Extracto
El objetivo de este estudio fue explorar los marcadores moleculares específicos que podrían conducir a nuevos conocimientos sobre la identificación de tratamientos innovadores. Se identificó el papel de DNMT3b y su poder predictivo en el pronóstico del cáncer oral. Se seleccionaron líneas celulares de cáncer oral humana, incluyendo SCC4 y SCC25 para experimentos celulares. Se investigaron los cambios en el crecimiento del tumor, la agresividad y la vía de señalización responsables
in vitro
y
in vivo
. Además, 125 muestras de tejido de cáncer orales se analizaron mediante tinción inmunohistoquímica en las diapositivas de microarrays de tejidos, y las correlaciones calculadas entre el nivel de DNMT3b y el resultado clínico de los pacientes. Nuestros datos revelaron que la inhibición de DNMT3b resultó en el crecimiento del tumor más lento, la capacidad de invasión tumoral y atenuada transición epitelio mesénquima, como se determina por
vitro
en y
in vivo
experimentos. Activada la señalización de IL-6 podría ser responsable de la inducción de la sobreexpresión DNMT3b sobre el cáncer oral. En cuanto a los datos clínicos, la incidencia de DNMT3b inmunoreactividad en las muestras de cáncer oral fue significativamente mayor que en el epitelio no maligno, y positivamente vinculada a la expresión de IL-6. Además, la expresión de DNMT3b se asoció significativamente con el riesgo de compromiso de los ganglios linfáticos, la recurrencia de la enfermedad y una menor supervivencia en pacientes con estadio patológico III-IV de cáncer oral. En conclusión, la IL-6 ejes -DNMT3b podrían ser utilizados para predecir el pronóstico de cáncer oral en las clínicas, y la orientación DNMT3b podría representar una estrategia de tratamiento prometedor
Visto:. Chen WC, Chen MF, Lin PY (2014 ) Importancia de DNMT3b en el cáncer oral. PLoS ONE 9 (3): e89956. doi: 10.1371 /journal.pone.0089956
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 30 Octubre, 2013; Aceptado: 24 Enero 2014; Publicado: 13 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue el apoyo de Memorial hospital Chang Gung, Taiwán, conceder CMRPG6A0222-3. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los cánceres más frecuentemente oral son carcinomas orales de células escamosas (COCE), que son los tumores más malignos de cabeza y cuello. Esta neoplasia epitelial agresiva está asociada con morbilidad severa. quimiorradioterapia (CCRT) resultados postoperatorios en un mejor control locorregional y la supervivencia de pacientes con cáncer de cabeza y cuello localmente avanzados con factores de alto riesgo [1]. Pese a los considerables avances en el tratamiento, 40-50% de los pacientes con recaída de la enfermedad localmente avanzado con progresión de la enfermedad local o distante [2]. La investigación de marcadores moleculares específicos relacionados con el desequilibrio entre la muerte y la proliferación celular, la capacidad de invasión de los tejidos y la sensibilidad del tratamiento, podría proporcionar nuevas perspectivas para la identificación de tratamientos innovadores.
CCCA es una enfermedad multifactorial, que es principalmente asociada con el tabaco crónica, el alcohol y el uso de nuez de betel [3]. La predisposición genética también se ha implicado en la tumorigénesis oral, y múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas están implicados en el crecimiento del cáncer [4]. la metilación del ADN aberrante juega un papel clave en la carcinogénesis, lo que lleva al silenciamiento epigenético de genes supresores de tumores implicados en la regulación del ciclo celular, la apoptosis y la reparación del ADN [5], [6]. la hipermetilación del ADN se produce con frecuencia en los tejidos precancerosos y el cáncer [7]. En COCE, p14, p16, MGMT, DAP-cinasa y E-cadherina eran frecuentes y los estudios ampliamente genes metilados [8] - [12]. La metilación del ADN es generalmente mediada por ADN metiltransferasas (Dnmt) y en los genomas de mamíferos existen tres genes Dnmt; DNMT3a y DNMT3b son responsables de la metilación de novo y modifican el ADN no metilado, y DNMT1 se piensa que es responsable del mantenimiento de los patrones de metilación [13] - [15]. DNMT3b ha informado para participar en la carcinogénesis de varios tipos de cáncer, incluyendo esofágico, gástrico y cáncer de pulmón [16] - [18], pero el papel de DNMT3b en OSCC requiere más investigación. Hemos informado anteriormente de que se activa la señalización de IL-6 se asocia con el comportamiento agresivo del tumor en el cáncer oral [19]. En las células de cáncer oral, se informó de IL-6 para promover la tumorigénesis por alterinig la metilación del ADN [20]. De acuerdo con ello, se analizó la expresión de DNMT3b en COCE y su vinculación con la señalización de IL-6 en el presente estudio. También se investigó el papel de DNMT3b en COCE
in vitro
y
in vivo
, y la correlación con los resultados clínicos de los pacientes con COCE mediante el análisis de tinción inmunoquímica.
Materiales Métodos y
las muestras de tejido y las características de los pacientes
la Junta de Revisión Institucional (IRB) de Chang Gung Memorial hospital aprobó el presente estudio (Número de Permiso: 98-3546B). Los consentimientos escritos fueron firmados por los pacientes para su muestra y la información que se almacenan en el hospital y se utilizan para la investigación. El procedimiento de consentimiento fue aprobado por el IRB. Las muestras se recogieron de forma retrospectiva de los pacientes diagnosticados con COCE localmente avanzado que recibieron tratamiento curativo, y construidos en microarrays de tejidos (TMA) bloquea para el análisis de inmunoquímica. En el estudio, TMA bloques fueron consistieron en 125 casos CCCA con estadio III-IV patológica (bucal, n = 48; gingival, n = 24; labio, n = 10; lengua, n = 35; paladar, n = 8) por AutoTiss 1000 (siempre biotecnología, Canadá). Cuando se dispone de bloques, hematoxilina y eosina diapositivas fueron re-evaluados por un patólogo para evaluar la calidad de TMA diapositivas. Los datos relativos al diagnóstico inicial, estadificación, factores patológicos, la recurrencia y la supervivencia se recogieron (Tabla 1). Los análisis de probabilidad de supervivencia se realizaron utilizando el método de Kaplan-Meier. Importancia diferencias entre los grupos se evaluó mediante la prueba de rangos de Sperman. Un análisis multivariante se realizaron utilizando un modelo de regresión de Cox para la supervivencia general. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, con un significado definido como p. & Lt; 0,05
La tinción inmunohistoquímica (IHC)
Las secciones de tejido a partir de bloques de TMA y, parafina de tejidos fijados con formol eran cortado en secciones de 4 micras, se montaron sobre portaobjetos, eliminó la parafina con xileno y se deshidrataron utilizando una serie de etanol. La recuperación del antígeno, con el uso de ácido cítrico (pH 6,0) durante 30 minutos, fue seguido por tratamiento with3 peróxido% de hidrógeno. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos contra proteínas específicas. Se obtuvieron anticuerpos específicos para p-H2AX, MMP-9, factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), y CD31 de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), Chemicon (Temecula, CA), Investigación & amp; Diagnostics Systems, Inc. (Minneapolis, MN EE.UU.), y DNMT1 y DNMT3b fueron adquiridos de Abcam (Cambridge, MA), respectivamente. Fueron utilizados en 1:100 diluciones. Después de tres lavados en solución salina tamponada con fosfato (PBS), las secciones se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado for10 min y se tiñeron con peroxidasa de avidina y se lavaron de nuevo en PBS; a continuación, se añadió solución de 3-amino-9-etilcarbazol. Las secciones se counterstained con hematoxilina. Los datos se analizaron mediante IHC Image Pro Plus 6.3 (IPP). la densidad microvascular (MVD) mediciones se mediante la tinción de CD31 Cada grupo de células endoteliales inmunorreactiva en contacto con el campo seleccionado se contó. Los datos de IHC fue examinado por una buena velocidad de escaneo de diapositivas plataforma de exploración, y se analizaron por Image Pro Plus 6.3 (IPP). Este análisis demostró que los anticuerpos proteínas que fueron altamente expresado en las células epiteliales tumorales dirigidas (Fig. 1) en comparación con tejido no canceroso adyacente. Para la evaluación histológica de DNMT1 y tinción DNMT3b, además de análisis IPP, los portaobjetos se vuelven a comprobar por un único patólogo. DNMT1 e inmunorreactividad DNMT3b de una muestra de tejido se contó para las células mostraron tinción nuclear positiva, independientemente de especímenes staining.The citoplásmicos fueron evaluados mediante la puntuación inmunorreactiva semi-cuantitativa (IRS). El IRS se calcula multiplicando la intensidad de la tinción (calificó como: 0 = no, 1 = débil, 2 = moderado y 3 = fuerte tinción) y el porcentaje de células teñidas positivamente (0 = menos de 10% de células teñidas, 1 = 11 a 50% de células teñidas, 2 = 51 a 80% de células teñidas y 3 = más de 81% de células teñidas). El criterio para la tinción positiva es un espécimen con una ley de puntuación 2.
Un IRS. Los niveles de DNMT1 y DNMT3b se examinaron en el cáncer (CA) y el tejido no maligno (NT) por análisis de transferencia Western. B. Niveles de DNMT1 y DNMT3b se examinaron en seis muestras (cáncer de emparejado (CA) y el tejido no maligno adyacente (NT);. Por RT-PCR El eje y muestra la relación de proteína diana en el tejido de cáncer dividido por que en . espécimen no malignas columnas, con una media de tres experimentos separados; Bares, desviación estándar (SD); *, P & lt;. 0,05 diapositivas C. representativos de tinción inmunohistoquímica positiva con anticuerpos DNMT1 y Dnmt3b se muestran mediante imágenes utilizando IPP (NT, epitelio adyacente no maligna;. CA, el tejido de cáncer oral) Imágenes de diapositivas representativos se muestran a aumentos de × 100 (fila superior) y × 200 (fila inferior) * (+) significa una tinción positiva en el cáncer de & gt;.. NT adyacente
cultivo de células y reactivos
Las líneas celulares de cáncer oral humana, SCC4 y SCC25, se obtuvieron a partir de bio-Recogida y Centro de Investigación (CRCB). anticuerpo humano recombinante de IL-6 se obtuvieron de R & amp ;.. D (Minneapolis, MN) el DNMT se obtuvo inhibidor de la 5-aza-2'- desoxicitidina de Sigma (St. Louis, MO) el DNMT3b-GFP vector de silenciamiento (vector psiRNA-h7SK expresar siRNA dirigidos DNMT3B humano de lo humano 7SK RNA polimerasa III promotor, y el gen de fusión GFP:Zeo que confiere tanto reportero y actividades de resistencia a antibióticos) y el vector de control de GFP (no efectiva revueltos siRNA en el vector GFP) fueron adquiridos de InvivoGen. células de cáncer de DNMT3B-silenciado estables fueron generados por transfección de células SCC4 y SCC25 con el vector de silenciamiento DNMT3b y seleccionadas mediante el cultivo en medio que contiene Zeomycin durante 4 semanas.
crecimiento celular y ensayo clonogénico
Los efectos de DNMT3b en la tasa de crecimiento celular fueron evaluados utilizando células transfectadas con un vector de silenciamiento DNMT3b o el control de vectores. Para medir el crecimiento celular, 1 × 10
4 células por pocillo se sembraron en placas de 6 pocillos. En los puntos de tiempo indicados, se tripsinizaron las células, recogidas y las células supervivientes se contaron usando exclusión de azul de tripano, a partir del cual se establecieron las curvas de supervivencia para transfectantes SCC. Además, se utilizó ensayo clonogénico. Exponencial se incubaron las células en crecimiento a 37 ° C durante 10 días, y las placas se tiñeron con cristal violeta (Sigma) para ayudar recuento de colonias. Las colonias que contienen & gt;. Se obtuvieron 50 células para determinar la eficiencia del chapado y sobrevivir fracciones para cada línea celular
inmunotransferencia
Para el Western Blot de células enteras y extractos de tejidos orales, las muestras se homogeneizaron y /o tratado con tampón de lisis (Calbiochem, La Jolla, CA). Las muestras de tejido orales comprenden seis muestras de tejido de cáncer y seis muestras de epitelio no malignas. Un kit NE-PER (Pierce, Rockford, IL) fue utilizado para separar las proteínas nucleares y citoplasmáticas. Para determinar el
in vitro
efectos de la IL-6 Ab, y un inhibidor de DNMT, las proteínas se extraen de las células en presencia o ausencia 5 g /ml de anticuerpos neutralizantes de IL-6 por 24 h o 5 micras 5- aza-2'-desoxicitidina durante 36 h, respectivamente. La misma cantidad de proteína se cargó en un gel de gradiente de SDS-PAGE al 4-20%, la proteína se transfirió a filtros de nitrocelulosa después de separadas en el gel. Las transferencias se bloquearon en 2% de BSA en TBST durante 1 h, las membranas se incubaron durante la noche (4 ° C) con anticuerpos contra DNMT1, DNMT3b, VEGF, E-cadherina, STAT3, pSTAT3
Tyr705, y MMP-9. Las membranas se incubaron con HRP conjugado anti-secundario de cabra, anti-ratón, o anticuerpos anti-conejo (dilución 1:1,000-1:2,000), respectivamente, para 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada. Las membranas se volvieron a sondar con un anticuerpo contra la r-tubulina o lámina nuclear para normalizar la carga de proteínas.
reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR)
En tiempo real RT-PCR se realizó en ARN extraído de las células y las muestras de tejido (muestras de tejido de cáncer de seis y seis tejidos orales no malignas; dos muestras se ejecutan en cada carril). RNA (2 g) fue inverso-transcrito con un cebador aleatorio para obtener la primera hebra de ADNc. Las secuencias de los cebadores para DNMT3b fueron 5'GACTCGAAGACGCACAGCTG 3 '/5' CTCGGTCTTTGCCGTTGTTATAG '. Para controlar las diferencias de carga, un cebador de β-actina se utilizó como control. La PCR optimizado se realizó en un tiempo real, sistema de detección por PCR multicolor iCycler Iq. Significativas señales de PCR fluorescentes de tejidos de carcinoma se normalizaron a la media de las señales obtenidas a partir de los tejidos y las células no malignas en condiciones de control.
La tinción de inmunofluorescencia (IF)
Las células que demuestra el crecimiento exponencial se sembraron sobre cubreobjetos para la tinción de inmunofluorescencia con o sin tratamiento. En los tiempos indicados después del tratamiento, las células se fijaron, se permeabilizaron con 2% de paraformaldehído durante 5 min y se lavaron con PBST. Los portaobjetos se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos contra E-cadherina, DNMT3b, VEGF y MMP-9 por 1 h con un anticuerpo secundario conjugado con Rojo Texas. Las diapositivas se counterstained con DAPI para visualizar los núcleos. Después de dos lavados con PBST, las proteínas diana específicas se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia.
migración celular y la invasión de células de ensayo
Capacidades para la invasión de células se determinaron usando un Cell Invasion Ensayo (Trevigen, Gaithersburg, MARYLAND). Después de la incubación durante 24 h, se determinó el número de células en la cámara inferior mediante la medición de la calceína anión fluorescente, liberado de acetoximetiléster calceína intracelular. Para validar los experimentos relativos a la migración celular, los ensayos de cero se llevaron a cabo. Una amplia cero 2 mm se dibuja a través de cada capa de células usando una punta de pipeta. Las placas fueron fotografiados en los tiempos indicados.
Tumor modelo de xenoinjerto
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio promulgada por el institutos de Recursos Animales de Laboratorio, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, EE.UU. el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del experimentos con Animales de Chang Gung Memorial hospital (Número de Permiso: 2012080902). Ocho semanas de edad ratones desnudos atímicos hembra fueron utilizados como el modelo de la implantación del tumor de xenoinjerto. En el modelo de la implantación del tumor ectópico, (se inyectaron 1 x 10 células
6 tumorales por vía subcutánea por la implantación, cinco animales por grupo) las células se implantan en la región dorsal bilateral glúteo. El tamaño del tumor se midió cada tres días después de la implantación (día 0). El volumen del tumor se calculó asumiendo una forma elipsoide.
Resultados
Niveles Dnmt3b en tejidos de cáncer oral
La expresión de DNMT3b en las muestras de tejido (maligno frente adyacentes no malignas ) se examinó por transferencia de Western, mientras que el ARNm se demostró por tiempo real de RT-PCR (Fig. 1A-B). Por los datos, cáncer demostró un nivel significativamente más alto de DNMT3b de la muestra no malignas. Los datos de IHC TMA diapositivas confirmaron este hallazgo que DNMT3b se sobreexpresa en los tejidos tumorales de los tejidos epiteliales no malignas adyacentes (fig. 1C). De los 125 tejidos de cáncer orales ensayadas para DNMT3b y DNMT1 utilizando el análisis IHC, 76 (61%) dio DNMT3b inmunorreactividad positiva, pero sólo el 36% (45/125) con tinción positiva DNMT1. Además, el papel de DNMT3b en el resultado clínico de OSCC humano se evaluó adicionalmente mediante la tinción IHC. Los pacientes fueron clasificados como más DNMT3b (+) o DNMT3b (-) sobre la base de los resultados de IHC. Hubo una correlación positiva entre la incidencia de metástasis en los ganglios linfáticos, la recurrencia de la enfermedad y la tinción positiva DNMT3b (Tabla 1). Ochenta y tres por ciento (40/46) de los pacientes con recurrencia de la enfermedad (incluyendo insuficiencia local-regional y metástasis a distancia) demostró tinción positiva para DNMT3b. En contraste, el 46% (36/79) de los pacientes clasificados como tengan la condición de libre de enfermedad expresó DNMT3b. Los resultados sugieren que DNMT3b tinción podría tener el valor predictivo en el pronóstico del cáncer oral.
Papel de DNMT3b en el crecimiento tumoral
Para investigar si la expresión alterna DNMT3b jugó un papel en el crecimiento agresivo del tumor, células de cáncer oral fueron transfectadas con un vector de silenciamiento DNMT3b-GFP. Como se demuestra en la Figura 2A, el vector de silenciamiento DNMT3b expresión DNMT3b inhibió significativamente en células de cáncer mediante transferencia de Western y análisis de tinción inmunoquímica. El efecto de DNMT3b en el crecimiento de células tumorales se determinó por recuento de células viables de más de seis días y la formación de colonias. Los datos de los experimentos celulares mostraron DNMT3b silenciar vectores proliferación de células tumorales, inhibió
in vitro gratis (Fig. 2B). Se midió además el cambio en la distribución del ciclo celular. El vector de silenciamiento DNMT3b resultó en la detención del ciclo celular (Fig. 2C). Como se muestra en la Figura 2D por la observación de los tumores de xenoinjertos, la inhibición de DNMT3b usando vectores de silenciamiento disminuyó significativamente la tasa de crecimiento del tumor.
A. Efectos de DNMT3b vector de silenciamiento del nivel de DNMT3b en SCC4 y SCC25 demostrado por transferencia Western y tinción inmunoquímica
in vitro
. Imágenes de diapositivas representativos se muestran y la flecha indica la tinción positiva de DNMT3b en las células. (C-V, las células con vector de control; DNMT3b-SV, las células transfectadas de forma estable con el vector de silenciamiento DNMT3b; DNMT-I, las células tratadas con el inhibidor de DNMT). B. Efecto de la DNMT3b sobre la proliferación de células de cáncer oral como se determina por el recuento de células viables y la formación de colonias. El mismo número de células (10
4) se sembraron en cada placa en el día 0 y se dejan crecer en sus respectivas culturas. Se contó el número de células viables después de la incubación durante 2, 4 y 6 días. El eje Y representa el número de células viables. Point, medios de tres experimentos separados; bares, Dakota del Sur. *,
p Hotel & lt; 0,05. C. Las células se analizaron por FACS para el contenido de ADN en condiciones de control o con la inhibición DNMT3b. Los datos se demostró por las imágenes representadas. D. Efectos de DBMT3b vector de silenciamiento sobre los niveles de DNMT1 y DNMT3b evaluados por IHC y el crecimiento del tumor de xenoinjerto. Cada punto representa la media de tres experimentos separados; bares, SD; *,
P Hotel & lt; 0,05. se muestran imágenes representativas.
Papel de DNMT3b en la invasión tumoral
Hubo una relación positiva entre la tinción DNMT3b y metástasis LN y el fracaso de la enfermedad en pacientes con cáncer oral (Tabla 1). como se ha demostrado el uso de cero migración y la invasión ensayos, Dnmt3b vectores de silenciamiento atenúan la capacidad de invasión de las células de cáncer oral
in vitro gratis (Fig. 3A-B). transición epitelio mesénquima (EMT) es un evento clave en la invasión de un tumor [21]. Por lo tanto, se determinó si este era el mecanismo que subyace a los efectos de DNMT3b en la invasividad del cáncer oral. El vector de silenciamiento inducido DNMT3b células cancerosas orales para aumentar sus características epiteliales como se determina por cambios en la expresión de E-cadherina, una característica de la EMT [22] y vimentina (Fig. 3C-D). EMT ha informado de que se asocia con una serie de factores relacionados con la invasión incluyendo VEGF y MMP-9. Nuestros datos revelaron que la inhibición de DNMT3b por el vector de silenciamiento resultó en una menor expresión de VEGF y MMP-9. La angiogénesis es uno de los mecanismos que promueven la progresión del tumor, y las interacciones célula-célula endoteliales CD31 mediada están involucrados en la angiogénesis [23]. Por lo tanto, la red vascular dentro del tumor se midió por tinción de VEGF y análisis de la densidad microvascular (MVD) después de la tinción CD31. Cuando las células cancerosas orales con vectores de control y aquellos con DNMT3B vectores de silenciamiento se implantaron subcutáneamente en ratones, se encontró que el efecto de inhibición del crecimiento inducida por DNMT3b vector de silenciamiento asociado con bajos niveles de expresión de EMT-y el factor relacionados con la angiogénesis (Fig. 3E). En consecuencia, hemos sugerido que la sobreexpresión DNMT3b juega un papel en la promoción del tumor, y la inducción de angiogénesis y EMT podrían ser los mecanismos que sirven de fundamento.
A. La capacidad invasiva de las células de cáncer oral, con o sin el vector de silenciamiento DNMT3b se evaluó mediante ensayos de migración cero. Los resultados de diapositivas representativos se muestran. Columna, media de tres experimentos separados. Bares, Dakota del Sur. *, P & lt; 0,05. B. Las capacidades invasivas de las células de cáncer oral, con o sin regulación de DNMT3b se evaluaron mediante el ensayo de invasión en células de cáncer oral, SCC4 y SCC25. Los resultados se muestran por portaobjetos representativos y los datos cuantitativos. *,
P Hotel & lt; 0,05. C. Los cambios de E-cadherina en las células son evaluados y los resultados se muestran en las diapositivas representativos (fila superior, la imagen de inmunofluorescencia teñidas con Ab para DNMT3b y DAPI para el núcleo; fila inferior, imagen de inmunofluorescencia teñidas con Ab para E-cadherina y DAPI para núcleo); (Azul: DAPI; verde: GFP-vector; Rojo: proteína diana). D. Los cambios en las proteínas de EMT asociado en las células con la regulación de DNMT3b se evaluaron por análisis de Western blot (C-V, las células con vector de control; DNMT3b-SV, las células con DNMT3b vector de silenciamiento). E. IHC usando MMP-9, la tinción de CD31 y VEGF en, tejidos embebidos en parafina fijadas con formalina de xenoinjertos de tumores. Dnmt3b vectores de silenciamiento se redujeron significativamente por la angiogénesis y los cambios relacionados con la EMT, en comparación con el vector de control.
DNMT3b e IL-6 están vinculados con el resultado clínico de CCCA
Anteriormente, se informó de que la activación de la IL-6 señalización /STAT3 inducida EMT comportamiento y cambios de tumores agresivos en el cáncer oral [19]. Por lo tanto, la correlación entre DNMT3b e IL-6 en el resultado clínico de fase III-IV CCCA humana se estimó además usando IHC en las TMA que consta de 125 muestras. De las 125 muestras de tejido ensayadas para DNMT3b y IL-6, tanto 59 (61%) fueron positivos. Como se muestra en la figura 4A, se observó una correlación positiva significativa en la muestra de cáncer que se tiñeron positivamente para DNMT3b y IL-6. Utilizando el análisis univariante, recurrencia de la enfermedad y la tinción positiva para DNMT3b e IL-6 estaban vinculados con todos significativamente menor supervivencia (Tabla 2 y Figura 4B). Utilizando el análisis multivariado, la expresión de DNMT3b y recurrencia de la enfermedad fue predictores significativos para la supervivencia global en los 125 pacientes con cáncer oral (Tabla 3). Los resultados ponen de relieve la contribución de la tinción DNMT3b de mal pronóstico en el cáncer oral. Por el análisis de proteínas, la inhibición de IL-6 de señalización resultó en una disminución DNMT3b y expresión factores relacionados con el EMT, asociado con STAT3 atenuada y la activación de Akt (Fig. 5A-B). Por otra parte, la Figura 5C demuestra que la disminución de DNMT3b por IL-6 aumentado anticuerpo daño en el ADN y la muerte celular. Por lo tanto, se sugiere que la activación de la señalización de IL-6 podría ser responsable ante el aumento en los cánceres orales DNMT3b.
A. nivel DNMT3b se correlacionó positivamente con la expresión de IL-6 en muestras humanas de cáncer oral (P & lt; 0,0001). diapositivas representativos de una muestra de tumor seleccionados tinción positiva tanto para IL-6 y DNMT3b se muestra en × 100 y 400 aumentos. B. diferencias de supervivencia de acuerdo con el desarrollo de insuficiencia enfermedad o no, la tinción positiva de DNMT3b y tinción positiva tanto para DNMT3b y IL-6. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier en general muestra que los grupos positivos estaban relacionados con la supervivencia más corta en comparación con la de los respectivos grupos negativo.
A. Efecto de la IL-6 sobre los niveles de DNMT3b y proteínas relacionadas con EMT se evaluó mediante análisis de inmunofluorescencia
in vitro
y los resultados se muestran por portaobjetos representativos. B. Influencia de bloqueo de la IL-6 en el nivel de DNMT3b, STAT3 /activación de Akt y proteínas relacionadas con EMT se evaluó por análisis de transferencia Western. C. Efectos de IL-6 en el nivel de DNMT3b y proteínas de muerte celular en SCC4 y SCC25 demostrado por tinción inmunoquímica
in vitro
.
Discusión
se ha informado de que un cambio a la acumulación de la hipermetilación del ADN podría ser causada por la sobre expresión de metiltransferasas de ADN [15]. el silenciamiento de genes epigenéticos, promovido por DNMTs, se ha observado en diversos tumores malignos, el apoyo a la afirmación de que los genes son Dnmt sobreexpresado en los cánceres humanos y durante la transformación celular [24] - [26]. En el presente estudio, IHC de TMA diapositivas reveló que el nivel de expresión DNMT3b fue mayor en 76 especímenes (61%) de cáncer que en el epitelio oral no maligno adyacente. Además, evaluó si DNMT1 se sobreexpresa en COCE usando IHC de TMA diapositivas. Los datos revelaron que sólo 45 (36%) de muestras de cáncer tuvieron mayor DNMT1 comparación con los tejidos epiteliales no malignas adyacentes. Identificación, desarrollo y selección de objetivos moleculares son importantes en la terapia del cáncer. Los poderes de predicción de DNMT3b fueron examinados en cuanto a la evolución clínica de cáncer oral. Utilizando el análisis univariante, las expresiones mejoradas de DNMT3b se asociaron significativamente con una mayor incidencia de metástasis en los ganglios linfáticos, una mayor tasa de recurrencia después del tratamiento y la supervivencia más corta. Utilizando el análisis multivariado, el fracaso de la enfermedad y una mayor expresión de DNMT3b se asociaron significativamente con la supervivencia general más corta. Para investigar más a fondo si DNMT3b fue responsable del crecimiento del tumor agresivo de COCE, suprimimos DNMT3b en las células de cáncer oral utilizando un vector de silenciamiento. Los datos obtenidos de los experimentos celulares y experimentos de crecimiento de tumores de xenoinjerto revelaron que la inhibición de DNMT3b resultó en el crecimiento del tumor más lento. Además, la inhibición de DNMT3b se asoció con la invasividad atenuada. Los cambios moleculares y fenotípicos implicados en la transformación de una célula epitelial a un tipo de célula mesenquimal parecen ser funcionalmente relevante a las características invasivas de tumores epiteliales [21]. Se ha informado de que EMT se asocia con la progresión OSCC [27], [28]. En el nivel del marcador molecular, EMT se caracteriza por una pérdida de E-cadherina y aumento de la expresión de vimentina y factores relacionados con la invasión. Los vectores de silenciamiento Dnmt3b indujeron un aumento de la E-cadherina y disminución de VEGF y MMP-9 en células de cáncer oral. Además, la angiogénesis es uno de los mecanismos que promueven la progresión del tumor, y CD31 mediada interacciones célula-célula endotelial implicados en la angiogénesis. Por nuestros datos, la inhibición de la DNMT3b atenuó el crecimiento del tumor, asociado con una disminución de expresión de CD31 y VEGF en tumores. Estos resultados indicaron que DNMT3b podría mediar el crecimiento agresivo del tumor en el cáncer oral, y la promoción de la EMT y la angiogénesis es uno de los mecanismos subyacentes.
desarrollo CCCA es en parte facilitado por irritaciones crónicas epiteliales y este tumor es más frecuente en fumador o que consumen alcohol cantidad excesiva. IL-6, es una citocina proinflamatoria que media la inflamación crónica y ha sido informado a desempeñar un papel importante en la carcinogénesis oral de la inflamación impulsada por [29], [30]. Hemos informado anteriormente de que ha activado la IL-6 vías podría ser responsable del crecimiento del tumor más agresivo observado en el cáncer oral, y el alto nivel de STAT3 y p-AKT activado fue inducida por la IL-6 y IL-6 que une a la tumorigénesis [19]. Se ha informado de que la IL-6 niveles son elevados en esta neoplasia y la IL-6 se considera un factor de mal pronóstico en el cáncer oral. IL-6 secreción en el cáncer escamoso oral, se ve facilitada por el microambiente, en particular derivados del estroma factor de 1 [29]. Por otra parte, numerosos proyectos han demostrado que la IL-6- inducida hipermetilación y de silenciamiento génico puede ser mediada por DNMTs [18], [20], [31] - [33]. Tomados en conjunto, hemos propuesto que el estrés inflamación crónica en la cavidad oral puede promover la tumorigénesis mediada por el aumento de IL-6 para inducir la metilación del ADN aberrante a través de aumento de la actividad DNMT3b. En el presente estudio, los datos obtenidos de IHC de muestras clínicas demostraron que la expresión DNMT3b se correlacionó significativamente con la IL-6 de la tinción. La agresividad del tumor observado en IL-6 OSCC positivo puede ser, en parte, a través de la sobreexpresión de DNMT3b. Para probar la hipótesis, la relación entre la IL-6 y la señalización DNMT3b en CCCA se examina más adelante en el presente estudio para ver si la regulación de los resultados de la IL-6 señalización en los cambios de expresión DNMT3b. Por los experimentos en los que la IL-6 de señalización fue suprimida por el anticuerpo IL-6, se encontró que activa la señalización de IL-6 juega un papel importante en la activación de STAT3 DNMT3b asociado con activado y PI3K en células de cáncer oral. Los datos obtenidos de este estudio revelaron que el DNMT3b aumento inducido por la IL-6, lo que podría estar mediado por la activación de STAT3 y la señalización de PI3K, es crítica en la agresividad del tumor y el pronóstico de cáncer oral. Por lo tanto, hemos descrito las principales vías de señalización que se cree que vincular la IL-6 y DNMT3b al cáncer oral (Fig. 6).
En conclusión, la inflamación y la metilación se cree tanto para jugar un papel clave en forma oral tumorigénesis, sin embargo, los efectos de la inflamación que circulan por la metilación necesita más investigación en esta enfermedad. Este proyecto estableció eje IL-6-DNMT3B es probable que sea importante en el pronóstico de CCCA. Identificación, desarrollo y selección de objetivos moleculares son importantes en la terapia del cáncer. Los datos apoyan la hipótesis de que el eje emergente IL-6-DNMT3b es un predictor significativo, y la orientación DNMT3b puede representar una estrategia prometedora para el tratamiento OSCC.