Extracto
El anti-inflamatoria anexina proteína A1 (ANXA1) se ha asociado con la progresión del cáncer y la metástasis, sugiriendo su papel en la regulación de la proliferación de células tumorales. Hemos investigado el mecanismo de interacción ANXA1 con receptor del péptido formilado 2 (fpr2 /ALX) en el control, las muestras de tejido peritumoral y laringe tumor de 20 pacientes, para cuantificar los neutrófilos y las células cebadas, y para evaluar la expresión de la proteína y co-localización de ANXA1 /fpr2 en estas células inflamatorias y células escamosas de la laringe por inmunocitoquímica. Además, hemos realizado experimentos in vitro para investigar más a fondo el papel funcional de ANXA1 /fpr2 en la proliferación y metástasis de las células Hep-2, una línea celular de carcinoma de laringe desde epidermoide, después del tratamiento con ANXA1
2-26 (anexina A1 N-terminal derivado de péptido), Boc2 (antagonista de FPR) y /o dexametasona. En estos tratamientos, el nivel de proliferación de células Hep-2, las citoquinas pro-inflamatorias, ANXA1 /fpr2 co-localización, y la señalización de la prostaglandina se analizaron mediante ELISA, inmunocitoquímica y PCR en tiempo real. Se ha detectado un afluencia de neutrófilos y mastocitos desgranulados en muestras de tumores. En estas células inflamatorias de muestras tumorales y peritumoral, la expresión ANXA1 /fpr2 fue notablemente agravada, sin embargo, en las células de carcinoma de laringe, esta expresión se redujo reguladas. ANXA1
2-26 tratamiento redujo la proliferación de las células Hep-2, un efecto que fue bloqueado por Boc2, y hasta reguladas expresión ANXA1 /fpr2. ANXA1
2-26 tratamiento también redujo los niveles de citoquinas pro-inflamatorias y afectó a la expresión de las metaloproteinasas y los receptores de EP, que están implicados en la señalización de prostaglandinas. En general, este estudio identificó posibles funciones para el mecanismo molecular de la interacción /fpr2 ANXA1 en el cáncer de laringe, incluida su relación con la vía de la prostaglandina, proporcionando puntos de partida prometedores para la investigación futura. ANXA1 puede contribuir a la regulación del crecimiento tumoral y la metástasis a través de mecanismos paracrinos que están mediadas por fpr2 /ALX. Estos datos pueden conducir a nuevas dianas biológicas para la intervención terapéutica en el cáncer de laringe humana
Visto:. Gastardelo TS, Cunha BR, Raposo LS, Maniglia JV, Cury PM, Lisoni FCR, et al. (2014) Inflamación y Cáncer: Papel de la anexina A1 y fpr2 /ALX en la proliferación y metástasis en humano laríngeo Carcinoma de células escamosas. PLoS ONE 9 (12): e111317. doi: 10.1371 /journal.pone.0111317
Editor: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 6 de diciembre de 2013; Aceptado: 30 de septiembre de 2014; Publicado: 9 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Gastardelo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo - FAPESP (subvenciones 2008 /08187-4 al SMO y 2008 /01655-2 a TSG) y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico - CNPq (subvención 302768 /2010- 6 a SMO). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de laringe es uno de los tipos más comunes de tumores de cabeza y cuello que tiene una alta tasa de mortalidad y un mal pronóstico [1]. Más de 12.500 nuevos casos de cáncer de laringe se diagnostican cada año y se producen 3.560 muertes anuales [2]. El desarrollo de un mejor tratamiento, así como los enfoques más preventivos y de diagnóstico requiere una mejor comprensión del complejo proceso de la tumorigénesis de laringe.
Sólo el 5% y el 10% de todos los cánceres son causados por la herencia de genes mutados, mientras el 90% y el 95% restante de los casos se han relacionado con alteraciones genéticas y epigenéticas causadas por factores de estilo de vida y el medio ambiente, tales como el tabaquismo y consumo de alcohol [3], [4]. Ahora es bien reconocido que la inflamación es un factor de riesgo para la mayoría de tipos de cáncer, incluyendo el carcinoma de la laringe [5], [6]. La inflamación crónica se ha relacionado con diversas etapas implicadas en la tumorigénesis, incluyendo la transformación celular, la promoción, la proliferación, la invasión, la angiogénesis y la metástasis [7], [8]. Hanahan y Weinberg, en su revisión reciente [9], la inflamación reconocidos como una nueva característica del cáncer que promueve características múltiples tumorales.
Las células inflamatorias secretan numerosas citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento que pueden estimular la proliferación, inhibir la apoptosis, inducir la morfogénesis y generar especies reactivas de oxígeno que dañan el ADN [7], lo que facilita la inestabilidad genómica [10]. Además, estas células sintetizan factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetina, metaloproteinasas y otras proteínas que pueden estimular la mitosis de células endoteliales vasculares y la remodelación de la matriz extracelular [11]. Por lo tanto, la inflamación genera no sólo cambios en el microambiente para promover el cáncer, sino también los cambios que estimulan la progresión neoplásica.
Se ha demostrado que los mastocitos y de los neutrófilos puede ser reclutado por las células tumorales. Aumento del número de mastocitos se han reportado en mamaria [12] y los carcinomas de pulmón [13], entre otros tumores. La evidencia experimental ha indicado que las células cebadas activadas liberan factores de crecimiento angiogénicos y reguladores, prostaglandinas, metaloproteinasas y citoquinas [14], y pueden desempeñar un doble papel en la promoción o la inhibición del crecimiento tumoral en función de las condiciones del estroma locales [15], [16]. De los tipos de células que residen en el microambiente tumoral, los neutrófilos asociados a tumores (Tans) han recibido poca atención [17]. Aunque hay evidencia que sugiere un papel para los neutrófilos en progresión de la enfermedad mayor en los tumores humanos específicos, la relación entre la infiltración de neutrófilos y el pronóstico en el cáncer humano no se ha investigado sistemáticamente [18]. El papel de los neutrófilos en la progresión del tumor sigue siendo controvertida [19] en gran parte debido a que estas células tienen ambas funciones de promoción de tumores y tumoricidas dependiendo de la presencia de factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) [20], [21].
a partir de estos estudios, es evidente que diversos mediadores de la inflamación se expresan diferencialmente en varios tipos de cáncer y pueden estimular la progresión de la enfermedad [22]. Así, los agentes que suprimen estos mediadores inflamatorios representan objetivos potenciales para el tratamiento del cáncer. La anexina anti-inflamatoria proteína 1 (ANXA1), un miembro de 37-kDa de la superfamilia de anexina, es una proteína de esteroides regulada que está implicada en la mediación de algunas de las actividades beneficiosas de glucocorticoides [23], incluyendo la regulación de la proliferación celular [ ,,,0],24], la diferenciación [25] y la metástasis [26].
la desregulación de ANXA1 se ha informado en varias neoplasias, lo que sugiere que esta proteína puede tener un papel importante en el desarrollo y progresión del tumor [27]. ANXA1 se sobreexpresa en el cáncer de mama [28] y el carcinoma hepatocelular [29], pero es notablemente las reguladas en el esófago [30], [31] y los carcinomas de cabeza y cuello [32]. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales ANXA1 modula las respuestas celulares no se han determinado completamente.
Los avances en este campo han mostrado una relación funcional entre las propiedades anti-inflamatorias de ANXA1 y receptor para formil-Met-Leu-Phe (fMLP) FPR [33], una clase específica de receptores 7-transmembrana acoplados a proteína G [34]. En los seres humanos, tres miembros de la familia han sido identificados, FPR1, fpr2 /ALX (FPRL1) y FPR3 (FPRL2) [35]. Algunos de los efectos de ANXA1 exógeno puede ser atenuada por Boc2, un antagonista de ambos FPR1 y fpr2 [33]. Recientemente, se ha demostrado que el péptido ANXA1 N-terminal, ANXA1
2-26, promueve la migración de los fibroblastos de piel humana WS1 [36], y la invasividad de 15 SKCO células de adenocarcinoma de colon [24] a través de la interacción con FPRs. Sin embargo, no hay datos disponibles sobre el papel de ANXA1 y FPRs en carcinoma de células escamosas de laringe.
Varias vías de señalización median la tumorigénesis asociada con la inflamación. Por ejemplo, la ciclooxigenasa-2 (COX-2), una enzima implicada en la conversión de ácido araquidónico en prostaglandinas, se considera que desempeñan papeles importantes en el desarrollo del cáncer mediante la modulación de la proliferación celular y otros procesos biológicos importantes a través de sus metabolitos, acoplado a proteína G receptores y efectores [37]. COX-2 es hasta reguladas en varias neoplasias [38] - [40], incluyendo los carcinomas de cabeza y cuello [41]. En realidad, Abrahao et al. (2010) han demostrado que el pro-inflamatoria COX-2 metabolito de la prostaglandina E2 y su receptor EP3 puede activar las células de carcinoma de cabeza y cuello para proliferar y es un objetivo potencial para los enfoques preventivos. Teniendo en cuenta que los glucocorticoides son inhibidores altamente eficaces de la COX-2 expresión [42], el A1 anexina proteína esteroide-regulada, que está implicado en la mediación de algunas de las actividades de los glucocorticoides, también pueden estar involucrados en la red inflamatoria vinculada a la COX-2.
Dado el papel potencial de ANXA1 en múltiples neoplasias tales como la regulación de la proliferación celular, la diferenciación y la metástasis, nos hemos centrado en los mecanismos moleculares por los cuales estos ANXA1 modula las respuestas celulares. En este informe, se demostró que la proteína ANXA1 es el regulado en el carcinoma de laringe humana y puede regular el crecimiento del tumor de una manera paracrina que está mediada por el receptor de fpr2 /ALX. Esta investigación demuestra la importancia potencial de esta interacción /fpr2 ANXA1 en la tumorigénesis. En general, este estudio identificó posibles funciones para el mecanismo molecular de esta interacción proteína en el cáncer de laringe, incluida su relación con la vía de la prostaglandina, proporcionando pruebas para el potencial de ANXA1 como diana terapéutica y puntos de partida prometedores para la investigación futura.
Materiales y Métodos
muestras de tejido
tejidos de cáncer de laringe invasivos humanos se obtuvieron de 20 pacientes con carcinoma de células escamosas de laringe que fueron tratados en el hospital de Base en São José do Rio Preto, Brasil . Los pacientes eran de sexo masculino, los fumadores alcohólicas, su edad oscilaba entre 50 y 80 años, y ninguno de ellos habían recibido radioterapia o quimioterapia antes de la intervención. En cada paciente (n = 20), las muestras tumorales quirúrgicos se recogieron desde el centro del tumor de laringe, las muestras peritumoral se obtuvieron de la periferia del tumor, y las muestras de control se obtuvieron de la región libre de células tumorales. Debido a la alta heterogeneidad de carcinoma de laringe, los tejidos tumorales fueron disecados y revisados por un patólogo senior y se caracterizaron como moderadamente diferenciados, carcinomas invasivos. Estas muestras de tejido se utilizaron en un estudio previo que se realizó en nuestro laboratorio, y el número de pacientes fue suficiente para obtener datos estadísticamente significativos [32]. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad Federal de Sao Paulo, Facultad de Medicina, Brasil (CEP-0300/08), y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes que participan.
Cell Cultura y
la línea de células Hep-2, que fue establecido originalmente de un carcinoma epidermoide de la laringe, se utilizó en el presente estudio (ATCC, Rockville, Maryland, EE.UU.). autentificación línea celular se realizó utilizando el Kit de AmpFLSTR Identifiler Amplificación por PCR (Life Technologies) en el Laboratorio de Técnicas especiales, Hospital Israelita Albert Einstein (LATE -HIAE), Sao Paulo. Encontramos 100% de identidad de nuestra línea celular en comparación con la base de datos American Type Culture Collection (ATCC). Las células se sembraron a una densidad de 2 × 10
6 células en un cm 75
2 frasco de cultivo (Corning, NY, EE.UU.) y se incubaron en medio MEM-Earle (Cultilab, Campinas, SP, Brasil) , pH 7,5, suplementado con suero de 20% de ternera fetal (Cultilab), aminoácidos no esenciales al 1%, y 0,1% de antibiótico /solución antimicótica (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.), a 37 ° C en una atmósfera húmeda de 5% de CO
2 [43].
Tratamiento de Drogas
Para los experimentos farmacológicos, se sembraron células Hep-2 como se ha descrito anteriormente. Veinticuatro horas más tarde, después de que las células ya se habían adherido, se incubaron en medio libre de suero para sincronizar el ciclo celular. Después de 24 horas adicionales, el medio se reemplazó con medio de crecimiento completo que contiene lo siguiente: (a) 1 M de ANXA1
2-26 péptido (Ac-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) (Invitrogen); (B) 1 M de ANXA1
2-26 péptido y 10 mM Boc2, un antagonista no selectivo FPR (N-t-BOC-MET-LEU-PHE) (MP Biomedicals, Aurora, OH); (C) 0,01 M dexametasona (un glucocorticoide; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.); (D) 0,01 M dexametasona y 10 mM Boc2; o (e) 10 M Boc2 solo. Los fármacos se disolvieron primero en pequeñas cantidades de dimetil sulfóxido (DMSO) y después se diluyeron en medio (la concentración final de DMSO no superó nunca 1%). Se seleccionaron las concentraciones de los fármacos basados en experimentos preliminares y datos de la literatura [32], [44]. Las células de control se trataron con medio completo con la misma concentración de DMSO utilizado para diluir los fármacos. Cada 2 días, el medio se reemplazó con medio fresco que contenía los fármacos en la misma dosis; la morfología de las células se observó cada día [43]. Después de 6, 24, 48, 72 y 96 horas, control y células tratadas se recogieron y se contaron usando el contador de células automatizado condesa (Invitrogen).
Fijación, producción, e incrustación de luz y microscopía electrónica de
muestras de laringe y Hep-2 células fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, glutaraldehído al 0,5% y tampón cacodilato 0,1 mol /l de sodio (pH 7,4) durante 24 horas a 4 ° C, lavados en cacodilato de sodio, se deshidrataron a través de porcentajes graduadas de etanol, y se incluyeron en LRGold (Londres Resina Co., Reading, Reino Unido). Para los análisis histopatológicos y morfológicas, las secciones de tejido (0,5-m de espesor) se cortaron en un ultramicrotomo (Reichert Ultracut; Leica, Austria), se tiñeron con 1% de azul de toluidina en solución de bórax al 1% (TAAB Laboratories, Aldermaston, Reino Unido) y se examinaron usando un microscopio Zeiss Axioskop 2-Mot Plus (Carl Zeiss, Jena, Alemania). Para la microscopía electrónica, las secciones (~ 90 nm) se cortaron en un ultramicrótomo y se colocan en rejillas de níquel para el etiquetado inmunoelectrónica [45].
Inmunoelectrónica Etiquetado de los tejidos embebidos-Post
reacción inmunocitoquímica
(doble etiquetado) se utilizó para detectar la expresión y la co-localización de ANXA1 y fpr2 /ALX en los mastocitos, neutrófilos, y células de control y tumorales de los tejidos de la laringe y células HEp-2.
las células Hep-2 eran incubaron con medio control, ANXA1
2-26 y ANXA1
2-26 + Boc2. Después de 48 horas, se recogió el cultivo, y las células se incrusta en resina LRGold de inmuno análisis. Los cortes ultrafinos de tejidos de la laringe y las células Hep-2 se incubaron en una manera paso a paso usando los siguientes reactivos y /o condiciones a temperatura ambiente: agua 1) destilada; 2) tampón de fosfato /L 0,1 mol que contiene 1% de albúmina de huevo (PBEA); 3) 0,1 mol /L de PBS que contenía 5% PBEA durante 30 minutos; 4) LCPS1 anticuerpo policlonal de oveja, generado contra el segmento N-terminal de ANXA1 (1:500 en PBEA) y anticuerpo policlonal de conejo fpr2 /ALX (Abcam, Cambridge, Reino Unido) (1:500 en PBEA) durante 2 horas; ovejas y de conejo normal sueros se utilizó como control (1:500); 5) de tres lavados en PBEA que contiene 0,01% de Tween 20; Se añadió 6), burro anti-IgG de oveja (fragmento Fc-específico) de anticuerpos (1:100 en PBEA) conjugado con oro coloidal de 15 nm (British Biocell, Reino Unido) para detectar ANXA1, y de cabra anti-IgG de conejo (fragmento Fc se añadió específicos de) anticuerpo (1:100 en PBEA) conjugada con oro coloidal 10 nm (British Biocell) para detectar fpr2 /ALX). Después de 1 hora, las secciones se lavaron en PBEA que contiene 0,01% de Tween 20, y luego en agua destilada [46]. Las secciones fueron teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo antes de su examen en un microscopio electrónico Zeiss 906 LEO (Carl Zeiss, Jena, Alemania).
Ensayos Multiplex
Para cuantificar las citoquinas pro-inflamatorias interleuquinas 6 (IL-6) y la IL-8, así como proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1), en los sobrenadantes de cultivo de células HEp-2, se utilizó el instrumento multiplex LUMINEX xMAP MAGPIX (Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU.) . Las células se incubaron con medio de control, ANXA1
2-26, ANXA1
2-26 + Boc2, Dexa, Dexa + Boc2 o Boc2. Después de 48 horas de tratamiento, los sobrenadantes de cultivo se retiraron, se centrifugaron y se almacenaron a -20 ° C. perlas de anticuerpo, controles, tampón de lavado, matriz de suero y los patrones se prepararon siguiendo las instrucciones del fabricante (kit MILLIPLEX HCYTOMAG-60K). A continuación, se añadieron 200 l de tampón de lavado a cada pocillo de una placa de 96 pocillos magnético y se mezcla en un agitador durante 10 min. El tampón de lavado se decantó y se añadieron 25 l de estándares, controles y muestras a los pocillos. A continuación, se añadieron 25 l de tampón de ensayo a las muestras, y se añadieron 25 l de matriz de suero a las normas. Finalmente, se añadieron 25 l de perlas magnéticas (recubiertas con un anticuerpo de captura específico) a todos los pocillos y se incubaron durante la noche a 4 ° C en un agitador. El día siguiente, la placa se lavó con tampón de lavado y se incubó con 25 l de anticuerpos de detección de 1 hora en un agitador. A continuación, se añadió 25 l de estreptavidina-ficoeritrina a cada pocillo y se incubó durante 30 minutos en un agitador. La placa se lavó y se incubó con 150 l de líquido de la transmisión de 5 minutos en un agitador. Por último, la placa fue analizada utilizando MAGPIX con el software xPONENT [47].
-PCR en tiempo real
Las células Hep-2 se incubaron con medio de control, ANXA1
2-26 o ANXA1
2-26 + Boc2 y se recogieron después de 48 horas. El ARN total se extrajo usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. El ADN genómico se eliminó por tratamiento con DNasa según la descripción del fabricante (Promega). Alícuotas (2 g) de ARN total de control y las células tratadas se utilizaron para la síntesis de ADNc de doble cadena utilizando un cDNA Archivo kit de alta capacidad (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuatro genes expresados diferencialmente (
EP3
o
PTGER3
,
EP4
o
PTGER4
,
MMP2
y
) fueron seleccionados para cuantitativa en tiempo real PCR experimentos en función de su participación directa o indirecta en los procesos inflamatorios y metastásicos basado en la base de datos de ontología de genes (http://www.geneonthology.org/). PCR en tiempo real se realizó por triplicado usando un sistema de PCR en tiempo real Fast 7500 (Applied Biosystems). La mezcla de reacción consistía en una solución de volumen total de 20 l que contiene 10 l de energía SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), una solución 1 M de cada cebador y 20 ng de cDNA. Las condiciones de PCR fueron 50 ° C durante 2 min y 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. análisis de la curva de fusión se llevó a cabo para cada gen para comprobar la especificidad y la identidad de los productos de RT-PCR. Para cada conjunto de cebadores, se midieron las eficiencias de la PCR en tiempo real (E) por triplicado en diluciones en serie de la misma muestra de ADNc utilizando la fórmula E = [10 (-1 /pendiente)]. Los valores resultantes varió de 1,96 a la de 2.02. Cada nivel de transcripción se normalizó con el patrón interno
GAPDH
, y los valores eran log2-transformado (eje y) de manera que todos los valores por debajo de -1 indica la baja regulación de la expresión génica, mientras que los valores por encima de 1 representado sobre regulación en comparación con las células de control [43].
Análisis estadístico
los valores relativos a la cuantificación de los mastocitos y neutrófilos de las muestras de tejido in vivo se expresaron como la media ± SEM de el número de células por mm
2 en tres secciones de 0,5 m (dejando un espacio de 40 m entre cada sección) para cada paciente (n = 20 pacientes).
se contaron
células HEp-2 usando el contador de células automatizado condesa (Invitrogen). La concentración de las citocinas se determinó usando software MAGPIX Xponent (Millipore Corporation). El análisis in vitro se repitieron un mínimo de tres veces.
La expresión ultraestructural e inmunocitoquímica de ANXA1 y fpr2 se determinó usando diez celdas para cada grupo investigado. El área de cada compartimiento de células se determinó usando el software de imágenes Axiovision (Zeiss). En el núcleo y el citoplasma, la densidad de las partículas de oro coloidal se calculó como la media ± SEM de la cantidad de partículas por m
2. En la membrana plasmática, la densidad de las partículas de oro coloidal se calculó como la media ± SEM de la cantidad de partículas por m.
Las diferencias significativas entre las medias se determinaron mediante análisis de la varianza. Esta prueba fue seguida por la prueba post-hoc de Bonferroni en los grupos experimentales seleccionados utilizando Graph-Pad Prism 4.0 (Graph-Pad, San Diego, CA, EE.UU.). Un valor de probabilidad inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Resultados
La presencia de células cebadas y degranulated una afluencia de neutrófilos Indica La inflamación en el microambiente tumoral
Para verificar la interacción de las células inflamatorias con células tumorales de la laringe, se realizó un análisis histológico en muestras de tejido laringe para cuantificar las células y neutrófilos mastocitos, células importantes de la respuesta inflamatoria. En las muestras de control, se observó mastocitos intactas con gránulos metacromática en las cercanías de los vasos sanguíneos (fig. 1A). En el estroma peritumoral y tumor, se verificó la presencia de mastocitos desgranulados (Fig. 1, B y C). Además, se observó que había neutrófilos trasmigrados en secciones tumorales (Fig. 1D).
(A-D) Imágenes representativas (aumento original, × 63) de las secciones de tejidos teñidos con azul de toluidina a partir de muestras de laringe. (A) El control de muestras de laringe que muestra los mastocitos intactas (flechas curvas) cerca de los vasos sanguíneos. Peritumoral (B) y el tumor (C) las muestras con los mastocitos desgranulados (flechas curva abierta). (D) Las células tumorales con actividad mitótica (flecha abierta) y células inflamatorias, como los neutrófilos extravasculares (flechas). (E) Número total de mastocitos. (F) mastocitos intacto y degranulated. (G) Número total de neutrófilos. (H) y los neutrófilos intravasculares extra. Los datos se expresan como la media ± SEM del número de células por mm
2 (n = 20 pacientes por grupo). ANOVA de un factor seguido por el test de Bonferroni reveló una diferencia significativa entre los grupos. ***
P Hotel & lt; 0,001
vs
de control, ###
P Hotel & lt;.. 0,001
vs
peritumoral. Las barras de escala:. 5 micras
El análisis estadístico mostró que había un gran número de mastocitos en las secciones de control de la laringe y número significativamente menor de mastocitos en las regiones peritumoral y tumorales (
& lt; 0,001; Fig. 1E). Además, los mastocitos intactas fueron más abundantes en las muestras de control y significativamente menor en las secciones peritumoral y tumorales (
P
& lt; 0,001; Fig. 1F). Utilizando el análisis cuantitativo de los neutrófilos, se verificó que no hubo un aumento significativo de estas células en los tejidos tumorales (
P
& lt; 0,001) en comparación con el control y los tejidos peritumorales (Fig 1G.). El examen de los neutrófilos en el control y las secciones peritumoral mostró que la mayoría de estas células fueron localizados en los vasos sanguíneos (Fig. 1H). Por el contrario, en las muestras tumorales, se observó un número significativo de neutrófilos transmigradas en el estroma (
P
& lt; 0,001 en comparación con el control y las muestras peritumoral). (Fig. 1H)
Hasta -Regulación de ANXA1 /fpr2 en las células inflamatorias de laringe humano los tumores
ultraestructural inmunocitoquímica demostraron por primera vez la expresión de fpr2 /ALX y su co-localización con ANXA1 en los mastocitos (Fig. 2, A- DO). Los mastocitos y neutrófilos muestran ANXA1 y inmunorreactividad fpr2 /ALX en la membrana plasmática, el citoplasma y el núcleo (Fig. 2, A-F). No inmunomarcaje se detectó en las secciones que se incubaron con suero no inmune (datos no mostrados). En estas células inflamatorias, se verificó una significativa regulación de la expresión ANXA1 y fpr2 /ALX en las muestras tumorales y peritumoral en comparación con los tejidos de control correspondientes (Fig. 2, G-L).
Immunolabeling con 10 -nm (fpr2 /ALX) y partículas de oro coloidal de 15 nm (ANXA1). Los mastocitos (A-C) y neutrófilos (D-F) que muestran la localización subcelular de ANXA1 (flechas) y fpr2 /ALX (puntas de flecha), y co-localización (flechas curvas) en la membrana plasmática, el citoplasma y el núcleo (N) de de control, peritumoral y tumorales tejidos. Densidad de partículas de oro conjugadas con ANXA1 y fpr2 /ALX en los mastocitos (G-I) y los neutrófilos (J-L). Los datos se expresan como la media ± SEM de partículas de oro coloidal por m en la membrana plasmática y por m
2 en el citoplasma y núcleo de las células (n = 10 células por grupo). ANOVA de un factor seguido por el test de Bonferroni reveló una diferencia significativa entre los grupos. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001
vs
de control, ##
P Hotel & lt; 0,01, ###
P
. & lt; 0,001
vs
peritumoral. Teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo. Barras de escala: 1 micras
El análisis cuantitativo reveló que hay una mayor expresión de ANXA1 y su receptor en el citoplasma y el núcleo en comparación con la de la membrana plasmática (Fig 2, G-L.).. se observó co-localización de ANXA1 y fpr2 /ALX en la membrana plasmática, el citoplasma y el núcleo de las células cebadas y los neutrófilos (Fig 2, G-L.); sin embargo, hubo diferencias significativas sólo en la membrana plasmática de los neutrófilos peritumoral (Fig. 2J).
ANXA1
2-26 Inhibe fpr2 /ALX mediada por el receptor de células Hep Proliferación-2 cáncer de laringe
Aproximadamente el 87% y el 97% de las células Hep-2 eran viables en las condiciones experimentales (control, ANXA1
2-26, ANXA1
2-26 + Boc2, Dexa, Dexa + Boc2 y Boc2) ( Figura S1). Sin embargo, la curva de crecimiento de estas células mostró diferencias significativas entre las condiciones estudiadas (Fig. 3).
El tratamiento con ANXA1
2-26 redujo el crecimiento celular. El antagonista Boc2 inhibió parcialmente el efecto antiproliferativo de ANXA1
2-26. Las células tratadas con Boc2 solo mostraron un nivel de la proliferación similar a la del control. Las células Hep-2 se sembraron en medio MEM-Earle a una densidad de 2 × 10
6 células en 75 cm-
2 frasco de cultivo, y luego se incubaron con 24 horas medio libre de suero antes de la adición de ANXA1
2-26 (1 M), ANXA1
2-26 (1 M) + Boc (10 M) o Boc (10 M) solo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado para confirmar los resultados. Los datos se expresan como la media ± SEM del número de células × 10
6. **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0,001
vs
de control, ##
P
. & Lt; 0,01 y###
P Hotel & lt; 0,001
vs
ANXA1
+ 2-26 Boc
el tratamiento con el péptido ANXA1
2-26.. redujo significativamente la proliferación de células cancerosas Hep-2 laríngeos en comparación con las células de control (
P
& lt; 0,001 a 48 y 96 horas, y
P
& lt; 0,01 a 72 horas). Se obtuvieron resultados similares después del tratamiento con DEXA y Dexa + Boc2 (S2 Figura). Sin embargo, el tratamiento combinado con ANXA1
2-26 y Boc2 (ANXA1
2-26 + Boc) el crecimiento celular aumentada significativamente en comparación con
2-26 tratados con células ANXA1 (
P & lt
; 0,01 a las 48 y 72 horas, y
P
& lt; 0,001 a 96 horas), lo que demuestra que Boc2 atenúa la actividad antiproliferativa de ANXA1
2-26. Boc2 células tratadas tenían una tasa de proliferación que era similar a la de las células control (Fig. 3).
pérdida de proteínas ANXA1 /fpr2 en los tejidos tumorales de laringe y sobre regulación después de
in vitro
el tratamiento con el ANXA1
2-26 péptido
las células epiteliales de control, tejidos laríngeos peritumoral y tumorales muestran inmunoreactividad a ANXA1 y fpr2 /ALX, así como co-localizaciones de las proteínas, en el membrana plasmática, el citoplasma y el núcleo (Fig. 4, A-C). En las muestras peritumoral y tumorales, se observó una marcada reducción de ANXA1 y expresión de proteínas fpr2 /ALX en comparación con los tejidos de control correspondientes (Fig. 4, H y I). El análisis cuantitativo reveló que había una mayor expresión de ANXA1 y su receptor en el citoplasma y el núcleo y una menor expresión en la membrana plasmática (Fig. 4, G-I). Las diferencias en el grado de ANXA1 /fpr2 co-localización no alcanzaron significación estadística entre las muestras de laringe (Fig. 4, G-I).
Immunolabeling con 10 nm (fpr2 /ALX) y 15 nm (ANXA1) partículas de oro coloidal. (A-C) de control epitelial, las células tumorales y peritumorales de los tejidos de la laringe. (D-E) células Hep-2 que muestran inmunoreactividad a ANXA1 (flechas), fpr2 (puntas de flecha), y co-localizaciones (flechas curvas) en la membrana plasmática, citoplasma y núcleo (N). Desmosomas (flechas curvas abiertas) se detectan entre estas células. (F) La ausencia de inmunorreactividad a ANXA1 y fpr2 /ALX en las células incubadas con suero no inmune. Densidad de partículas de oro conjugadas con ANXA1 y fpr2 /ALX en las células epiteliales (G-I) y células Hep-2 (J-L). Hep-2 células fueron sembradas en medio MEM-Earle a una densidad de 2 × 10
6 células en 75-cm
2 frascos de cultivo, y luego se incubaron con medio libre de suero 24 horas antes de la adición de ANXA1
2-26 (1 M) y ANXA1
2-26 (1 M) + Boc2 (10 mM). Los datos se expresan como la media ± SEM de partículas de oro coloidal por m en la membrana plasmática y por m
2 en el citoplasma y núcleo de las células (n = 10 células por grupo). ANOVA de un factor seguido por el test de Bonferroni reveló una diferencia significativa entre los grupos. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001
vs
control,#
P Hotel & lt; 0,05, ##
P Hotel & lt; 0,01, ###
P Hotel & lt; 0,001
vs
ANXA1
2. 26. Teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las barras de escala:. 1 micra
células Hep-2 que fueron tratados con ANXA1
2-26 o ANXA1
2-26, más Boc2 mostró inmunoreactividad para ANXA1 y fpr2 /ALX (Fig . 4, D y e). se detectó co-localización de las dos proteínas en la membrana plasmática, el citoplasma y el núcleo de estas células, pero no en las células tratadas con Boc2 (Fig. 4, D y E). No etiquetado oro se detectó en las células que se incubaron con suero no inmune (Fig. 4 F). expresión ANXA1 /fpr2 se había reducido regulado en la membrana plasmática, pero se incrementó en el citoplasma y núcleo de células Hep-2 (Fig. 4, J-L). El tratamiento con ANXA1
2-26 muestra la regulación de ANXA1 y fpr2 en el citoplasma y el núcleo en comparación con las correspondientes células de control (Fig. 4, J-L). Además, se detectó una marcada reducción de la proteína ANXA1 y su receptor después de ANXA1
2-26 + tratamiento Boc2 comparación con las células
2-26 tratados con ANXA1 (Fig. 4, J-L).