Extracto
Andrografólido (Andro) suprime la proliferación y desencadena la apoptosis en muchos tipos de células cancerosas. Taxifolina (Taxi) se ha propuesto para evitar el desarrollo del cáncer similar a otros flavonoides en la dieta. En el presente estudio, se evaluaron los efectos citotóxicos y apoptóticos de la adición de Andro solo y Andro y taxi juntos en células de carcinoma de próstata DU145 humanos. Andro inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata por detención de la mitosis y la activación de la vía apoptótica intrínseca. Aunque el efecto de Taxi solo en la proliferación de células DU145 no fue significativa, el uso combinado de Taxi con Andro potenció significativamente el efecto anti-proliferativo de aumento de la detención mitótica y apoptosis mediante la mejora de la escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa, y caspases- 7 y -9. Andro junto con Taxi mejorado la polimerización de microtúbulos
in vitro
, y se indujo la formación de husos retorcidos y alargadas en las células cancerosas, lo que conduce a la detención de la mitosis. Además, hemos demostrado que el agotamiento de MAD2, un componente en la asamblea de control de huso (SAC), alivia el bloque mitótico inducido por los dos compuestos, lo que sugiere que desencadenan detención de la mitosis mediante la activación SAC. Este estudio sugiere que la actividad anti-cáncer de Andro se puede mejorar de manera significativa en combinación con Taxi mediante la interrupción de la dinámica de microtúbulos y la activación de la SAC
Visto:. Zhang ZR, Al Zaharna M, Wong MM-K, Chiu SK , Cheung HY (2013) inducida por Andrografólido taxifolina mejora la detención de la mitosis y apoptosis en células de cáncer de próstata humano a través de la Asamblea de control de huso activación. PLoS ONE 8 (1): e54577. doi: 10.1371 /journal.pone.0054577
Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de génomique Fonctionnelle de Lyon, Francia |
Recibido: 1 de mayo de 2011; Aceptado: 13 de diciembre de 2012; Publicado: 28 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo descrito en este documento fue parcialmente apoyado por dos subvenciones de la City University de Hong Kong (Proyecto Nº 7.002.714 y 7.002.872). Se agradece al Departamento de Salud, Gobierno de Hong Kong SAR, por su apoyo financiero a través del proyecto HKCMMS. Los autores también reconocen la beca de la Escuela de Estudios de Posgrado, Universidad de la Ciudad de Hong Kong a la señorita Z. R. Zhang. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Andrografólido (Andro) es una lactona diterpenoid aislado de la hierba funcional
andrographis paniculata
, que ha sido utilizado como una medicina popular para tratar las infecciones del tracto respiratorio superior, dolor de garganta y muchas otras enfermedades infecciosas. Este compuesto se ha sugerido que tienen un gran potencial para el tratamiento del cáncer, ya que muestra las actividades contra el cáncer, tanto en forma directa e indirecta [1] - [5]. Andro puede inhibir directamente el crecimiento de células tumorales a través de la inducción de la detención del ciclo celular, la apoptosis y la diferenciación, y se puede suprimir indirectamente el desarrollo del cáncer a través de inmunoestimulante, anti-inflamatorios, anti-angiogénicos y quimioprotectores [4]. Andro puede modificar la subunidad p50 de NF-kB de una manera antagónica, y este mecanismo puede ser la causa de sus múltiples actividades [6]. Su actividad fármaco depende de su concentración, ya que puede suprimir la apoptosis en muchos tipos celulares a ciertas concentraciones [7], [8], [9], pero puede también inducir apoptosis a altas concentraciones [10], [11], [ ,,,0],12]. Muchos estudios han demostrado que Andro induce eficazmente la detención del ciclo celular en varios tipos de células cancerosas en la fase G0 /G1 [10], [13], [14] y en células de hepatoma HepG2 humanos en la fase G2 /M [15]. Nuestro estudio reciente muestra que los efectos de Andro dependen del tipo de célula. Por ejemplo, se detiene el ciclo celular en G2 /M en varias líneas celulares de cáncer hepatocelular, pero conduce a la apoptosis en las células HeLa [16]. De acuerdo con estudios anteriores, Andro activa la vía del receptor de muerte extrínseca e induce la muerte celular por apoptosis en diferentes tipos de células cancerosas. En la mayoría de tipos de células, la activación de la caspasa efectora también requiere la amplificación de la señal a través de una vía apoptótica mitocondria dependiente de [11], [17]. Pro-apoptóticas Bcl-2 miembros de la familia (Oferta y Bax) se cree que juegan un papel clave como mediadores en el relevo de la señal de muerte celular estimulado por Andro [11], [12].
El papel de la dieta flavonoides en la prevención del cáncer también ha sido ampliamente discutido. datos convincentes de estudios de laboratorio y ensayos clínicos humanos indican que los flavonoides tienen un papel importante en la prevención y tratamiento del cáncer [18] - [20]. Un número considerable de estudios han demostrado que los flavonoides son capaces de potenciar la actividad anti-tumor de otros agentes en múltiples tipos de cáncer [21] - [24]. Taxifolina (Taxi), también conocido como dihidroquercetina, tiene un fuerte efecto anti-oxidante y posee actividades similares a la quercetina, que potencia la apoptosis inducida por una variedad de agentes contra el cáncer en modelos celulares y animales [25] - [28]. Sin embargo, no se ha informado del uso combinado de Taxi con otros agentes anti-cáncer.
Aunque Andro ha informado para ejercer un efecto anti-proliferativo en muchos tipos de células de cáncer [29], los estudios moleculares detallados de su efecto sobre las células de cáncer de próstata andrógeno-refractario todavía se carece. La hipótesis de que el tratamiento multi-destino es un método prometedor para hacer uso de las actividades contra el cáncer de compuestos de origen natural. Se realizó el presente estudio para determinar los efectos individuales y combinados de Andro y taxi en la detención del ciclo celular y la apoptosis en células de cáncer de próstata DU145 independientes de andrógenos. Los efectos apoptóticos de Andro en las células se mejora de forma significativa cuando se utiliza en combinación con Taxi mediante la mejora de la ruta apoptótica y la inducción de la activación del punto de control de ensamblaje del huso (SAC).
Materiales y Métodos
cultivo de células y productos químicos
células de carcinoma de próstata independientes de andrógenos humanos DU145, células de la próstata humanas inmortalizadas PNT2, y humano normal fibroblastos de prepucio Hs27 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (MD, EE.UU.). Estas líneas celulares se mantuvieron rutinariamente en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen, CA, EE.UU.), 0,37% de bicarbonato de sodio, 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5 % de CO
2 incubadora de aire. Andro purificada (97%) se obtuvo de Indofine Chemical Company (Nueva Jersey, EE.UU.). Taxi que era 85% puro fue adquirido de la Corporación Sigma-Aldrich (MO, EE.UU.) y una preparación pura de taxis 98% fue adquirido de BioBioPha (Yunnan, P.R.C.). Ambas preparaciones tuvieron el mismo efecto sobre la viabilidad celular cuando se administran solos o en combinación con Andro. Ambos productos químicos se disolvieron primero en DMSO (menos de 0,1%) y después se diluyó con medio de crecimiento completo a la concentración final deseada antes del tratamiento. Las muestras tratadas con DMSO solo sirvieron como controles del vehículo. Todos los demás reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich a menos que se indique lo contrario.
celular MTT proliferación /viabilidad ensayo
La proliferación celular y la viabilidad fueron evaluados por 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il ) -2, 5-difenil-tetrazolio (MTT) (Invitrogen, CA, EE.UU.) de ensayo. células DU145, las células PNT2, y HS27 se sembraron a 5000 y 1000 células /pocillo, respectivamente, en una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron durante 24 h, y luego expuestas a varias concentraciones de Andro, Taxi o una mezcla de los dos para un período de tiempo predeterminado. Al final del tratamiento, el medio que contiene el fármaco se retiró y se añadió 0,5 mg /ml MTT disuelto en el mismo medio a cada pocillo. La placa se incubó adicionalmente durante 3 h adicionales. Después de retirar el sobrenadante al final de la incubación, se añadieron 100 l de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán que se habían formado. La absorbancia a 570 nm se midió con un espectrofotómetro de barrido multipocillo (Modelo 550, Bio-Rad, EE.UU.). La proliferación celular se expresa como porcentaje del control comparando el número de células vivas en el grupo de tratamiento con el número en el grupo de vehículo.
Observación de la morfología celular y nuclear
Las células se sembraron en esterilizada cubreobjetos con una confluencia de aproximadamente 30%, seguido de 24 h de incubación y el tratamiento químico. Las células se lavaron brevemente con PBS y se tiñeron con 5 mg /ml de Hoechst 33342 (Invitrogen, CA, EE.UU.) en no FBS DMEM durante 20 min a temperatura ambiente. Los cambios morfológicos en las células fueron examinadas usando contraste de fase y microscopios fluorescentes (Mikron Instruments, NY, EE.UU.).
Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo
Control y células tratadas fueron cosechadas y fija en el 70 % enfriado en hielo durante la noche de etanol a 4 ° C. Después de eliminar el etanol y el lavado con PBS, las células fijadas se volvieron a suspender en una solución de tinción de ADN que contiene 50 mg /ml de yoduro de propidio (PI) y 100 mg /ml RNasa A en PBS a una densidad de aproximadamente 1 x 10
6 células /ml. Se incubaron posteriormente durante otros 30 minutos a 37 ° C bajo luz tenue. La suspensión de células teñidas se analizaron con un citómetro de flujo (Becton Dickinson, CA, EE.UU.). Se utilizó el contenido de ADN de 10.000 células por muestra para analizar el ciclo celular utilizando histogramas de ADN. El contenido de ADN en el ciclo celular de las células analizadas se calculó mediante el software MODFIT 3.0 (Verity Software House, ME, EE.UU.).
Cuantificación del índice mitótico mediante citometría de flujo
El control y la se recogieron las células tratadas y se fijaron en 4% de formaldehído durante 10 min a 37 ° C. Después las células se permeabilizaron por adición lenta de metanol enfriado con hielo a una concentración final de 90% y se incubaron en hielo durante 30 min. Aproximadamente 1 × 10
6 células se resuspendieron en 100 l de tampón de incubación (0,5% de BSA en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente. Las células fueron incubadas con fosfohistona H3 (Ser10) anticuerpo (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) durante 1 h y luego con un anticuerpo secundario conjugado con FITC (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. células Immunostained se resuspendieron en 0,5 ml de yoduro de propidio (5 mg /ml) en PBS y se mantuvieron en la oscuridad antes del análisis con un citómetro de flujo dentro de 24 h. La señal de 10.000 células se midió para generar un gráfico de dispersión.
La cuantificación de la tasa de apoptosis por citometría de flujo
La apoptosis se evaluó mediante el Kit de Anexina V-FITC Apoptosis Detección (Sigma-Aldrich) con el procedimiento proporcionado por el fabricante. En resumen, se recogieron las células en las placas de cultivo y se lavaron, y aproximadamente 5 × 10
5 células se resuspendieron en 500 l de 1 × tampón de unión (mM HEPE 10 /NaOH, pH 7,5, 0,14 M NaCl y CaCl 2,5 mM
2). Entonces, 5 l de 50 mg /ml AnnexinV conjugado FITC (en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM) y 10 l de 100 mg Solución PI /ml (en tampón fosfato de potasio 10 mM, pH 7,4, 150 mM NaCl) se añadieron a la suspensión celular. Después de 10 minutos de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente, la señal de fluorescencia de las células se midió inmediatamente con un citómetro de flujo.
inmunofluorescencia microscopía
Las células se sembraron a 60% de confluencia en la cubierta esterilizada resbalones y expuestos a las sustancias químicas de interés después de 24 h de incubación. Después de un período predeterminado de tiempo de tratamiento con los productos químicos, las células se fijaron con 4% de formaldehído en PBS durante 10 min a temperatura ambiente, se lavaron con PBS y se permeabilizaron con 0,25% de Triton X-100 en PBS durante 10 min. Las células permeabilizadas se lavaron posteriormente y se incubaron con tampón de incubación (3% BSA en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente para bloquear la unión de anticuerpo no específica. β-tubulina anticuerpo (Cell Signaling Technology) se incubó con las células durante 1 h a temperatura ambiente, y la IgG de cabra anti-conejo entonces conjugado con FITC (Santa Cruz) y el colorante de tinción de ADN se añadieron Hoechst durante 1 h con luz tenue. Al final de la reacción, los cubreobjetos se lavaron con PBS antes de ser montadas en portaobjetos de microscopio con fluorescencia medio de montaje (Dako, Dinamarca). Las diapositivas selladas fueron examinados con un microscopio confocal Leica SP5 (excitación a 488 nm para FITC y 365 nm para Hoechst).
Western blot
lisado celular total se preparó por lisis de las células en tampón de lisis RIPA (NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 0,5% desoxicolato de sodio, 1% NP-40, y 50 mM Tris-Cl, pH 7,5) suplementado con el Cocktail Set Inhibidores de la proteasa III (Calbiochem, CA, EE.UU.) y PMSF 1 mM a una densidad de 1-2 x 10
tampón 7 células /ml. La suspensión de células se agitó durante 30 min y después se centrifugó a 14.000 rpm durante 20 min a 4 ° C. El sobrenadante se recogió en forma de extractos de células. A continuación, 50 g de proteínas de los lisados celulares se separaron mediante electroforesis en gel de 12% SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, CA, EE.UU.). La membrana se bloqueó con 3% de BSA o leche no grasa en PBS con 0,05% de Tween-20. Esto fue seguido por incubación durante la noche con una solución diluida de anticuerpo primario contra la α-tubulina, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-9, p-Cdc2 (Tyr15), ciclina A, ciclina B1, la ciclina E2, Myt-1, p21, PARP (Señalización celular), Bcl-2 (Santa Cruz), Bcl-xL (Invitrogen, CA, EE.UU.), o Cdc2 (BD) a 4 ° C. Esto fue seguido por la incubación a temperatura ambiente con anticuerpo conjugado con HRP (anti-IgG de ratón o anti-IgG de conejo) durante 1 h. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. Las transferencias se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) usando el Blotting Luminol Reactivo Western (Santa Cruz). Imágenes desarrollado fueron capturados con un sistema de documentación de geles LAS-4000 (Fuji Film, Tokio, Japón).
in vitro
tubulina ensayo de turbidez
La influencia de las drogas en la polimerización de microtúbulos se vigila por medio de la pantalla CytoDYNAMIX ™ 01 kit (citoesqueleto Inc., CO, EE.UU.). En resumen, los fármacos a diferentes concentraciones se preparan en DMSO a 10 × fuerza en tampón G-PEM, que contiene TUBOS 80 mM (pH 6,9), MgCl 2 mM
2, EGTA 0,5 mM, GTP 1 y 5% de glicerol . DMSO sirvió como un control del vehículo. Posteriormente, se añadieron 10 l de 10 x tampón G-PEM en cada pocillo de una placa de 96 pocillos pre-calentado y se dejó incubar durante 2-5 min. proteína tubulina (& gt; 97% de pureza) se mezcló con tampón de G-PEM a una concentración de aproximadamente 4 mg /ml y después se añadió 90 l de la solución de la tubulina en cada pocillo que contiene 10 l de la solución tampón. Después de agitar, la absorbancia a 340 nm se midió cada minuto durante 60 minutos a 37 ° C.
RNAi agotamiento de MAD2
células DU145 se sembraron en placas de 60 mm para proporcionar una confluencia del 50 -70% en 24 h. Las células fueron transfectadas con cualquiera de los dos MAD2L1 siRNA (Origene, MD, EE.UU.) o el control de siRNA en presencia del reactivo de transfección Sitran (Origene) en medio Opti-MEM (Invitrogen, CA, EE.UU.) durante 24 h. Las células transfectadas se lavaron una vez con PBS y se incubaron con DMEM (Invitrogen, CA, EE.UU.) medio durante 24 h y se incubaron adicionalmente durante otras 24 h en medio que contiene 20 mM Andro y 100 Taxi M. Las células se aclararon una vez con PBS, se tripsinizaron, y se fijaron con 70% de etanol y se almacenaron a -20 ° C durante la noche. Las células índice mitótico fueron cuantificados mediante citometría de flujo basado en señales de anticuerpos contra fosfato histonas H3 (a S10) y yoduro de propidio.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el Origen 7.5 software (Origin Corporation, MA, EE.UU.) y Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.). Todos los datos fueron analizados a partir de 3 o 4 experimentos independientes. Los resultados se expresaron como media ± S. D. Las diferencias entre las muestras se analizaron mediante pruebas t de dos muestras de Student. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
Andro es mucho más citotóxico que el taxi en la inhibición del crecimiento de células de cáncer de próstata
próstata humano DU145 células de carcinoma fueron expuestos a 0 a 50 mM Andro durante 24, 48 y 72 h, y la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo MTT, un método común para medir la actividad metabólica de las células para reflejar el número de células o la proliferación. Andro inhibió la proliferación de las células DU145 de una manera tiempo y dependiente de la concentración en comparación con las células proliferantes no tratados (figura 1A). El calculada IC
50 valores de Andro en las células DU145 fueron 42,76 ± 3,29 (24 h), 13,70 ± 1,45 (48 h) y 8,36 ± 0,77 M (72 h). El IC
50 Valor a las 48 h obtenidos en este estudio sólo fue ligeramente más alto que el valor (12 M) previamente reportado por Nanduri
et al.
[29]. A concentraciones más altas que los cambios IC
valor 50, Andro inducida en la morfología celular de las células DU145 tratadas, que aparecieron redondo y encogido y mostraban formación de ampollas (Figura S1). Estas células también mostraron condensación de la cromatina y los núcleos fragmentados (figura S2)
.
Las células fueron tratadas con una gama de concentraciones de (A) Andro y (B) de taxi para el período de tiempo indicado y la proliferación celular se controló mediante el ensayo de MTT. Se expresaron los datos de tres experimentos independientes como porcentaje de viabilidad en comparación con el control de vehículo (DMSO). Los valores son medias ± S. D.
También se evaluó la citotoxicidad de taxi en las células DU145 utilizando el ensayo MTT. Los resultados mostraron que el taxi es mucho menos citotóxico para las células DU145 que Andro y que se requería una concentración de 500 mM de taxi para inhibir el crecimiento celular en un 52% después de 48 h de exposición (Figura 1B). El resultado de este estudio es coherente con un informe anterior sobre la citotoxicidad de taxi en las células cancerosas de mamíferos [30].
Andro induce la detención mitótica y apoptosis análisis del ciclo celular
indican que el tratamiento de células DU145 con Andro a concentraciones entre 0-40 mM condujeron a una acumulación de células en G2 /M, pero una disminución en las células en G0 /G1 en un dependiente de la concentración (Figura 2A) y de manera dependiente del tiempo (Figura 2B). También se determinó si el aumento de la G2 /M población era debido a un aumento en las células mitóticas en 24 h después del tratamiento Andro. Monitorizamos el índice mitótico (la proporción de células mitóticas para el resto de la población de células) por citometría de flujo utilizando inmunotinción con H3 fosfo-histona, un marcador mitótico, y se observó que Andro indujo una acumulación significativa de células mitóticas en una dosis de manera dependiente (Figura 2C). Se observó un aumento de 11 veces en células mitóticas después del tratamiento con 40 mM Andro para 24 h en comparación con el control del vehículo (la población de células en los rectángulos marcados con M en las figuras 2C y 2D). Una comparación entre el índice mitótico y el porcentaje de células G2 /M en la población sugiere que la acumulación de células G2 /M se debió principalmente a la detención mitótica (Figura 2D). Este conjunto de experimentos demostró que después de 24 h de tratamiento con Andro, las células fueron principalmente en detención mitótica
Las células (A) se expusieron a 0-40 mM de Andro para 48 h.; células (B) fueron expuestos a 40 M de Andro de 0-72 h. El ADN celular se tiñó con yoduro de propidio (PI) y se analizó por citometría de flujo. El porcentaje de células en cada fase específica del ciclo celular se calculó con el programa ModFit y se expresó como la media ± s.d. (N = 3 o 4). (C & amp; D) Índice mitótico de las células DU145 tratados con Andro. Las células se trataron con 0, 20, y 40 mM de Andro durante 24 h y se fijaron y tiñeron con H3 (Ser10) anticuerpo anti-fosfo-histona, anticuerpo secundario conjugado con FITC y PI y se analizaron por citometría de flujo. (C) Un gráfico de la densidad representativas de las células marcadas con fosfohistona H3 contra el contenido de ADN en las células. Índice mitótico (M) de la población celular se indica en el área de caja. (D) índice mitótico y porcentaje de células G2 /M después del tratamiento con dos concentraciones diferentes de Andro expresan como media ± s.d. (N = 4). * Indica significativamente diferente del control (
p Hotel & lt; 0,01) guía empresas
También examinamos las condiciones que causaron Andro para inducir la apoptosis.. células tratadas con Andro se tiñeron con Anexina V-FITC y se analizaron por citometría de flujo. El estudio del curso del tiempo de las tasas de apoptosis después del tratamiento con Andro mostró que la tasa de apoptosis temprana más alta (9,38%) se produjo a las 48 h; sin embargo, a las 72 h, la tasa de apoptosis temprana disminuyó, y la tasa de muerte celular aumentó (Figura 3C). Además, concentraciones crecientes de Andro afectados tanto la apoptosis temprana y tardía de una manera dependiente de la dosis (Figuras 3A y 3B). Llegamos a la conclusión que el tratamiento con Andro inhibió la proliferación de las células DU145 en la fase G2 /M y que más de estas células progresó hacia la apoptosis durante el tratamiento más largo, con detención mitótica prolongada que conduce a apoptosis
(A & amp; B). después de tratar durante 48 h con 0 a 80 M de Andro, se recogieron las células y se tiñeron con anticuerpo doblemente Anexina V-FITC y PI antes analizada por citometría de flujo. (A) Un conjunto de gráficos de puntos representativos indica el porcentaje de células apoptóticas tempranas (Anexina V-FITC
+ /PI
-, el panel inferior de la mano derecha) y el porcentaje de células apoptóticas tarde y muertos (anexina V- FITC
+ /PI
+, el panel superior derecho). (B) La trama del porcentaje de apoptosis temprana y de células apoptóticas y muertas finales de los años en diferentes concentraciones Andro expresan como media ± S. D. (N = 4). (C) Las células se expusieron a 40 mM de Andro de 0-72 h. La gráfica del porcentaje de apoptosis temprana y de células apoptóticas y muertas finales contra el momento del tratamiento expresan como media ± S. D. (N = 4).
Efecto de Andro en la expresión de los reguladores del ciclo celular, caspasas y proteínas de la familia Bcl-2
Para explorar los mecanismos moleculares de la detención de la mitosis inducida por Andro , los niveles de expresión de varios reguladores del ciclo celular importantes fueron analizados por Western Blot. Análisis de las inmunotransferencias mostró que 24 h después del tratamiento, un 5,7 veces, 3,2 veces y aumento de 3 veces en la ciclina B1, p21, y (Tyr15) los niveles de proteína Cdc25C fosforilados, respectivamente, se observaron (Figuras 4A-D) , mientras que los niveles de proteína de la ciclina A y ciclina E2 disminuido con concentraciones crecientes de Andro. Borrar desplazamientos de movilidad paralelos debido a la fosforilación de Cdc25C, Myt1 y p21 estuvieron presentes en 24 h (Figura 4A). En particular, la expresión de la ciclina B1 era dependiente de la concentración de Andro. Por ejemplo, su expresión fue más alta en 40 mM pero disminuyó a 80 mM. Del mismo modo, los niveles de fosforilación de Cdc25C y Myt1 fueron los más intensa después del tratamiento con 40 mM Andro.
(A) Las células se incubaron con 0 a 80 M de Andro para 24 o 48 h. 40 mg del lisado celular se resolvieron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 12%, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se inmunotransfirieron contra los anticuerpos del regulador del ciclo celular indicados. Los datos son la cuantificación de las transferencias Western de tres experimentos independientes. (B) El cambio en el nivel de ciclina B1 en comparación con el control (0 M) a partir de la cuantificación de las transferencias de Western se representó frente a la concentración de Andro a las 24 y 48 h. (C) El cambio en los niveles de Cdc25C fosforilada se representó frente a la concentración de Andro. (D) El cambio en los niveles de p21 se representó frente a la concentración de Andro. Se muestran las desviaciones estándar de tres experimentos independientes.
También examinaron los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis, las caspasas y miembros de la familia Bcl-2 por inmunotransferencia con sus anticuerpos específicos. la escisión de la concentración y dependiente del tiempo de PARP (poli (ADP-ribosa) polimerasa), caspasa 7, 9 y 3 se observó (Figura 5A). La proteína pro-apoptótica Bax no se detectó ya sea en el control o las células tratadas; Sin embargo, el miembro pro-supervivencia Bcl-2 se expresó débilmente. La expresión de Bcl-XL, una proteína anti-apoptótica, se detecta claramente, pero se observó una forma de migración más lenta en las células tratadas 48 h después de la exposición a 80 mM Andro (Figura 5B). Estos datos sugieren que la apoptosis se indujo más significativamente después de 48 h de tratamiento con 80 mM Andro.
Las células se incubaron con 0 a 80 M de Andro durante 24 o 48 h, cosechadas y lisadas. 40 mg del lisado celular se separó en gel de poliacrilamida al 12%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos contra (A) PARP caspasa-7, -9, y -3 y el sustrato; y (b) las proteínas Bcl-2 la familia, incluyendo Bcl-XL, Bcl-2 y Bax. Los datos son representativos de tres experimentos independientes
Taxi potencia el efecto inhibidor del crecimiento de Andro
Hemos propuesto que Taxi puede influir en el efecto citotóxico de Andro en las células cancerosas.; Por lo tanto, se evaluó el efecto combinatorio de Andro y Taxi sobre la proliferación celular utilizando el ensayo MTT. Como se muestra en la Figura 6A, cuando se expone a 100 Taxi M sin ningún Andro, el porcentaje relativo de células proliferantes fue 93,33 ± 6,27% (media ± SD, n = 4), que no fue significativamente más bajo que el control del vehículo (células no tratadas) . En contraste, se observó una disminución significativa en el porcentaje de células en proliferación (% de control del número de células = 65,6%) en presencia de 10 mM Andro solo, pero la adición ulterior de 100 Taxi M resultó en un porcentaje ligeramente inferior de células proliferantes (54,78%). Sin embargo, el efecto inhibidor del crecimiento de 20 M Andro en combinación con 100 Taxi mu M (% de control = 20,92 ± 1,89%) fue aproximadamente dos veces el efecto del tratamiento con Taxi solo (% de control = 39,58 ± 1,79%, n = 4) , y la diferencia en la proliferación celular se produjo cuando la cantidad de Taxi se incrementó en combinación con concentraciones más altas de Andro. Una tendencia similar se observó cuando se añadieron 200 Taxi M junto con las concentraciones más altas de Andro; sin embargo, hubo una disminución del 14,7% en el número de células en presencia de Taxi solo (85,27%), que fue significativamente menor que la de las células tratadas con el control del vehículo. Por lo tanto, en todas las investigaciones posteriores, se usó 100 Taxi mu M en combinación con diversas concentraciones de Andro. Los resultados del análisis morfológico de las células tratadas utilizando interferencia diferencial microscopía de contraste de una buena correlación con los datos relativos a la proliferación celular (Figura 6B). Las células tratadas con los dos compuestos mostraron más contracción, baja densidad celular, un mayor número de células flotantes y más condensación nuclear y la fragmentación (no se muestra) que las células tratadas con Andro solo.
(A) Las células fueron tratados con 0-40 M de Andro y 0, 100 o 200 mM de Taxi durante 48 h, y la proliferación celular se determinó mediante el ensayo de MTT. Los datos de cuatro experimentos independientes se expresaron como porcentaje de viabilidad en comparación con el control de vehículo (DMSO) con una desviación estándar (media ± S.D., n = 4). * Indica significativamente diferencia con el control (
p
& lt; 0,01). (B) Las células se trataron con 20 mM de Andro durante 48 h en presencia o ausencia de 100 M de Taxi, y se observaron bajo microscopía de contraste de interferencia diferencial. Bar = 50 micras. (C) Una comparación de la viabilidad por el ensayo de MTT de DU145, PNT2, y Hs-27 células después del tratamiento con 20 mM de Andro y 100 mM de taxi. Los experimentos se realizaron por triplicado y las desviaciones estándar se indican.
Estábamos interesados en probar si el tratamiento dual de drogas era específica para las células cancerosas en comparación con células inmortalizadas, pero no cancerosas. El ensayo MTT se utilizó para comparar la proliferación de las células DU145 con células PNT2, una línea de células de próstata humana inmortalizada con el virus SV40, y con células HS-27, un prepucio humano línea celular de fibroblastos, se trató con 20 mM Andro y 100 Taxi mu M . En las mismas condiciones, sólo el 30,3% de las células DU145 eran viables, mientras que 48,6% y 62,4% de PNT2 y Hs-27 células, respectivamente, eran viables (Figura 6C). El resultado sugiere que las células DU145 fueron más sensibles a los dos fármacos que las otras dos líneas celulares humanas inmortalizadas.
Taxi y detención mitótica inducida por Andro condujeron a la acumulación de la ciclina B, cdc25C, y p21
para investigar si el efecto inhibidor combinado en el crecimiento de DU145 fue debido a la detención del ciclo celular, los eventos del ciclo celular y el índice mitótico se evaluaron en las células tratadas con Andro con o sin Taxi. Cuando Andro no estaba presente, el porcentaje de células en G2 /M en los dos grupos no fue significativamente diferente. Sin embargo, cuando la concentración de Andro se aumentó de 10 mM a 40 M, el porcentaje de células en G2 /M en los grupos de tratamiento combinado fue significativamente mayor que el porcentaje de células en el grupo de sólo Andro (Figura 7A). Además, no se observaron diferencias significativas en el cultivo tratado durante 24 h con 20 mM Andro en combinación con 100 mM de taxi (Figura 7B). La proporción de las células tratadas en la fase M se midió también con el anticuerpo anti-fosfo-histona H3 (S10). El índice mitótico del grupo combinado fue de aproximadamente el doble del nivel de las células tratadas con Andro solo (23,67 ± 4,21% vs. 10,65 ± 0,22%, n = 4), mientras que los índices mitóticos en ambos grupos de control no fue diferente el uno del otro (Figura 7C), lo que sugiere que Taxi sola no induce una detención en la fase M. La inmunotransferencia se usó para analizar los efectos de los fármacos sobre los niveles de expresión y la modificación de Cdc25C, la ciclina B1, y las proteínas p21 (Figura 7D). El aumento de la concentración de Andro aumentaron las formas fosforiladas de Cdc25C 2 veces, la proteína p21 casi 5 veces, y ciclina B1 4,1 veces (Figuras 7E-G). Después de 100 Taxi mu M se añadió a 20 mM Andro, la fosforilación de Cdc25C y el nivel de proteína de la ciclina B1 se elevan casi 2 veces y 3,5 veces, respectivamente. En contraste, el nivel de expresión de p21 no se alteró de forma significativa en el grupo de tratamiento combinado. Sin embargo, 40 mM Andro en combinación con 100 mM de taxi disminución de la ciclina B1 y niveles Cdc25C pero aumentó el nivel de p21 en 1,8 veces en comparación con el 20 M Andro y 100 mM de tratamiento de taxi. Estos experimentos demuestran que el tratamiento combinado dio lugar a una acumulación de células mitóticas detenido.
Las células se trataron con (A) 0-40 M de Andro durante 48 h (B) 20 M de Andro para 0-48 h en presencia o ausencia de 100 M de taxi. El ADN celular se tiñó con PI y se analizó mediante citometría de flujo. La distribución del ciclo celular se calculó con el programa ModFit. Media ± S. D. (N = 4) de porcentaje de células G2 /M en presencia de Taxi (100 M) y en ausencia de Taxi (taxi-) se compararon. * Indica diferencia significativa entre dos grupos, * p & lt; 0,01, **
p
& lt; 0,05. (C) Las células se trataron con 20 mM de Andro durante 24 h en presencia o ausencia de 100 M de taxi.