Extracto
GIPC1 es una proteína citoplásmica de andamio que interactúa con numerosos complejos de señalización del receptor, y la evidencia emergente sugiere que juega un papel en la tumorigénesis. GIPC1 es altamente expresado en una serie de tumores malignos humanos, incluyendo cáncer de mama, de ovario, gástrico, y cáncer de páncreas. Supresión de GIPC1 en células de cáncer de páncreas humano inhibe
in vivo
en el crecimiento tumoral en ratones inmunodeficientes. Para comprender mejor la función GIPC1, suprimimos su expresión en mama humano y líneas celulares de cáncer colorrectal y de células epiteliales mamarias humanas (HMECs) y se ensayaron tanto la expresión del gen y el fenotipo celular. Supresión de GIPC1 promueve la apoptosis en las células MCF-7, MDA-MD231, RBSK-3, SW480, SW620 y células e impide la formación de colonias de anclaje independiente de HMECs. Estas observaciones indican GIPC1 juega un papel esencial en la transformación oncogénica, y su expresión es necesaria para la supervivencia de cáncer de mama humano y células de cáncer colorrectal. Además, una firma de genes knock-down GIPC1 se utilizó para interrogar de mama y de ovario a disposición del público datos de microarrays cáncer. Esta firma GIPC1 correlaciona estadísticamente con una serie de fenotipos de mama y cáncer de ovario y los resultados clínicos, incluyendo la supervivencia del paciente. Tomados en conjunto, estos datos indican que la inhibición GIPC1 puede representar una nueva diana para el desarrollo terapéutico para el tratamiento de los cánceres humanos
Visto:. Chittenden TW, Pak J, Rubio R, Cheng H, Holton K, Prendergast N, et al. (2010) Implicaciones terapéuticas de GIPC1 silenciamiento en el cáncer. PLoS ONE 5 (12): e15581. doi: 10.1371 /journal.pone.0015581
Editor: Pawel Michalak, Virginia Tech, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Octubre, 2010; Aceptado: 12 Noviembre 2010; Publicado: December 30, 2010
Derechos de Autor © 2010 Chittenden et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. TWC, AC, JQ, JP, RR, KH, NP, VG, YC, SB, MS, JCM, EAH, MA, y RS recibieron el apoyo de los fondos de la Iniciativa Estratégica Fondo Dana-Farber y la Fundación Claudia Adams Barr. J.Q. y J.C.M se apoya en parte por una subvención de la Biblioteca Nacional de Medicina (R01LM010129) de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
GIPC1, GIPC2 y GIPC3 comprenden la familia de genes GIPC humano, que se caracteriza por un único, dominio PDZ conservado y homología GIPC (GH1 y GH2) dominios [1]. GIPC1 es un andamio de proteínas involucradas en la expresión del receptor de la superficie celular, el tráfico intracelular y la transducción de señales. Anteriormente mostró GIPC1 juega un papel central en la señalización del factor de crecimiento fisiológica, regulación de células endoteliales, y la morfogénesis de ramificación arterial en ratones y pez cebra [2], [3]. Por otra parte, GIPC1 interactúa con y estabiliza la señalización del receptor importantes complejos, incluyendo tirosina quinasas de receptor TrkA y TrkB [4], [5], VEGF co-receptor neuropilina 1 [6], FGF co-receptor syndecan-4 [7], [ ,,,0],8], Frizzled-3 receptor [9], IGF-1 receptor [10], el receptor de tipo III de TGF-beta [11], y la endoglina [12]. Estas interacciones complejas de los receptores reflejan el papel GIPC1 juega como una proteína adaptadora, que une los procesos de reconocimiento de factor de crecimiento-apoyado múltiple para vías de señalización intracelular, que culmina en la regulación del ciclo celular entre otras funciones.
En el cáncer, se identificó como GIPC1 un antígeno inmunogénico sobre-expresado tanto en tumores de mama y de ovario [13], [14]. GIPC1 y GIPC2 ARNm se expresan en Okajima, TMK1, MKN45 y células de cáncer gástrico humano KATO-III, y en diversos tumores gástricos primarios [15], [16]. GIPC1 es altamente expresado en el adenocarcinoma de páncreas humano y juega un papel central a la estabilidad de IGF-1R en líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas [17], [18]. Más recientemente, la supresión GIPC1 en células de cáncer de páncreas humano ha demostrado inhibir
crecimiento tumoral in vivo de páncreas en ratones inmunodeficientes [19]. Sin embargo, el mecanismo por el cual GIPC1 promueve el crecimiento del cáncer no está bien establecido.
Para investigar el papel que desempeña GIPC1 en el cáncer, se utilizó RNAi para suprimir la expresión GIPC1 tanto en las células de cáncer de mama y de colon y las células epiteliales mamarias humanas (HMECs). Comenzamos nuestro estudio mediante el examen de las alteraciones en los patrones de expresión génica global después de la supresión GIPC1. Nuestro análisis indica que GIPC1 se requiere para la mama y la supervivencia de células de cáncer colorrectal y juega un papel esencial en la transformación oncogénica.
Resultados
silenciamiento GIPC1 y el gen patrón de expresión en células de cáncer de mama humano MDA-MB231
expresión génica GIPC1 fue derribado en células MDA-MB231 por transducción de ARN de horquilla corta (GIPC1 KD), junto con el vacío de vectores y los controles no transducidas. Después de la selección de puromicina, siete repeticiones biológica independiente de cada una de transducción se hicieron crecer en cultivo, se extrajo el ARN, y GIPC1 knock-down fue ensayada mediante qPCR. qPCR se encontró 85% de derribo en las células GIPC1 KD respecto a los controles no transducidas y vacío en vectores. RNAs de las piscinas independientes se hibridó a Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChips ™, los datos se normalizaron mediante robusta Array Multi-análisis [20] aplicado en la Bioconductor
affy
paquete, y el análisis exploratorio realizado con la agrupación jerárquica utilizando el paquete Bioconductor,
made4
[21]. Se observó un fuerte efecto biológico de GIPC1 silenciamiento (Figura S1). El análisis de la importancia microarrays (SAM; valor q = 0%). Se utilizó [22] para identificar probesets (3081) ~2271 genes con expresión alterada en las células GIPC1 KD en comparación con las células de control de vectores
Este lista de genes GIPC1 KD se comparó con las presentadas por Bild et al. [23], que analizó la sobreexpresión de oncogenes (cinco activado H-Ras, E2F3 humano, que se activa β-catenina, humano c-Myc, y c-Src humana) en HMECs primarias, utilizando
OrderedList
[ ,,,0],24]. Encontramos un solapamiento estadísticamente significativa de los genes expresados de forma anormal en el GIPC1 KD y los activados H-Ras de expresión de los genes listas (P«0.05, la figura S2).
Se utilizaron los 3081 probesets GIPC1 KD representan genes 2271 en un análisis funcional de enriquecimiento usando Expresión análisis sistemático Explorer (EASE) [25] y la facilidad anidado, el cual se aplica el análisis representacional EASE iterativa para identificar los términos hija GO que impulsan el significado de los términos de nivel superior (Chittenden
et al
., presentado). EASE utiliza la prueba exacta de Fisher para identificar las clases funcionales en conjuntos de genes que están sobre-representados en relación con los antecedentes de distribución de genes ensayados. Ocho de 67 sobrerrepresentados ontología de genes (GO) términos que se encuentran por EASE se muestran en la Tabla 1, entre los cuales son términos asociados con la proliferación celular, ciclo celular, la detención del ciclo celular, apoptosis, migración celular y la degradación de proteínas mediada por ubiquitina.
EASE anidada (nease) es una extensión de EASE que utiliza un segundo, sub-nivel, la prueba exacta de Fisher iterativo para encontrar GO subclases que impulsan la selección EASE plazo. Los resultados, mostrados en la Tabla 2, incluyen 17 subclases funcionales estadísticamente enriquecidas de procesos celulares que han encontrado los EASE. nease encontró que la EASE-IR significativa clases de procesos biológicos,
la proliferación celular,
modificación de proteínas
,
la mitosis,
de crecimiento celular y /o mantenimiento
,
organización del citoesqueleto y la biogénesis
, y
¿Cuáles son los procesos fisiológicos conducido colectivamente por los procesos biológicos
adhesión celular y mediada por la integrina señalización
. Del mismo modo, término EASE-significativa
organización citoplasma y la biogénesis
fue encontrado por nease a ser impulsado en parte por
citocinesis después de la mitosis
. nease encontró
apoptosis
significativo debido a GO términos asociados con
regulación de los filamentos de actina y la
JAK-STAT cascada de señalización
. La expresión alterada se encuentra en los genes implicados en ambos
migración celular y
el metabolismo; modificaciones en
actividad ligasa de ubiquitina-proteína
se deben a alteraciones en la unión a proteínas. nease también indica que GIPC1 KD altera la expresión de genes en el EGF, TGF, y las vías de señalización del receptor de Wnt.
En conjunto, estos datos sugieren que GIPC1 está implicado en la proliferación celular, la apoptosis, la motilidad celular y la adhesión y la degradación de proteínas mediada por ubiquitina. Estos datos sugieren que GIPC1 juega un papel amplio más allá de su temprana asociación con la regulación vascular y que puede, en el cáncer, estar involucrado en los procesos asociados con el control del ciclo por células.
silenciamiento GIPC1 inhibe la proliferación de MDA-MB231 y induce la apoptosis
Debido a GIPC1 KD afecta a los procesos vinculados con el crecimiento celular, se evaluó los efectos del agotamiento GIPC1 sobre la proliferación de células MDA-MB231. Se determinó la viabilidad celular después de la depleción GIPC1 por ambos ensayos resazurina y de reducción de tetrazolio MTS en las células experimentales y de control. En ambos casos, GIPC1 silenciamiento provoca una reducción significativa en la viabilidad celular a las 48 horas después de la siembra (Figura 1A y 1D). Desde GIPC1 interactúa con neuropilina 1 [6], las células se trataron con VEGFA (10 ng /ml) para determinar si la pérdida de viabilidad celular causado por la supresión GIPC1 podría ser superado por un mitógeno relevante. tratamiento VEGFA no es suficiente para evitar que un 40% y 60% de reducción aproximada de la viabilidad celular en las células GIPC1 KD a las 48 y 72 horas, respectivamente (Figura 1D).
A. Evaluación de la viabilidad celular (azul) y la caspasa 3/7 actividad (rosa) a los 0, 24, 48 y 72 horas. Las líneas continuas con las cajas azules (no transducidas) y los diamantes azules (no objetivo) y una línea discontinua con triángulos azules (GIPC1 KD) indican la viabilidad celular. Pink denota la caspasa 3/7 actividad. B. caspasa 3/7 Normalized actividad. Total de la actividad de caspasa 3/7 se normalizó a la viabilidad celular y se evaluó a las 0, 24, 48, y 72 horas. Normalización indica un aumento de 2,1 veces en la actividad de la caspasa 3/7 en células GIPC1 KD comparación con las células no objetivo a las 72 horas. ensayo de túnel C. la fragmentación de ADN se evaluó como% de control positivo. GIPC1 KD se correlaciona con un aumento de 11,24 veces en la apoptosis (GIPC1 /no objetivo; P & lt; 0,05). D. Evaluación de la proliferación celular después de VEGF (10 ng /ml) de inducción. La proliferación se evaluó a 0, 24, 48, y 72 horas. Los días 1, 2 y 3 se normalizaron a día 0. Las líneas continuas con las cajas azules (no transducidas) y los diamantes azules (no objetivo) y una línea discontinua con triángulos azules (KD) GIPC1 indicar la proliferación celular en medio de inanición. Pink denota la inducción de VEGF. D. Evaluación de PARP1 escindido. PARP1, se escindió PARP1, GIPC1, y la expresión de GAPDH fue evaluada por Western blot en células de cáncer de mama humano MDA-MB231. Los datos se presentan como medias ± SEM. Los asteriscos indican la significación estadística (P £ 0,05) entre especies no objetivo y las condiciones GIPC1 KD.
GIPC1 KD también influye en la apoptosis. Para determinar los efectos de silenciamiento GIPC1 sobre la actividad de la caspasa 3/7, el ensayo de reducción de resazurina fluorométrico muestra en la Figura 1A se multiplexa con un ensayo homogéneo Apo-ONE caspasa-3/7. Cuando la caspasa 3/7 actividades están normalizados a valores de viabilidad celular, se detectó un aumento significativo en la actividad de caspasa 3/7 en células GIPC1 KD cuando se compara con el control de líneas de células a las 72 horas (Figura 1B). Encontramos pérdidas similares de la viabilidad celular y el aumento de la caspasa 3/7 actividades después de GIPC1 silenciar en el cáncer de MCF-7 y SKBR-3 de mama humano y las líneas colorrectal humano SW480 y SW620 celulares de cáncer (datos no mostrados).
para determinar si el aumento de la actividad de la caspasa 3/7 encuentra en las células MDA-MB231 se asocia con la fragmentación del ADN, se realizó un ensayo de TUNEL colorimétrico DeadEnd (Figura 1C). GIPC1 orientación induce la fragmentación del ADN; evaluado como una proporción con respecto al control de las células, la proporción relativa de células apoptóticas (GIPC1 KD /no diana) es 11,24 (P & lt; 0,05). Por otra parte, el aumento tanto de la caspasa 3/7 actividad y la fragmentación del ADN en las células silenciadas-GIPC1 se asocian con un aumento de la expresión de PARP1 escindido (Figura 1D). Estos datos son consistentes con los hallazgos de microarrays (Tablas 1 y 2), que indican GIPC1 silenciamiento inhibe la proliferación celular y promueve la apoptosis.
silenciamiento GIPC1 induce MDA-MB231-G2 del ciclo celular detención
Microarray resultados implicados los efectos del ciclo celular de GIPC1 KD. Se realizó un solo canal análisis FACS de las células GIPC1 kD y los controles asociados para explorar el ciclo celular en células control y GIPC1 KD. supresión GIPC1 promueve la detención en G2 profunda en el día 14 posterior a la selección de los transfectantes puromicina GIPC1 shRNA (Figura 2A) y sutil G1. Estos datos indican una acumulación de células en tanto G1 (43,70% ± 1,86% de células en comparación con 38,58% ± 0,21%) y G2 (46,33% ± 1,29% vs. 27,70% ± 0,67%) fases del ciclo celular en comparación con GIPC1 KD control de las células no objetivo. GIPC1 células KD continúan para atravesar la fase S en contra de la detención en G2 prominente (9,98% ± 0,57% frente al 33,73% ± 0,53%). GIPC1 desmontables también resulta en una acumulación significativa de células en un pico de ADN 8N (9,74% ± 0,67% vs. 0%) y en los restos celulares (sub-G1; 5,52% ± 0,54% vs. 1,57% ± 0,17%). Junto con los resultados de microarrays presentados en las Tablas 1 y 2, y en comparación con controles adecuados, estos datos sugieren la supresión GIPC1 promueve la detención de la división celular y la apoptosis.
A. canal único análisis FACS de no transducidas no diana, y las células GIPC1 KD 14 días después de la transducción. Grey es% de las células en G1. El amarillo indica% de las células en la fase S. Naranja es igual a% de las células en G2. El azul es% de células en 8N. D indica restos%. El análisis de transferencia Western de B. CDC25B, GIPC1, y la División de Género 45 α /γ expresión en la no transducidas no diana, y las células GIPC1 KD. Los datos se presentan como medias ± SEM. Los asteriscos indican la significación estadística (P £ 0,05) entre no diana y GIPC1 KD condiciones.
Para determinar las causas del ciclo celular anormal encontrado con supresión GIPC1, se utilizó Western Blot para evaluar la expresión de proteínas de la conocida reguladores punto de control del ciclo celular encontrados expresados diferencialmente en el análisis de microarrays. GIPC1 silenciamiento induce una pérdida de CDC25B y un aumento en la expresión GADD45α /proteína γ (Figura 2B). CDC25B se requiere para la activación de CDK1 y la entrada en mitosis; mientras que, la expresión de los miembros de la familia de proteínas GADD45 se incrementó después de la detención del crecimiento y daño en el ADN. Estos hallazgos apoyan tanto el microarray (Tablas 1 y 2) y FACS (Figura 2A) resultados que indican que la supresión GIPC1 promueve predominantemente detención en G2.
supresión GIPC1 altera la adhesión celular y la motilidad
hallazgos sugieren Microarray GIPC1 está implicada en la adhesión y la motilidad (Tablas 1 y 2). Se evaluaron los efectos de silenciamiento GIPC1 sobre la motilidad celular y la adhesión de las células experimentales y de control MDA-MB231. GIPC1 silenciamiento mejora de forma significativa la adhesión de células MDA-MB231 tanto a los 30 y 60 minutos después de la siembra (Figura S3 A). Se utilizó un ensayo cero (herida) para evaluar los efectos de GIPC1 KD sobre la motilidad celular. supresión GIPC1 disminuyó significativamente la migración de células MDA-MB231, ya sea con o sin ocho horas de la inducción del factor de crecimiento (Figura S3B). hallazgos indican Microarray supresión GIPC1 se asocia con un enriquecimiento de genes expresados anormalmente dentro de la, proteína RHO mediada por la integrina, JAK-STAT, EGF, Ras, TGF y vías de Wnt (Tabla 2 y Figura S2). Estas vías, que se encuentran por primera vez en nuestro análisis bioinformática, regulan tanto la adhesión celular y la migración y son candidatos para una mayor investigación. Experimentalmente, GIPC1 agotamiento de los resultados en la adhesión celular mejorada y reducción de la motilidad celular. resultados de agotamiento GIPC1 en la pérdida de EGF, FGF2, PDGF-BB, TGFß1, y VEGFA la motilidad celular inducida (Figura S3 B). Estos datos sugieren que GIPC1 juega un papel en una serie de importantes vías de transducción de señales que inciden tanto en la adhesión celular y la motilidad.
GIPC1 se requiere para la formación de colonias de anclaje independiente de la línea celular tHMEC-LT-st
para evaluar si se requiere GIPC1 para la transformación oncogénica, suprimimos su expresión en HMECs hTERT-inmortalizado transformadas con SV40 T grande (LT) y antígenos Pequeño T (ST) (tHMEC-LT-st) [26]. células tHMEC-LT-st son capaces de crecimiento independiente de anclaje; sin embargo, GIPC1 agotamiento reduce significativamente la eficiencia de la formación de colonias independiente del anclaje de la línea celular tHMEC-LT-st en comparación con las células control. Como un control adicional, se usó un segundo constructo GIPC1 shRNA en esta serie de experimentos (Figura 3A). Estos datos indican que GIPC1 se requiere para la formación de colonias independiente del anclaje, una medida de la transformación oncogénica de las células HMEC.
A. la formación de colonias en agar blando en nontransduced no diana, y las células células GIPC1 KD tHMEC-LT-St. B. Western Blot que indica la effectivness de GIPC1 silenciar con dos independientes contructs GIPC1 shRNA: NM_005716.2-1083s1c1 y NM_005716.2-499s1c1. Los datos se presentan como medias ± SEM. Los asteriscos indican la significación estadística (P £ 0,05) entre especies no objetivo y las condiciones GIPC1 KD.
relevancia clínica de los genes regulados por GIPC1 knock-down
A fin de evaluar la hipótesis de que GIPC1 desempeña un papel importante en el desarrollo y la progresión de los cánceres humanos, 411 probesets con un factor de cambio ≥2 en el análisis de SAM de GIPC1 agotan las células MDA-MB231 en comparación con las células control (GIPC1 firma; Tabla S1) se utiliza para interrogar a dos disponibles públicamente y clínicamente anotado de mama y de ovario cáncer conjuntos de datos con el paquete Bioconductor,
globaltest
[27]. Una gran cáncer de mama conjunto de datos de microarrays de ADN fusionada con 689 muestras de pretratamiento [28], [29], [30] y un conjunto de datos de cáncer de ovario con 274 pacientes tratados [31] se utilizaron para el análisis. En el análisis multivariado prueba global de los 689 pacientes con cáncer de mama, la firma GIPC1 KD se asocia con el grado del tumor (P & lt; 0,01), los ganglios linfáticos (P & lt; 0,0001), y la condición de ER (P & lt; 0,05). La firma GIPC1 también se asocia fuertemente la supervivencia del paciente dentro de la ErbB2 + /ER + (n = 42, P & lt; 0,001), luminal B (n = 146, P & lt; 0,05) y basal (n = 92, P & lt; 0,01) subtipos de cáncer de mama molecular (Tabla 3). El análisis del conjunto de datos de cáncer de ovario indica que la firma GIPC1 se asocia significativamente con todas las variables clínicas evaluadas; incluyendo la supervivencia del paciente y el estadio tumoral, grado y tipo (Tabla 3). Estos datos apoyan los informes recientes que sugieren que GIPC1 juega un papel en la etiología de mama humano y el cáncer de ovario y la progresión [13], [14].
Discusión
Poco se sabe sobre el papel de GIPC1 en el crecimiento del tumor y la progresión. La evidencia indica que es altamente expresado en una serie de tumores malignos humanos, incluyendo cáncer de mama, de ovario, gástrico, y cáncer de páncreas [13], [14]. Por otra parte, muestra GIPC1 se requiere un informe reciente de
crecimiento tumoral in vivo de páncreas en ratones inmunodeficientes [19]. En este estudio, hemos utilizado dos enfoques experimentales y computacionales para examinar GIPC1 de mama humano y células de cáncer colorrectal, y en pacientes con cáncer de mama y de ovario. Hemos encontrado que se requiere para GIPC1 mama y la supervivencia de células de cáncer colorrectal, y desempeña un papel esencial en la transformación oncogénica de las células epiteliales mamarias humanas.
Nuestros datos muestran también GIPC1 juega un papel importante en la regulación del ciclo celular. EASE análisis de GIPC1 caída en las células MDA-MB231 muestra el enriquecimiento de los genes expresados diferencialmente con funciones comentadas en G1 /S y G2 /M, transiciones detención del ciclo celular, la proliferación celular y la apoptosis. nease busca explicaciones biológicas de estos efectos principales e implica alteraciones potenciales en la adhesión celular, la señalización mediada por integrinas, y la regulación del citoesqueleto de actina. Además, nease encontró un enriquecimiento de genes implicados en la citocinesis. Este hallazgo está de acuerdo con un informe reciente indica que se requiere la activación de syndecan-4 (SDC4), una transmembrana proteoglicanos heparán sulfato que interactúa con GIPC1 y el receptor de FGFR1 para regular la señalización de FGF2, para la citocinesis de MCF-7 células de cáncer de mama humano [32]. Keller-Pinter
et al
. mostró que serine179-fosforilación y ectodominio derramamiento de SDC4 es máxima en G2 /M. Expresión de mutantes de ingeniería que imitan serina 179-fosforilación (Ser179Glu) o SDC4 fosforilación resistente causó abscisión y el gigante incompleta, células multinucleadas [32]. Además, SDC4 regula la polimerización de actina, la formación de adhesión focal, y la motilidad celular a través de la señalización de PI3K
El análisis también sugiere que nease GIPC1 participa en seis de las principales redes de transducción de señales en el cáncer de mama:., Proteína RHO mediada por la integrina, JAK-STAT, EGF, TGF y WNT. Estos hallazgos apoyan informes anteriores que indican que GIPC1 interactúa con el receptor Frizzled-3 [9], el receptor de tipo III de TGF-beta [11], y la endoglina [12]. A pesar de que nuestro análisis no sugiere un enriquecimiento de genes dentro de la red de transducción de señales de PI3K, encontramos que la supresión GIPC1 disminuye la expresión de un número de genes clave implicados en la ruta, incluyendo
SDC2, PIK3CB, PIK3D, PDK1, Akt3, CDC42BPA, CDC42EP3, RACGAP1, España y
RAC1
. Por el contrario, promueve GIPC1 silenciamiento elevaciones significativas en la expresión de genes de
PTEN, p27
Kip1, RHOBTB1, RHOB, España y
PAK2
. Si bien la activación aberrante de la señalización de PI3K está involucrada en la inducción de la transformación oncogénica, estos genes funcionan en concierto para integrar mecanismos que controlan una serie de procesos celulares, incluyendo la regulación del citoesqueleto, la motilidad celular y la adhesión, la proliferación celular y la apoptosis [26], [ ,,,0],33].
validación experimental de la expresión de genes de perfiles resultados indica que GIPC1 silenciamiento promueve la detención G2 del ciclo celular, apoptosis, y alternancias en la adhesión celular y la motilidad en células de cáncer de mama humano MDA-MB231. GIPC1 agotamiento se correlaciona con aumento de la actividad de la caspasa 3/7, la fragmentación del ADN, la regulación positiva de miembros de la familia GADD45, y la pérdida de la expresión de CDC25B. Por otra parte, GIPC1 silenciamiento se correlaciona con marcadas reducciones en la viabilidad celular y evaluaciones en la caspasa 3/7 actividades en células de cáncer colorrectal humano SKBR-3 de cáncer de mama humano MCF-7 y SW480 y SW620 y.
Mediante el uso de RNAi para agotar GIPC1 mRNA en células MDA-MB-231 que fueron capaces de identificar una amplia gama de genes cuya expresión se modificó. Se comparó esta firma GIPC1 a disposición de mama y de ovario de expresión génica del cáncer de conjuntos de datos para los que bien anotado fenotipo de datos y de resultado fueron públicamente disponibles. Encontramos una fuerte correlación entre la firma GIPC1 y una serie de variables clínicas importantes de pacientes.
En el cáncer de mama, se utilizó la metodología de prueba global y encontramos la supervivencia libre de recurrencia se asoció significativamente con la firma GIPC1 sólo dentro de los subtipos moleculares específicos de la enfermedad: los pacientes con luminal B tumores ER + (ER alto grado +; p = 0,015), erbB2 + /ER + enfermedad (P = 4,3 × 10
-4), y los cánceres quizá de tipo basal o triple negativo (P = 0,0074). Dentro luminal A ER + (bajo grado ER +) de los casos y los pacientes con cánceres de ErbB2 + /ER, la firma GIPC1 no fue predictivo de la supervivencia libre de recurrencia. Por lo tanto, la firma GIPC1 puede ser capaz de distinguir los resultados del paciente dentro de los grupos de los cánceres de mama de alto grado, en particular los que son ER +, y no simplemente para distinguir el grado del tumor (alta versus baja) o la condición de ER (positivo frente a negativo). En el conjunto de datos de cáncer de ovario, la firma GIPC1 está estadísticamente correlacionada con todas las variables clínicas evaluadas: la supervivencia global y el grado del tumor, el tipo y etapa. Una característica común de las correlaciones encontradas entre la firma GIPC1 y los parámetros clínicos en cáncer de mama y cáncer de ovario era una asociación con tumores de alto grado que se caracterizan por daño en el ADN excesiva y mal pronóstico del paciente.
La expresión de datos disponibles indican que GIPC1 es altamente expresado en el cáncer humano y cada nuestros resultados sugieren GIPC1 es un componente necesario para el crecimiento del cáncer humano promovida por factores de crecimiento y sus receptores de aguas arriba. Debido a que la transducción de señales GIPC1 es activado por una amplia gama de receptores de superficie celular y, ya que también se sabe que es esencial para la morfogénesis de ramificación de vasos sanguíneos arteriales, la orientación vías GIPC1 mediada es una estrategia terapéutica lógica para el tratamiento de cánceres humanos. En particular, nuestros datos sugieren apuntando GIPC1 puede ser particularmente importante para los cánceres de mama de alto grado del receptor de estrógeno positivo.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
El MCF-7 , MDA-MB231, y RBSK-3 líneas celulares de cáncer de mama humano y el SW480 y SW620 líneas celulares de cáncer colorrectal humano se adquirieron de ATCC. células epiteliales mamarias humanas (HMECs) se adquirieron de Invitrogen (# A-10565). HMEC experimentos se realizaron primarias paso ≤ 10.
hTERT
-immortalized HMECs que expresan SV40 LT y st se cultivaron como se ha descrito anteriormente [26]. Todas las líneas celulares se cultivaron en placas de cultivo tisular de 100 × 20 mm (Becton Dickinson#353803). Células MCF-7 se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2 en EMEM (GIBCO#11095-080) suplementado con inactivado por calor 10% de suero bovino fetal (ATCC#30-2020) y 1% de antibiótico-Antimyotic (Invitrogen#15240-062). células MDA-MB231 se cultivaron a 37 ° C y 0% de CO
2 en L-15 de Leibovitz medios (Gibco#11415-064) suplementado con 10% de FBS y 1% de antibiótico-Antimyotic. SKBR-3 células se cultivaron a 37ºC y 5% de CO
2 en medios de McCoy 5A (GIBCO#12330-031) suplementado con 10% de FBS y 1% de antibiótico-Antimyotic. células SW480 y SW620 se cultivaron a 37 ° C y 0% de CO
2 en L 15-media de Leibovitz suplementado con 10% de SFB y el 1% de antibiótico-Antimyotic. HMECs primarios se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2 en Medio 171PRF (libre de rojo fenol) (GIBCO#M-171PRF-500) suplementado con suplemento de crecimiento epitelial mamaria (el MEGS) (Gibco#S-015- 5) y 1% de antibiótico-Antimyotic. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 60-70% de confluencia.
shRNA vector lentiviral producción y la transducción
GIPC1 (NM_005716.2-1083s1c1 y NM_005716.2-499s1c1) y plásmidos vectores shRNA vacías como así como se obtuvieron los plásmidos Delta 8.9 y VSVG del Fondo para el ARNi en el Instituto de cáncer Dana-Farber. Una, que no son objeto shRNA plásmido revueltos fue la compra de Sigma (# SHC002). versiones de ADNc de SV40 LT + st (LTG) fueron clonados en pWZL-explosión como se describe anteriormente [26]. Todos los plásmidos se cultivaron en caldo LB 100 mg /l de ampicilina (Teknova#L8105). Los plásmidos se purificaron usando el kit Qiagen Maxi HiSpeed plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen#12663), y los rendimientos se evaluaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific#SID-10135606). HEK 293T /17 células (ATCC nº CRL-11268) se expandieron a una densidad de 5 × 10
6/100 mm placa de cultivo celular (BD Primaria#353803) en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (ATCC#30-2002) + 10% inactivado por calor suero fetal bovino (ATCC#30-2020) y se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2 para 24 horas. A continuación, cada placa se transfectaron con Fugene 6 reactivo de transfección (Roche#11814443001), plásmido purificado VSVG, Delta 8.9 plásmido purificado, y, o bien 6 g de plásmido purificado shRNA o 4 g de purificado LTG
plásmido BM en los medios de comunicación OptiMem (Invitrogen#11058-021). El medio se cambió un día después de la transfección con los medios FBS DMEM + 10% que contiene 1% de antibiótico-Antimyotic (Invitrogen#15240-062). Los medios que contienen el virus empaquetado se recogieron en el día 2 después de la transfección, se añadió medio fresco, y la cosecha viral se recogió de nuevo el día 3 después de la transfección. El lentivirus empaquetado se filtró con 0,45 micras filtros (Corning#431220) y se concentró durante 90 minutos a 16.600 g utilizando una ultracentrífuga (Beckman#L8-70M). Después de la resuspensión, el lentivirus se tituló utilizando el QuickTiter Lentivirus cuantificación Kit (Cell Biolabs#VPK-108-VIH) según las instrucciones del fabricante. Para lentiviral shRNA transducción de vector, medio de cultivo conteniendo polibreno y un volumen de lentivirus que equipara a una MOI de 50, se añadió a las células y se incubaron durante la noche en condiciones de cultivo específica de línea celular. Al día siguiente, los medios de comunicación virus se reemplazó con medio de crecimiento específico de la línea celular. A las 72 horas, el medio de crecimiento se complementó con ya sea 10 mg /ml de puromicina y /o 2,5 mg /ml de blasticidina. Los experimentos se realizaron 14 días después de la selección.
aislamiento de ARN, la hibridación de microarrays y el procesamiento, y PCR cuantitativa
ARN total fue aislado de las líneas celulares utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen#74106) de acuerdo con las especificaciones del fabricante con columnas QIAshredder (Qiagen#79656) para la homogeneización sedimento celular. El ARN total se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific#SID-10135606). Veintiún Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays se utilizaron para este estudio. Siete conjuntos por grupo fueron utilizados para las siguientes líneas MDA-MB231 células: no transducidas, vector vacío, y GIPC1 KD. hibridación y procesamiento de microarrays se llevó a cabo utilizando protocolos estándar en la Instalación de microarrays Core en el Instituto de Cáncer Dana-Farber. Procesamiento de las muestras se realizó con un Fluidics Station FS450 Affymetrix GeneChip y matrices fueron escaneados con un escáner de matriz GCS300 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. De dos pasos cuantitativa en tiempo real PCR se realizó con un sistema de Applied Biosystems 7900HT (Applied Biosystems#4329001). TaqMan GIPC1 (Applied Biosystems#Hs00991802_m1) y 18S endógeno de control (Applied Biosystems#4304437) Los ensayos se realizaron a 8 réplicas por muestra usando la cuantificación relativa (Delta Ct), FAM no hay ajustes de amortiguación. Delta Cts se calcula restando la media de Ct de los controles endógenos de la Ct promedio de la diana de amplificación. El delta-delta Ct se calcula restando el delta Ct promedio de las muestras vector vacío desde el delta Ct medio de las muestras de vectores objetivo. cambio veces se calculó como 2 a la potencia de la delta-delta Ct.
normalización de datos de microarrays y el análisis
Los datos en bruto (Cel archivos) se importaron en R y los datos se normalizaron con RMA [ ,,,0],20] utilizando el paquete Bioconductor,
affy
. El análisis exploratorio de datos inicial se realizó con análisis de agrupamiento jerárquico (media-vinculación y métrica 1 - correlación de Pearson coeficiente de distancia) utilizando el paquete Bioconductor,
made4
[21]. Dos clases Importancia de Análisis de Microarrays no apareado (SAM;. [22] con una tasa de falso descubrimiento 0% (q-valor) se utilizó para determinar la expresión diferencial de genes entre el control del vector vacío y células GIPC1 KD MDA-MB231