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) se utilizó como anticuerpo primario. (Foto: factor de 764 mg /ml de dilución 1:500): perfil
Todos los portaobjetos teñidos fueron anotados por un patólogo bajo un microscopio Nikon E400 Luz y fotografías representativas tomadas. la intensidad de la tinción de MUC16 (CA125) se puntuó en una escala de 0-3 (3-inmunoreactividad fuerte 0-negativo, 1-débil, 2-moderada,). El porcentaje de células positivas para MUC16 dentro de una lesión dada se puntuó en una escala de 1 a 4 como sigue: 1: 0 a 25% de células positivas; 2: 26-50% positivas; 3: 51-75% positivas; y 4: 76-100% positivo. La puntuación de la intensidad de la tinción y el porcentaje de células inmunorreactivas se multiplica para obtener una puntuación compuesta que va de 0 a 12. Una sección se consideró "positivos" para MUC16 si la intensidad de MUC16 era & gt; 1. En consecuencia tejidos también fueron clasificados como "positivo" o "negativo" para MUC16 expresión.
confocal de inmunofluorescencia microscopía
Se procesaron las células PC para microscopía confocal como se describe anteriormente [17], [18] . Brevemente, las células fueron cultivadas a 37 ° C durante 48 h en cubreobjetos de vidrio estériles, se lavó con tampón de Hanks que contiene 0,1 M de HEPES y fijos en metanol enfriado con hielo a 20 ° C durante 2 min. Las células se bloquearon con suero de cabra al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 min, seguido de incubación con anti-MUC16 anticuerpo monoclonal (CA125) diluido en PBS (CA125 de stock: 764 mg /ml; factor de dilución 1:500) para 1 h a temperatura ambiente. Las células se lavaron durante 10 min (x 4 veces) con PBS y después se incubaron con anticuerpo de cabra conjugado con FITC anticuerpo secundario anti-ratón de 30 min. Las células se lavaron de nuevo (10 minutos x 4) y se montaron en portaobjetos de vidrio anti-fade en medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.).
Western blot
celular PC líneas fueron procesados para extracción de proteínas y fue seguido por inmunotransferencia de tipo Western de SDS-agarosa como se describe anteriormente [17], [18]. Calor lisados desnaturalizados se resolvieron en un gel SDS-agarosa al 2% por electroforesis y posteriormente transferidos a membranas de PVDF. Después de la transferencia la membrana se bloqueó con leche en polvo desnatada al 5% en PBS durante 2 h, y se incubaron con mAb anti-MUC16 (Stock: 764 g /factor de dilución ml 1:1000) o anti-β-actina anticuerpo monoclonal durante la noche a 4 ° DO. Las membranas se lavaron con PBS que contenía 0,1% de Tween-20 y posteriormente se incubaron con rábano picante peroxidasa de cabra conjugado con anticuerpos secundarios anti-ratón (diluidas 1:2000 en leche desnatada al 5% seco en PBS) (Amersham Biosciences Buckinghamshire, Reino Unido) durante 1 h . Se detectó la señal mediante un aumento de quimioluminiscencia (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido).
La extracción de RNA y RT-PCR
El ARN total se aisló de los tejidos mediante el
mir
kit de aislamiento Vana miARN (Ambion, Foster City, CA, EE.UU.) y de las líneas celulares utilizando el kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARNm aislado se convirtió a cDNA utilizando oligo dT. Se utilizó el ADNc diluido 1:05 para determinar la expresión de MUC16 ARNm utilizando PCR según el protocolo descrito previamente [19]. Los productos se corrieron en un gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio (10 mg /ml). Los cebadores utilizados para comprobar la expresión de MUC16 son los que se han mencionado anteriormente.
El análisis estadístico
Las variables continuas (puntuación egcomposite) se compararon mediante la prueba t de dos colas de Student asumiendo desigual diferencia. Las variables categóricas (estadio, el grado del tumor, el órgano de metástasis a distancia) se compararon mediante la prueba de Kruskal Wallis ANOVA o la prueba exacta de Fisher. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todo el análisis estadístico se realizó mediante Medcalc para el software 9.6.4.0 versión de Windows (software MedCalc BVBA, Mariakerke, Bélgica).
Resultados
MUC16 se sobreexpresa diferencialmente en los tejidos de adenocarcinoma pancreático
Para identificar el patrón de expresión de MUC16 en la patogénesis de PC, su expresión se comparó entre los conductos no neoplásicas y adenocarcinoma de páncreas usando una micromatriz de tejido que comprende páncreas no neoplásico (n = 8) y los tejidos de PC primaria de la variación de los grados (n = 58 ). Una muestra de tejido se consideró positivo si al menos & gt; 5% de las células expresó MUC16. expresión MUC16 no se observó en los conductos no neoplásicas (Figura 1A). Sin embargo, en 38/58 (65%) casos de PC, los conductos malignos fueron positivas para MUC16. La expresión de MUC16 fue significativamente mayor en PC en comparación con los conductos no neoplásicas (p = 0,003 por la prueba exacta de Fisher de dos colas). Además, para determinar si hay una variación en la expresión de MUC16 con la progresión de la PC, se comparó su expresión entre los tejidos de PC clasificados por estadio y grado tumoral. No hubo un aumento progresivo de la expresión de MUC16 con la pérdida de la diferenciación del tumor, con 50% de la bien diferenciado (6/12), 59% de la moderadamente diferenciado (13/22) y 66% de los tejidos de PC pobremente diferenciados (16/24) siendo positiva (Figura 1A). Mientras que la expresión de MUC16 no fue significativamente diferente entre los tres grupos, la puntuación compuesta media fue significativamente mayor en PC moderado y mal diferenciado en comparación con adenocarcinomas bien diferenciados (p = 0,02 y 0,001 respectivamente). Sin embargo, la calificación global no fue significativamente diferente entre los casos moderados y pobremente diferenciados PC. Esto sugiere que MUC16 de expresión aumenta significativamente con la pérdida de diferenciación de los tejidos de PC.
El tejido secciones se obtuvieron de ACCUMAX en forma de una matriz y se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-MUC16. Se observaron las secciones teñidas bajo el microscopio y la inmunorreactividad fue juzgado por la intensidad y la extensión de la mancha oscura. El anticuerpo anti-MUC16 no mostró ninguna tinción en el tejido pancreático normal (ambos conductos y acinos), mientras que se observó una fuerte tinción en los tejidos cancerosos. plot (A) Box representa la puntuación de MUC16 en los distintos grados de PC. A partir de la gráfica de caja se observó la inmunorreactividad a ser mayor en el mal (D) y los tejidos moderadamente diferenciados (C) en comparación con los tejidos bien diferenciados (B). El páncreas normal (A) de tejido también es negativo. Se muestran secciones representativas que muestran la expresión de MUC16 en los conductos pancreáticos normales y varios grados de adenocarcinoma invasivo. Nótese la tinción de membrana predominante de MUC16 en PC. (B) Estudios de expresión de MUC16 en Normal, pancreatitis y los tejidos de cáncer de páncreas por RT-PCR. RT-PCR se realizó en ARNm aislado de tejido pancreático humano normal (N1, N2), el tejido pancreatitis humana (Pt1-PT6) y el tejido de cáncer pancreático humano (PC1-PC17). No se observó amplificación en los tejidos normales, pero se observó amplificación en los tejidos de cáncer de páncreas y pancreatitis. Actina se utilizó como control interno.
La expresión diferencial de MUC16 en PC también se examinó mediante la comprobación de la expresión de MUC16 en el nivel transcripcional mediante el aislamiento de ARNm a partir de páncreas humano normal, pancreatitis y los tejidos de PC. expresión MUC16 mRNA estaba ausente en tejidos pancreáticos normales (0/2, 0%) pero estaba presente en 12/17 (71%) de PC y 1/6 (16,7%) los tejidos pancreatitis (Figura 1B). La mayor parte de los tejidos de PC fueron clasificados como de moderada a PC pobremente diferenciado (8/17). Hubo 1 caso de PC bien diferenciados, uno de neoplasia pseudopapilar y uno cada uno de un adenocarcinoma mucinoso quístico y el tumor de células gigantes. 5/8 (62,5%) de la moderada pobremente diferenciado, 1/1 (100%) de bien diferenciado, 1/1 tumor de células gigantes y 1/1 de adenocarcinoma quístico mucinoso expresan MUC16. Seis pacientes de PC también tenían un historial de pancreatitis crónica (PC). 5/6 (83%) de estos tumores también fueron positivas para MUC16. En comparación, 7 pacientes de PC no tenían ninguna historia de la CP. De estos casos, 5/7 (71,4%) fueron positivas para MUC16. La expresión de MUC16 no fue significativamente diferente entre aquellos con o sin antecedentes de CP (Tabla 1).
regulación positiva diferencial de MUC16 en la displasia de alto grado de páncreas
Después de haber observado que MUC16 se expresa de manera aberrante en el adenocarcinoma ductal pancreático a continuación trató de estudiar la expresión de MUC16 durante el desarrollo de la PC. Para ello, estudiamos su expresión en lesiones pre-malignas conocidas preceder adenocarcinoma invasivo, denominado como neoplasia intraepitelial pancreáticas (PanINs). lesiones PanIN se clasifican como PanIN I, PanIN II y PanIN III, que corresponde a la displasia de bajo, intermedio y alto grado y se caracteriza por cambios bien definidos histológicos incluyendo atipia nuclear, el hacinamiento nuclear, pseudoestratificación y en PanINs de alto grado, cribriforming [20] . Hemos observado que el 20% de PanIN-I (33/163), 28% de PanIN-II (55/197) y 42% de las lesiones PanIN-III (11/26) fueron positivas para MUC16 expresión, pero no se detectó su expresión en los conductos adyacentes normales (n = 140) como se muestra en la Figura 2A. expresión MUC16 fue significativamente mayor en las tres etapas de displasia (p & lt; 0,00001) en comparación con los conductos normales. Pero la expresión de MUC16 fue significativamente mayor en la displasia de alto grado (PanIN-III) en comparación con displasia de bajo grado (PanIN-I, p = 0,02). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en MUC16 positividad entre PanIN-I y PanIN-II (Figura 2B). Al igual que en el carcinoma invasivo, MUC16 predominantemente localizado en la membrana celular de las células displásicas.
(A) MUC16 expresión se evaluó en los tejidos que contienen tanto el páncreas normal, y lesiones displásicas adyacentes. Mientras que la expresión MUC16 fue débil en el bajo grado, lesiones PanIN etapa temprana (PanIN I), que progresivamente aumenta con el aumento de la displasia de la más alta expresión observada en la displasia de alto grado (PanIN III) y PC. Nótese la tinción predominante membrana de MUC16 en todos los grados de PanINs (Aumento original x 200). plot (B) la caja que representa la puntuación compuesta de MUC16 a través de los diferentes grados de lesión PanIN y conductos normales. A partir de la gráfica de caja se observa que MUC16 se expresa fuertemente en PanIN II y III, en comparación con PanIN I.
Comparación de la expresión de MUC16 entre el primario y metastásico cáncer de páncreas
Varias proteínas son sabe que tienen una expresión diferencial en cáncer metastásico vs. primario [21], [22]. Para investigar si la expresión de MUC16 se altera durante la metástasis de PC a sitios distantes, se investigó su expresión en adenocarcinomas y metástasis pancreáticas emparejados (obtenido del mismo paciente) primaria en los ganglios linfáticos, los pulmones, el hígado y el epiplón /diafragma (obtenida como parte del programa de autopsia rápida). MUC16 no se expresó en cualquiera de los conductos no neoplásicas, mientras que los tumores primarios y metastásicos del mismo paciente expresan MUC16 con casi la misma intensidad. Los resultados se resumen en la Figura 3A y 3B. No hubo diferencia significativa en la puntuación compuesta entre los sitios primarios y metastásicos (que se resumen en el gráfico de caja). Sin embargo, los pacientes que expresan MUC16 en su tumor primario también expresan MUC16 en los sitios metastásicos. Esto sugiere que los tumores pancreáticos mantienen MUC16 expresión durante su propagación, posiblemente señalando el papel de MUC16 en la diseminación de células PC.
Para investigar la alteración en la expresión MUC16 con la progresión, se determinó la expresión de MUC16 en pancreático primario emparejado cáncer y la metástasis a cualquiera de los pulmones, los ganglios linfáticos, el hígado o el omento /diafragma. En (A), mientras que la expresión de MUC16 fue mayor en PC metastásico que en el tumor primario, esto no fue significativo. A- páncreas normales; cáncer de páncreas B-; metástasis de hígado C-; metástasis de pulmón D-; E- metástasis de ganglios linfáticos; metástasis F- epiplón /diafragma. Además, (B) muestra que en el mismo paciente, los conductos no neoplásicas fueron negativos, mientras que hubo una fuerte expresión de MUC16 en el tumor pancreático primario y esto se mantienen incluso en la metástasis.
la expresión de MUC16 en las distintas células de cáncer de páncreas humanos
Después de haber demostrado que MUC16 se expresa de forma diferente en los tejidos de PC, que investigarse más a su expresión en líneas celulares de PC. La expresión de MUC16 tanto en el mRNA (el tamaño del producto de PCR es de 341 pb) y no se observaron nivel de proteínas en Colo357, T3M4, HPAF /CD18, Dang, HPAC, SU86.86, FG y células Capan-1 (Figura 4A y 4B). Todas las demás líneas celulares PC probados fueron negativos para la expresión de MUC16. Para delinear la localización subcelular de MUC16, se realizaron estudios de inmunofluorescencia en células CD18 /(MUC16 que expresan) y suit2 y CD11 (MUC16 no expresan) células Capan1 y HPAF. La tinción se observó tanto en las líneas de células positivas concordantes con la distribución de MUC16 en los tejidos y no se observó tinción en las líneas celulares negativas (Figura 4C).
(A) Análisis de transferencia Western de la expresión de MUC16 en PC líneas celulares. Proteína lisados de dieciocho líneas de células PC se resolvieron en un gel SDS-agarosa 2%. Se observó la expresión de MUC16 Dang, HPAC, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, Capan1 y líneas celulares T3M4. β-actina se utilizó como control interno (B) Análisis de RT-PCR de la expresión de MUC16 en diversas líneas celulares PC. Actina se utilizó como control interno. (C) Los estudios de inmunofluorescencia de dos líneas celulares (CD18) y Capan1 que expresan MUC16 y dos líneas celulares (CD11) y Suit2 que no expresan MUC16.
Discusión
PC es la cuarta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos con sólo un 20% de los pacientes que sobreviven durante 2 años y sólo el 6% durante cinco años. Su incidencia de la tasa de mortalidad se ha mantenido prácticamente sin cambios durante las últimas décadas, a pesar de un conocimiento considerable de su biología [23], [24]. Esta alta tasa de mortalidad entre los pacientes de PC es debido a la tendencia de las células cancerosas a la metástasis temprana. Esto, junto con la pobre respuesta a la terapia y la alta tasa de recurrencia hace que sea uno de los cánceres más letales conocidas por el hombre [24]. PC a menudo se diagnostica en una etapa avanzada, principalmente debido a la falta de marcadores de diagnóstico precoz fiables [24]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar marcador específico de detección temprana (s) y dianas moleculares adecuados para combatir el PC. Las mucinas son uno de los principales marcadores biológicos que han surgido en los últimos años como marcadores de diagnóstico muy específicos en varios tumores malignos, incluyendo páncreas, tumores malignos ginecológicos y en el tracto aerodigestivo [25]. Además, su expresión aberrante ha sido demostrada para modular el crecimiento celular, la diferenciación, la transformación, la adhesión, la invasión y la vigilancia inmune [7].
CA125 /MUC16 es un biomarcador tumor que se utiliza actualmente para el seguimiento de pacientes con cáncer de ovario [26]. Sin embargo, su papel en la patogénesis de PC permanece sin explorar. En el presente estudio, se analizó el patrón de expresión de MUC16 en los tejidos de PC y la comparamos con la del páncreas normal. Además, también se evaluó su asociación con el desarrollo de PC y con el estadio del tumor, grado y metástasis. Curiosamente, nuestros resultados mostraron que el páncreas normal no expresan MUC16, pero su expresión está regulada positivamente de manera significativa en 12/17 PC y un sexto tejido pancreatitis. Se ha demostrado previamente que existe una asociación entre el carcinoma de páncreas y pancreatitis crónica (esporádica y familiar) y la relación incidente estandarizado de desarrollo de PC en pacientes con pancreatitis crónica es 14 a 18 [27]. Esta observación de MUC16 se upregulated significativamente en PC es coherente con la expresión de otros unidas a la membrana mucinas MUC4 y MUC1 que también se expresa de forma aberrante en PC y han sido identificados como marcadores diagnósticos potenciales para esta malignidad [24], [28] - [31 ] también se observó que la expresión de MUC16 aumentó progresivamente con la pérdida de diferenciación del tumor PC. Se ha observado anteriormente que los pacientes con CP que han sido diagnosticados con metástasis tuvieron la tendencia a tener adenocarcinoma pancreático pobremente diferenciado [32], [33]. Por lo tanto, nuestros hallazgos sugieren que MUC16 puede tener un papel importante que jugar en la progresión y metástasis de PC.
De acuerdo con el modelo de progresión muy conocido para PC, el carcinoma ductal desarrolla a partir de conductos no neoplásicas través de una serie de las lesiones pre-malignas denominado como PanINs [33]. Hemos observado que la expresión de MUC16 aumenta progresivamente desde PanIN I de PanIN III. En particular, el porcentaje de positividad MUC16 en las lesiones de alto grado PanIN fue significativamente mayor que la de PanINs de bajo grado. Esto sugiere que la expresión de MUC16 se altera en la etapa de la displasia pancreática y puede desempeñar un papel crítico en la progresión de la PC. MUC4, otra mucina unida a la membrana se ha demostrado previamente que se upregulated diferencialmente con el aumento progresivamente displasia, lo que sugiere la posibilidad de que puede haber ciertas vías reguladoras comunes que modulan la expresión de estos dos mucinas durante el desarrollo PC [28], [34], [ ,,,0],35]
la alta tasa de mortalidad en pacientes con CP es debido a la frecuente aparición de metástasis a distancia. En un análisis de 4.012 autopsias de pacientes de PC entre 1914 y 1943 se informó de que el sitio más común de metástasis a distancia fue el hígado, seguido por el peritoneo, pulmón y pleura, los huesos y las glándulas suprarrenales [33], [36] . Pero PC no se limita a estos órganos. Incluso los PCs pequeñas (& lt; 2 cm de diámetro) metástasis de exposiciones, el apoyo a la premisa de que PC es un tumor maligno que metastatiza muy temprano durante su progresión [33], [37] Entre las varias moléculas observadas para jugar un papel en la metástasis de PC células, mucinas han surgido como uno de los principales factores determinantes. Hemos demostrado anteriormente que MUC4, otro transmembrana mucina cuando se expresa promueve la metástasis y la invasión en las células PC [18], [38], [39]. En el presente estudio, se observó que esas PC primarias que expresan MUC16 también expresan MUC16 con casi la misma intensidad en los sitios de metástasis. Esto sugiere que las células PC pueden mantener su expresión de MUC16 durante el proceso metastásico. MUC16 se ha demostrado previamente que es importante en la metástasis de tumores sólidos en el sistema nervioso central a través de su interacción con la mesotelina, una proteína expresada diferencialmente en las células mesoteliales normales, mesoteliomas y algunos otros tumores malignos mesenquimales [40], [41]. Por lo tanto es posible que MUC16 podría interactuar con mesotelina y facilita la metástasis en PC.
Los mecanismos moleculares que conducen en la metástasis PC requiere una mejor comprensión de las proteínas que modulan la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y el proceso inverso (MET ), que son necesarios para el desprendimiento y re-unión de las células tumorales en el sitio de la metástasis, respectivamente. Los resultados de nuestro estudio sugieren que MUC16 podría tener un papel en el desarrollo y progresión de la PC y el estudio de su papel específico en la progresión de la PC será la base de nuestro próximo estudio. Su regulación al alza, que fue particularmente fuerte durante las últimas etapas de displasia PC, sugiere que los mecanismos que se convierten en su expresión están encendidos posiblemente tarde durante el desarrollo de PC. Estudios sobre MUC4 mucina han revelado que su expresión es silenciada en los conductos normales, en virtud de la hipermetilación de su promotor [42], [43]. Si los cambios epigenéticos similares también regulan la expresión de MUC16 aún no se ha examinado en estudios futuros. La detección de MUC16 en PanINs de alto grado (considerado como el verdadero lesiones displásicas con un alto riesgo de cáncer invasivo) sugiere su uso potencial en la detección temprana de lesiones potencialmente malignas en el páncreas. MUC16 también se elimina en el torrente sanguíneo (conocido como CA125), por lo que es una molécula atractiva para la investigación como un potencial biomarcador para PC secretada [44].
Además de identificar una adecuada
in vitro
modelo para investigar el papel funcional de MUC16, un panel de líneas celulares de PC se proyectó para MUC16 expresión tanto en la proteína y el ARNm. En la realización de análisis de Western blot, se observó que la expresión de MUC16 ya sea apareció como una única banda o como una banda de rayado. Se ha demostrado previamente que cuando mucinas son tratados con 2-mercaptoetanol y se analizaron en un gel de SDS-PAGE, se obtiene una banda de rayado como las mucinas se han reducido de su estructura oligomérica a su forma monomérica. Esta forma monomérica permite mucinas migrar más rápido en el gel y los oligómeros intactas permanecer en el bien [45]. Así pues, esto explica el patrón de expresión diferencial de MUC16 obtenida a través de las diversas líneas de células PC seleccionados. Además, también se observó que las líneas celulares que expresan MUC16, como Capan 1 (hígado reunió), Colo 357 (de los ganglios linfáticos se reunieron) y T3M4 (ganglio linfático se reunió) se derivaron de los sitios de metástasis, mientras que el MUC16 no líneas celulares que expresan tales como Panc1 , AsPC1 y BxPC3 se aislaron a partir del sitio del tumor primario (páncreas). Además, a partir de los estudios de RT-PCR se observó que los niveles de mRNA de algunas líneas celulares PC no corroboran con sus niveles de proteína correspondientes. Especulamos que MUC16 ARNm se somete a publicar procesamiento transcripcional en ciertas líneas celulares.