Extracto
La progresión de los cánceres de próstata (PC), al andrógeno-independiente estados de enfermedad localmente invasivos y metastásicos se asocia generalmente con la resistencia al tratamiento y la recaída de la enfermedad. El presente estudio se realizó para establecer la posibilidad de utilizar una combinación de productos oncogénicos específicos, incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), pAkt, el factor-kappaB nuclear (NF-kB) y macrófagos inhibitoria de citoquinas-1 (MIC-1) como biomarcadores y dianas terapéuticas para optimizar el manejo de los pacientes con CP localizado en etapas anteriores de la enfermedad. Los datos de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia han revelado que los niveles de expresión de EGFR, Ser
473-pAkt, p65 NF-kB y MIC-1 proteínas se mejoraron significativamente en el mismo subgrupo de 76 casos de muestras de adenocarcinoma prostático durante la progresión de la enfermedad y estos biomarcadores se expresaron en una pequeña subpoblación de células CD133
+ PC y de la masa tumoral mayor de CD133
- células PC. Es importante destacar que todos estos biomarcadores también se sobreexpresa en 80 a 100% de muestras de tejido de hueso metástasis 30 de PC. Por otra parte, los resultados han indicado que la vía de señalización del EGFR EGF puede proporcionar funciones críticas para la auto-renovación de la población lateral (SP) células dotados de características similares a las células madre a partir de células WPE1-NB26 altamente invasivos. De interés terapéutico, la focalización de EGFR, pAkt, NF-kappa B o MIC-1 también fue eficaz en la supresión de la parte basal y la formación prostasphere EGF-promovido por las células SP WPE1-NB26, induciendo desintegración de prostaspheres derivadas de células SP y la disminución de la viabilidad de SP y las fracciones de células no-SP WPE1-NB26. Además, la orientación de estos productos oncogénicos indujo la apoptosis dependiente de caspasa en las células SP-WPE1 NB26 quimiorresistentes y mejorado su sensibilidad a los efectos citotóxicos inducidos por docetaxel. Estos hallazgos sugieren que el uso combinado de EGFR, pAkt, NF-KB y /o MIC-1 puede representar estrategias prometedoras para mejorar la exactitud de los métodos de diagnóstico y pronóstico actuales y eficacia de los tratamientos de los pacientes de PC en la consideración de la heterogeneidad de la enfermedad, evitando de ese modo la progresión de la PC a los estados metastáticos y enfermedades letales
Visto:. Mimeault M, Johansson SL, Batra SK (2012) Implicaciones biopatológicos de la expresión de EGFR, pAkt, NF-kB y MIC-1 en el cáncer de próstata células Madre y sus progenies. PLoS ONE 7 (2): e31919. doi: 10.1371 /journal.pone.0031919
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: December 24, 2011; Aceptado: 20 de enero de 2012; Publicado: 23 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Mimeault et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores de este trabajo son apoyados por los Institutos nacionales de Salud de subvención (R01CA138791) para la investigación del cáncer de próstata. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (PC) sigue siendo uno de los tumores sólidos más frecuentemente diagnosticados en los hombres y las formas metastásicas de PC siguen representando la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer [1] - [5]. importantes avances en estos últimos años han dado lugar a un diagnóstico más precoz y la intervención terapéutica eficaz de la prostatectomía radical y /o radioterapia para los pacientes con bajo grado y PCs órgano-confinados [1], [4], [6], [7 ]. progresión de la enfermedad a localmente avanzado, cánceres de próstata metastásico y resistentes a la castración (CRPCs) se asocia con la resistencia al tratamiento y la enfermedad recaída [1], [4], [6]. A pesar de que los regímenes anti-hormonales y quimioterapéuticos actuales para PC altamente invasivos y metastásicos en general han mejorado la calidad de vida, estas terapias sólo son paliativos y culminan en la muerte de la mayoría de los pacientes después de unos 12-19 meses tras el diagnóstico [1], [4] , [6].
Numerosos estudios se han realizado para establecer las causas etiopatológicas de PC. Los factores intrínsecos y extrínsecos que predisponen al desarrollo de PC incluyen un intenso estrés oxidativo, atrofias inflamatorios y fibrosis asociada con lesiones graves en los tejidos, la desregulación hormonal y más particularmente con la edad avanzada [8] - [13]. La iniciación y progresión de la PC se caracteriza generalmente por una baja regulación de los productos del gen supresor de diversos tumores, incluyendo homólogo de fosfatasa tensina suprimido en el cromosoma 10 (PTEN) y p53, combinado con una regulación de la expresión y /o actividad de numerosas oncogénico elementos de señalización en las células PC [4], [13], [14]. La interacción de las complejas redes de señalización de las vías oncogénicas distintas iniciadas por las hormonas, factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas a través de sus receptores afines es típicamente implicado en la progresión de la PC a la enfermedad localmente avanzada y metastásica [4], [10], [11], [ ,,,0],13], [15]. Entre los productos de los genes desregulados frecuentes, la mayor expresión y la activación de diversas tirosina quinasas de receptor, incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), durante el proceso de transición epitelial-mesenquimal pueden conducir a la activación sostenida de las proteínas quinasas activadas por mitógenos, fosfatidilinositol 3 ' -kinase (PI3K) /Akt, factor nuclear kappa-B (NF-kB) y macrófagos inhibitoria de citoquinas-1 (MIC-1) [4], [13], [14], [16] - [32]. Estos productos oncogénicos pueden cooperar para promover el crecimiento sostenido, la supervivencia, la invasión y la metástasis de las células PC, así como para la adquisición de andrógeno-independiente (AI) y fenotipos chemoresistant, la resistencia al tratamiento y la recurrencia de la enfermedad [4], [13] - [ ,,,0],16], [18] - [21], [23], [25] - [27], [30] - [39].
Además, las recientes líneas de acumulación de evidencias experimentales han revelado que también madre PC /células progenitoras, también designado como PC y células iniciadoras de metástasis, que expresan marcadores de células madre similares, tales como CD133, CD44
alta, aldehído dehydrogense "ALDH
alto" y /o receptor de quimioquinas CXC 4 puede proporcionar funciones críticas en la carcinogénesis de próstata, metástasis en sitios distantes y re-crecimiento del tumor y la recurrencia de la enfermedad después del inicio del tratamiento [4], [10], [13], [14], [40] - [58]. Se ha demostrado que las células altamente oncogénicas PC madre /progenitoras fueron capaces de dar lugar
e in vitro
in vivo
a la masa a granel de células PC diferenciadas que expresan fenotipos luminales secretoras, incluyendo receptor de andrógenos y fosfatasa ácida prostática, y reconstituir los tumores
in vivo
con una arquitectura histológica de un grado de Gleason comparables a los tumores originales del paciente [13], [40] - [45], [47], [48] , [53]. También se ha observado que las células madre /progenitoras de PC, incluyendo población lateral (SP) aisladas de las células PC mediante el uso de Hoechst técnica de tinte de flujo de salida, que poseen un fenotipo AI y expresan altos niveles de casete de unión a ATP (ABC) los transportistas a múltiples fármacos tales como ABCG2, también eran más resistentes que sus progenies diferenciadas y células no-SP a los tratamientos anti-hormonales y quimioterapéuticos [13], [14], [50] - [52], [59]. A pesar de estos avances, se requieren estudios adicionales para validar biomarcadores moleculares distintas y dianas terapéuticas en las células madre /progenitoras de PC y sus progenie que podrían ser utilizados en combinación para optimizar el manejo terapéutico de los pacientes de PC en etapas de la enfermedad anteriores.
se llevó a cabo la presente investigación para determinar la relevancia clínica de la utilización de una combinación de varios productos oncogénicos desregulados, incluyendo EGFR, la forma fosforilada de Akt, NF
κ Francia B p65 y MIC-1 como biomarcadores moleculares para predecir el riesgo de progresión del tumor PC para localmente avanzado y dianas terapéuticas para erradicar la masa total de células PC. Por lo tanto, el análisis inmunohistoquímico de los niveles de expresión y los patrones de co-localización de estas proteínas se realizaron en el mismo grupo de tejidos de PC y en comparación con los tejidos adyacentes no malignas y las muestras de tejido prostático normales. Por otra parte, los ensayos de formación de prostasphere y -disintegration y pruebas de viabilidad con células SP dotados de propiedades de células madre y la fracción de células no-SP de la línea celular WPE1-NB26 altamente tumorigénicas e invasiva se realizaron con o sin EGF exógeno en el ausencia o presencia de los agentes inhibidores específicos de estos productos oncogénicos. En general, los resultados han apoyado los beneficios de la combinación de estos productos oncogénicos como biomarcadores moleculares y dianas terapéuticas para mejorar la exactitud de los métodos de diagnóstico y pronóstico y la eficacia de los tratamientos de los pacientes con CP en etapas anteriores de la enfermedad.
Materiales y Métodos
Materiales
La línea celular WPE1-NB26 humana fue originalmente obtenido de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células WPE1-NB26 parentales se mantuvieron rutinariamente en queratinocitos medio libre de suero (SFM) complementado con antibióticos (100 UI /ml de penicilina-100 mg /ml de estreptomicina), L-glutamina, extracto de pituitaria bovina y factor de crecimiento epidérmico (EGF) de acuerdo a las instrucciones del fabricante en una incubadora de 37 ° C se suministra con 5% de CO
2. Queratinocito-SFM, tinte rojo MitoTracker CMXRos y todos los demás materiales de cultivo procedían Life Technologies (Carlsbad, CA). Docetaxel, partenolide, Akt inhibidor VIII, y 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), LY294002 de Calbiochem Corp -2,5-difeniltetrazolio (MTT) (San Diego, CA) y gefitinib vinieron de laboratorio LC (Woburn, MA). El anticuerpo policlonal de conejo anti-CD133 (H-284), monoclonal de ratón anti-CD44 (HCAM, F-4) anticuerpo, anticuerpo policlonal de conejo anti-ABCG2 (B-25), anticuerpo policlonal de conejo anti-EGFR (1005), de cabra policlonal anti-Tyr
anticuerpo 1173-fosfo-EGFR (1173) que reconoce la forma EGFR fosforilado en la tirosina 1173 y policlonal de conejo anti-NF-kB proteína p65 subunidad (C-20) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). El monoclonal de ratón anti-β-actina de anticuerpos (clon AC-15) fue proporcionado por Sigma-Aldrich (St-Louis, MO, EE.UU.) y el monoclonal de conejo anti-Ser
473-pAkt anticuerpo (D9E) de Señalización Celular Technology, Inc. el anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra el fragmento escindido de la caspasa-9 se adquirió de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.) y
c
anticuerpo monoclonal de ratón anti-citocromo (6H2) proporcionado por Santa Cruz biotecnología, Inc (Santa Cruz, CA, EE.UU.). policlonal de conejo anti-MIC-1 anticuerpo fue generado en nuestro laboratorio contra la región de aminoácidos C-terminal de la proteína madura MIC-1 como se describe anteriormente [27], [29]. El anti-CD133 2 anticuerpo monoclonal conjugado con ficoeritrina /(293C3) se adquirió de Miltenyi Biotec. Inc. y empleado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La avidina-biotina Vectastain complejo kit procedimiento de peroxidasa "ABC" y 3,3'-diaminobencidina "DAB" kit sustrato para la tinción inmunohistoquímica fueron adquiridos de Vector Laboratories (Burlingame, CA).
inmunohistoquímica y doble immunohistofluorescence los análisis
los estudios inmunohistoquímicos en los niveles de expresión y localización celular de EGFR, Ser
473-pAkt, NF-kB p65 y MIC-1 proteínas en los tejidos de la próstata no malignas y malignas se llevaron a cabo en el tejido de la próstata microarrays hechos de fijado con formalina y tejidos embebidos en parafina adquirieron de Biomax Inc. (Rockville, Maryland, EE.UU.) como se describe anteriormente. Las muestras de tejido analizadas incluyen la PR954 diapositivas de microarrays de tejidos que contienen núcleos de duplicados de 36 casos de pacientes con adenocarcinoma de próstata primario (puntuaciones de Gleason: 6-10; estadios T2-T4) y los tejidos adyacentes no malignas emparejados correspondiente de los mismos pacientes, y PR483 diapositivas microarray de tejido que contiene un núcleo de 40 casos de pacientes con adenocarcinoma de próstata primario (puntuaciones de Gleason: 6-10; etapas T2-T4) y 8 tejidos normales de la próstata de la autopsia utilizados como controles. Además, la expresión de todos los biomarcadores también se analizó en los tejidos de metástasis óseas de 30 pacientes de PC (puntuaciones de Gleason: 6-10) (TriStar Technology Group, LLC, EE.UU.). La técnica utilizada para inmunohistotinción se ha descrito anteriormente [36], [38], [52]. Brevemente, las secciones de tejido se desparafinaron con EZ-desparafinar ™ (Bio Genex, San Ramon, CA) y rehidratada utilizando soluciones de etanol graduadas. Después de lavar los portas 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min, las secciones de tejido se sumergieron en solución de recuperación de antígeno de microondas que consiste en 0,01 M de tampón de citrato pH 6,0 y se sometieron a irradiación de microondas 3 veces durante 3 min. La inmunotinción no específica fue bloqueada en diluida Vectastain suero normal de caballo (Vector "ABC" kit) durante 10 min y a continuación, los portaobjetos se incubaron con primario anti-EGFR, -Ser
473-pAkt, subunidad de la proteína p65 -NF-kB o -MIC-1 anticuerpo en una cámara húmeda durante la noche a 4 ° C. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado universales para 30 min y vuelven a lavar con PBS. La actividad peroxidasa endógena se inactivó usando peróxido de hidrógeno 0,3% en methanol:PBS (1:01) durante 10 min. Después de un lavado adicional, las diapositivas se incubaron con solución Vectastain ABC durante 30 minutos. Las secciones de tejido se sumergieron en una solución de tinción que contiene 3,3'-diaminobencidina sustrato "DAB" como se indica en las instrucciones del fabricante y se enjuagó 3 veces en agua. Un precipitado de color marrón rojizo observado en las secciones de tejido indica una inmunorreactividad positiva con el anticuerpo primario a prueba. Las diapositivas se counterstained con hematoxilina, deshidratadas y montadas de forma permanente con los medios de montaje permanente vectamount (Vector Laboratories). Imágenes que fueron capturadas en una luz del microscopio Nikon Eclipse E400 (Nikon Corporation, Tokio, Japón) a diferentes aumentos son representativos de las muestras analizadas.
Para cada sección de tejido, la intensidad de la inmunorreactividad de EGFR, Ser
473-pAkt, NF-kB proteína p65 o MIC-1 fue semi-cuantitativamente calificado por un patólogo urológica (Dr. Johansson) en una escala del 0 al +3 (0 = sin manchas, 1+ = tinción semana, 2 + = moderada tinción, y 3 + = fuerte tinción). El porcentaje de células PC positivo para cada biomarcador analizado dentro de un núcleo de tejido dado también se puntuó en una escala de 1 a 4 (células PC positivas 1 = 0 a 25%, 2 = 26 a 50% de células positivas, 3 = 51 a 75% células positivas, y 4 = 76 a 100% de células positivas). La puntuación de la intensidad de la tinción y el porcentaje de células PC inmunorreactivas se multiplica para obtener una puntuación compuesta que va de 0 a 12. La intensidad de la tinción de diferentes proteínas de la prueba en las muestras de adenocarcinoma de próstata se anotó y en comparación con los tejidos normales de la próstata, y de la se consideró un valor mejorado si la intensidad de la tinción fue superior en uno o más puntos.
Además, se analiza la doble immunohistofluorescence de la co-localización de marcador de células madre similares a, antígeno CD133 (prominin-1) con EGFR fosforilado o su activados Tyr
1173p-EGFR forma fosforilada, Ser
473-pAkt, NF-kB p65 o MIC-1 también se llevaron a cabo en muestras de tejido prostático humano no malignas y malignas desparafinados y rehidratados de la pacientes obtenidos a partir de un banco de tejidos de UNMC como se informó anteriormente [52], [60]. Los portaobjetos de tejidos se bloquearon en presencia de suero de cabra al 10% durante 30 min seguido de la incubación con el anticuerpo anti-CD133 anticuerpo conjugado con ficoeritrina más anti-EGFR, anti-Tyr
1173-pEGFR, anti-Ser
473 -pAkt, anti-NF-
κ Francia B p65 o anti-MIC-1 anticuerpo durante 2 h. Los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS y se procesaron para la detección de inmunofluorescencia como se describe a continuación para los análisis microscópicos confocal de células fijadas.
Aislamiento de las fracciones de células SP y no SP y CD133
+ de células PC subpoblación de línea celular WPE1-NB26 tumorigénico e invasivo humana mediante citometría de flujo
Las células WPE1-NB26 parentales (1 × 10
6 células /ml) fueron teñidas con Hoechst tampón que contiene una concentración final de 2 mg /ml colorante fluorescente Hoechst a 37 ° C durante 2 h. Las pequeñas subpoblaciones de células SP y no SP se aislaron por células activadas por fluorescencia (FACS) tal como se describe anteriormente [52], [60], [61]. Los análisis y clasificación de la SP viable y fracciones de células no-SP se realizaron utilizando un FACS Aria citómetro de flujo con un software DIVA (Becton Dickinson Biosciences). Las fracciones de células SP y no SP se recogieron después de FACS y se obtuvo mediante el mantenimiento de las células en medio de cultivo de queratinocitos libre de suero el nivel de expresión del CD133 derivan marcador de células como sin más cambios aparentes fenotípicas y diferenciación en estas dos subpoblaciones de células cultivadas que contiene EGF exógeno (10 ng /ml) antes de su uso.
inmunotransferencia
análisis
Los SP y no SP lisados celulares se prepararon como [36], [38], [60 descrito previamente ]. Las concentraciones de proteína se estimaron mediante el uso de un kit de ensayo de proteínas con capacidad para un detergente de Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Las muestras correspondientes a 20 g de proteínas se resolvieron por electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida al 8 o 10% en condiciones reductoras. Las proteínas se transfirieron a una membrana de transferencia Immobilon-P y se bloquearon en leche seca no grasa al 5% en PBS durante 2 h y se sometieron al procedimiento de inmunodetección estándar. Al final de la incubación, la transferencia se lavó en TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM y 0,05% de Tween) y se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo secundario (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) durante 1 h . complejos antígeno-anticuerpo se visualizaron utilizando el kit de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences).
análisis de microscopía confocal
Las fracciones de células SP-SP y no a partir de la línea celular WPE1-NB26 se cultivaron a una baja la densidad de la cubierta se desliza esterilizada durante 24 h, se lavaron con PBS y se fijaron en metanol enfriado con hielo a -20 ° C durante 2 min [36], [38], [52]. Las células fueron bloqueadas en 10% de suero de cabra durante 30 min y se incubaron con anticuerpo monoclonal anti CD133-2 anticuerpo conjugado con ficoeritrina /(293C3), monoclonal de ratón anti-CD44 (HCAM, F-4) anticuerpo, anticuerpo policlonal de conejo anti-ABCG2 ( B-25), anticuerpo policlonal de conejo anti-EGFR (1105), policlonal de cabra anti-Tyr anticuerpo
1173-pEGFR (1173), monoclonal anticuerpo de conejo anti-pAkt (D9E), anticuerpo anti-NF-kappa B policlonal de conejo ( C-20), anticuerpo policlonal de conejo anti-MIC-1 anticuerpo o monoclonal de ratón anti-β-actina (clon AC-15) diluido en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS, las células fueron incubadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de cabra conjugado con anti-ratón, conjugado con FITC de burro anti-cabra y /o Texas cabra rojo-conjugado anti-conejo anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc ., West Grove, PA) durante 1 h. Además, las células SP tratados con diferentes agentes citotóxicos durante 4 días se tiñeron con MitoTracker Red CMXRos en la cámara humidificada a 37 ° C en la oscuridad durante 30 min antes de la fijación y la tinción de células SP con anticuerpo c anti-citocromo monoclonal de ratón durante 1 h, seguido de una incubación con anticuerpo de cabra conjugado con FITC anti-ratón de 1 h. Entonces, de las células PC se lavaron de nuevo con PBS, núcleos contrastados con diamino-2-fenilindol (DAPI) y montados en portaobjetos de vidrio en anti-fade Vestashield medio de montaje (Vector Laboratories, Burlingame, CA). La tinción de inmunofluorescencia se observó bajo un microscopio de barrido láser confocal (LSM 410, Zeiss, Göttingen, Alemania).
Prostasphere formador y ensayos de desintegración
Las fracciones de células SP y no SP aislado de la altamente masa celular WPE1-NB26 tumorigénico e invasiva se mantuvieron en medio de cultivo de queratinocitos libre de suero. La capacidad de auto-renovación de células SP
frente
la fracción de células no-SP aislado de la línea celular WPE1-NB26 altamente tumorigénicas e invasiva se estimó por su capacidad para formar los agregados no adherentes designados como prostaspheres en el suero -free condiciones de cultivo bajo placa de fijación ultra bajo (Corning, Invitrogen). Para los ensayos de formación de prostasphere-, 500 células SP o no SP viables obtenidos después de clasificación de células se suspendieron en medio libre de queratinocitos suero con o sin EGF exógeno (10 ng /ml) sobre una placa de fijación 6 pocillos ultra-bajo en ausencia o presencia de diferentes fármacos. Los fármacos probados incluyen un agente inhibidor específico de EGFR (gefitinib), PI3K (LY294002), pAkt (pAkt inhibidor VIII), NF-kB (partenolide) y MIC-1 (anti-MIC-1 anticuerpo), así como la quimioterapéutico actual docetaxel de drogas. Todas las muestras se sembraron por triplicado. Después de 7 días de incubación, los números de prostaspheres formados se contaron y las imágenes representativas de prostaspheres derivadas de células SP WPE1-NB26 fueron fotografiados utilizando Accu-scope microscopio de contraste de fases con un aumento de 200 ×.
Además, para los ensayos de desintegración, se cultivaron 500 células SP WPE1-NB26 viables en condiciones de cultivo libre de suero bajo una placa de fijación ultra-baja durante 7 días para la formación de prostaspheres y después se añadieron los fármacos ensayados a medio de cultivo y se incubaron durante 4 días adicionales. En el día 11, las imágenes representativas de prostaspheres desintegradas fueron fotografiados utilizando Accu-scope microscopio de contraste de fases con un aumento de 200 ×.
TUNEL ensayo
El terminal deoxynucleotidedyl transferasa dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) ensayo se realizó para detectar la fragmentación del ADN indicativo de la muerte celular apoptótica inducida por agentes citotóxicos analizadas en la subpoblación de células SP WPE1-NB26. Después del lavado de las células SP-WPE1 NB26 fijos con PBS, las células se incubaron en la mezcla de reacción TdT que consta de nucleótidos de etiquetado mezcla (TUNEL Label) contiene fluoresceína-dUTP y -dNTPs más la enzima TdT (Roche Diagnostics, IN) en la cámara humidificada a 37 ° C en la oscuridad durante 1 h. Las células SP se lavaron tres veces en PBS y se incubaron con un anticuerpo primario dirigido contra el fragmento escindido capsase-9 durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de una incubación con el anticuerpo secundario conjugado FTIC-para 1 h. Después de tres lavados con PBS, las células se contratiñeron con DAPI para tinción nuclear y se visualizaron por microscopía de fluorescencia confocal como se mencionó anteriormente.
Ensayos de viabilidad celular
Para los ensayos de viabilidad celular, la SP y la no-SP fracciones de células aisladas a partir de la línea celular WPE1-NB26 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3 x 10
4 células por pocillo en un volumen total de 200 l de suero libre de medio de cultivo de queratinocitos como se mencionó anteriormente [36] , [38], [52]. Después de 3 días, la SP y las células no SP WPE1-NB26 eran sin tratar o tratadas con diferentes concentraciones de fármacos probados incluyendo gefitinib, LY294002, pAkt inhibidor VIII, partenolide, anti-MIC-1 anticuerpo o docetaxel, solo o en combinación. Después de 72 horas de incubación, la viabilidad celular se estimó mediante un ensayo colorimétrico MTT.
análisis citofluorométrico Flow
células SP WPE1-NB26 se cultivaron a una densidad de 5 × 10
5 células en 25 cm
2 platos como se ha descrito anteriormente. Las células SP se trataron con diferentes concentraciones de fármacos probados, solos o en combinación con 5 nM docetaxel durante cuatro días. El efecto de apoptosis inducida por agentes probados en las células SP-NB26 WPE1 se estimó después de la tinción de ADN de cada muestra con el yoduro de propidio por FACS análisis como se describe anteriormente [36], [38], [52].
los análisis estadísticos
los análisis estadísticos se realizaron utilizando
t-test
para comparar los resultados con
P & lt
valores del estudiante; 0,05 indican diferencias estadísticamente significativas. Más específicamente, inmunohistoquímica datos fueron analizados utilizando Windows versión 9.6.4.0. software. Las puntuaciones compuestas de expresión de biomarcadores se consideraron como variables continuas y se compararon con dos colas de la t de Student suponiendo una varianza desigual para muestras independientes.
Resultados
análisis inmunohistoquímico de los niveles de expresión de EGFR, Ser
473-pAkt, NF-kB p65 y 1 entrada de micrófono elementos de señalización en las muestras de tejido de la próstata no malignas y malignas
Los resultados de los análisis inmunohistoquímicos han indicado una muy débil de la inmunotinción de EGFR indetectable, Ser
473-pAkt, NF-kB p65 y MIC-1 en tejidos prostáticos normales de biopsia y de los tejidos prostáticos no malignas adyacentes a partir de pacientes de PC (Figura 1). En contraste, se detectó una mayor expresión de todos estos biomarcadores en el 66-75% de los 76 casos de adenocarcinomas prostáticos (puntuaciones de Gleason = 6-10) analizaron
frente
tejidos normales de la próstata y se asocia con las etapas ( T2-T4) de la progresión de la enfermedad (Tabla 1). Más en particular, se detectaron un débil inmunotinción citoplasmática y la membrana de la proteína EGFR sólo en un pequeño número de basal y las células epiteliales prostáticas luminales en tejidos prostáticos no malignas, mientras que su expresión varió de moderado a fuerte en el citoplasma y en la membrana, respectivamente, en las células epiteliales malignas localizadas en los compartimentos intermedios y luminales en un subconjunto de muestras de adenocarcinoma de próstata primarios (Figura 1a). La intensidad de la tinción asociada con la expresión de la proteína EGFR se mejoró en 68% de los 76 casos de muestras de adenocarcinoma de próstata primarios analizados, en comparación con el tejido prostático normal a partir de la biopsia (Tabla 1). Por otra parte, el valor de la puntuación compuesta obtenida por la expresión de EGFR en muestras de PC (3,4 ± 0,4) fue significativamente superior al valor de los tejidos normales de la próstata (0,4 ± 0,2); * P & lt; 0,0001) (Figura 2a). Como se muestra en la Figura 1b y c, el Ser activado
473-pAkt forma fosforilada fue también sobreexpresa en 66% de los 76 casos de los adenocarcinomas prostáticos analizados y se detectó en el citoplasma en PC células epiteliales mientras que una mayor expresión de la subunidad p65 factor de transcripción NF-kB se produjo en el 75% de 76 casos de adenocarcinomas prostáticos y se detectó principalmente en el citoplasma y núcleos de las células epiteliales de PC. Los valores de las puntuaciones compuestas obtenidas por Ser
473-pAkt y NF-kB expresión de p65 en muestras de PC (3,3 ± 0,4 y 2,7 ± 0,3) se mejoraron significativamente en comparación con el valor de los tejidos normales de la próstata (0,3 ± 0,1 y 0,3 ± 0,2; p & lt; 0,0001), respectivamente (Figura 2b y c). Además, una inmunotinción positiva más fuerte también se observó para la proteína MIC-1 en el citoplasma y cerca de la membrana en las células epiteliales de PC así como para MIC-1 secretada en el estroma del tumor en 71% de los 76 casos de adenocarcinomas prostáticos en comparación con tejidos normales y adyacente no malignos de próstata analizadas (Figura 1D). El valor de la puntuación compuesta obtenida para MIC-1 de expresión en muestras de PC (. 3,7 ± 0,4) fue significativamente mayor en relación con el valor de los tejidos normales de la próstata (0,4 ± 0,3; * p & lt; 0,0001) (Figura 2d). Es importante destacar que, los resultados también han indicado que Ser
473-pAkt, NF-kB p65 y MIC-1 se co-expresó con EGFR en el mismo subconjunto correspondiente a aproximadamente 54 a 62% de muestras de tejido de PC analizados lo que sugiere que estos oncogénico todos los elementos de señalización pueden cooperar para promover la transformación maligna de las células epiteliales de PC durante la progresión de la enfermedad a un estado de enfermedad localmente avanzada (Tabla 1).
secciones de microarrays de muestras de tejido de la próstata no malignas y malignas se probaron con un anti -EGFR, -Ser
473-pAkt, -NF-kB p65 o anticuerpo -MIC-1 después de bloquear con suero. Todas las secciones se examinaron bajo un microscopio y la inmunorreactividad fue juzgado por tinción de color marrón oscuro. imágenes representativas de muestras de tejido teñidas de próstata normal, los tejidos adyacentes no malignas de tumor de próstata y adenocarcinoma de próstata obtenido de (a) EGFR, (b) Ser
473-pAkt, (c) p65 NF-kappa B y (d) MIC-1 se muestran a aumentos originales de × 100 y 400 ×. Las flechas indican la localización de las células basales en el epitelio normal y no maligno de la próstata y inmunoticción detectados para estos biomarcadores en muestra de tejido de adenocarcinoma prostático. Por otra parte, la inmunotinción positiva para detectar la proteína secretada MIC-1 en el compartimiento del estroma adyacente al tejido del tumor de próstata también se indica.
Los diagramas de caja que muestra los niveles de expresión de (a) EGFR, (b) Ser
473-pAkt, (c) p65 NF-kB y (d) MIC-1 durante la progresión del PC para estadios de la enfermedad metastásica. *,
P Hotel & lt; 0,0001, indica un aumento significativo entre los puntajes compuestos obtenidos para las muestras de metástasis de adenocarcinoma prostático PC y hueso con relación a los puntajes compuestos obtenidos de tejidos prostáticos normales
Es importante destacar que también se detectó una inmunotinción positiva que varía de moderado a fuerte, en el citoplasma y cerca de la membrana o en los núcleos para EGFR, Ser
473-pAkt, NF-kB p65 y MIC-1 en células PC en 80 -100% de los tejidos de metástasis ósea de 30 pacientes analizados PC (puntuaciones de Gleason = 6-10) (Figura 3, Tabla 1). Por otra parte, MIC-1 inmunotinción varió de muy débil se observó en el estroma de los tejidos metástasis óseas PC (Figura 3d) de intensidad moderada. Las puntuaciones compuestas obtenidos para la expresión de todos estos marcadores biológicos en los tejidos de metástasis ósea de pacientes de PC también eran superiores a los valores observados para los tejidos prostáticos normales y muestras de adenocarcinoma de próstata (Figura 2; * p & lt; 0,0001)
. secciones de microarrays de muestras de tejido metástasis óseas PC se probaron con anti-EGFR, -Ser
473-pAkt, -NF-kB p65 o -MIC 1-anticuerpo después de bloquear con suero. Todas las secciones se examinaron bajo un microscopio y la inmunorreactividad fue juzgado por tinción de color marrón oscuro. imágenes representativas de las muestras de tejido de hueso PC marcadas obtenidas por EGFR, Ser
473-pAkt, NF-kB p65 o MIC-1 se muestran las ampliaciones sean originales de × 100 × 400 y.
Doble microscopía immunohistofluorescence confocal análisis del nivel de expresión de la CD133 vástago marcador de células similar y su co-localización con EGFR, Ser
473-pAkt, elementos de señalización p65 NF-kappa B y MIC-1 en el tejido de próstata no malignos y malignos especímenes
Para obtener evidencia experimental de la implicación potencial de la expresión y /o aumento de la activación de EGFR, pAkt, p65 NF-kB y MIC-1 en la transformación maligna de CD133 tallo
+ adultos prostática /células progenitoras en CD133
células madre /progenitoras + PC, sino que también han caracterizado a la co-localización del marcador de células como CD133 tallo con estos elementos de señalización oncogénicas en los tejidos prostáticos no malignas y malignas de pacientes (Figura 4) .