Extracto
La inflamación juega un papel directo en la progresión del cáncer colorrectal (CRC); sin embargo, los mecanismos moleculares responsables de este efecto no están claros. La inflamación inducida por la ciclooxigenasa 2 (COX-2) enzima necesaria para la producción de prostaglandina E2 (PGE
2), puede promover el cáncer colorrectal por la disminución de la expresión del gen supresor de tumor celular programada muerte 4 (PDCD4). Como PDCD4 es también un objetivo directo del oncogén microRNA-21 (miR-21) se determinó la relación entre la COX-2 y miR-21 vías en la progresión del cáncer colorrectal. perfil de expresión de genes en el tumor y la mucosa normal emparejado de 45 pacientes con CRC demostró que la regulación de la COX-2 y miR-21 en el tejido tumoral se correlaciona con la etapa peor de Dukes. Los estudios in vitro en células de adenocarcinoma de colon reveló que el tratamiento con el fármaco inhibidor de COX-2 inhibidor NS398 disminuyó significativamente miR-21 niveles (p = 0,0067) y el aumento de PDCD4 los niveles de proteína (p & lt; 0,001), mientras que el tratamiento con PGE
2 arriba regulada miR-21 expresión (p = 0,019) y la proteína PDCD4 las reguladas (p & lt; 0,05). Estos hallazgos indican que miR-21 es un componente de la vía de la inflamación de la COX-2 y que esta vía promueve empeoramiento de la etapa de la enfermedad en el cáncer colorrectal mediante la inducción de la acumulación de PGE
2 y el aumento de la expresión de miR-21, con la consiguiente regulación a la baja de la genes supresores de tumores PDCD4
Visto:. Peacock O, Lee CA, Cameron M, R Tarbox, Vafadar-Isfahânî N, Tufarelli C, et al. (2014) La inflamación y miR-21 Rutas Funcionalmente Interact regular a la baja PDCD4 en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (10): e110267. doi: 10.1371 /journal.pone.0110267
Editor: Kalpana Ghoshal, La Universidad Estatal de Ohio, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Julio, 2014; Aceptado 10 de septiembre de 2014; Publicado: 13 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Peacock et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del documento y su información de apoyo
Financiación:. El trabajo fue apoyado por una donación del Fondo para el Cáncer Colorrectal Derby. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es la tercera causa más común de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1]. Aproximadamente la mitad de todos los pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal en última instancia, morir de la enfermedad [2]. La tasa de supervivencia de cinco años ha aumentado a aproximadamente 50-55%, lo que se atribuye principalmente a un diagnóstico más precoz y una mejor adaptación de los tratamientos [3]. La muerte por cáncer colorrectal se puede prevenir mediante la detección de enfermedad en estadio temprano, pero por desgracia, a menudo se detecta en una etapa avanzada, cuando el pronóstico es peor [4]. El pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal se asocia con el estadio de la enfermedad en el momento del diagnóstico.
La exacta "disparador" para el desarrollo de cáncer colorrectal sigue siendo desconocido. En 1990, se propuso una serie de pasos morfológicos conocidos como la secuencia de mucosa-adenoma-adenocarcinoma normal en el cáncer colorrectal debido a alteraciones genéticas [5]. Sin embargo, muchos eventos genéticos conducen al desarrollo de cáncer colorrectal esporádico; ningún caso solo se produce en todos los cánceres y por lo tanto hay un patrón único es aplicable a todos los tumores [6]. Por lo tanto, la comprensión de los eventos genéticos específicos que se producen en la carcinogénesis colorrectal pueden tener implicaciones importantes para el diagnóstico, el pronóstico y, potencialmente, la terapia génica en el futuro.
Ha habido un resurgimiento reciente en el interés en la relación de causalidad entre la inflamación y el cáncer. Estudios epidemiológicos han demostrado que la inflamación crónica predispone a los individuos a diversos tipos de cáncer [7]. Se estima que el 15% y el 20% de todas las muertes por cáncer en todo el mundo están relacionados con infecciones crónicas subyacentes y las respuestas inflamatorias dentro de tales individuos [7]. Hay evidencia de estudios en animales y observaciones en seres humanos que una aspirina al día podría ser eficaz en la prevención de varios tipos comunes de cáncer [8], [9]. Esto ha sido confirmado recientemente en los estudios de seguimiento de los pacientes reclutados originalmente para ensayos aleatorios de aspirina a diario frente al control en la prevención de eventos vasculares [10] - [12]. En estos ensayos, la asignación a la aspirina resultó en una reducción del 40% en las muertes por cáncer a partir de 5 años en adelante [11] y una reducción sostenida de la muerte relacionada con el cáncer a los 20 años de seguimiento [10], [12]. Los estudios observacionales también han demostrado que el uso de aspirina se asoció con una reducción de metástasis a distancia y la recurrencia en los adenocarcinomas comunes [13] - [15]., lo que sugiere que la inflamación podría desempeñar un papel en la progresión, así como en el desarrollo de cáncer de
una de las posibles razones de los efectos preventivos de quimioterapia observados de la aspirina en el cáncer colorrectal es su capacidad para reducir el desarrollo de tumores mediante la inhibición de la ciclooxigenasa 2 (COX-2) [16]. Cada vez hay más pruebas que relacionan la enzima pro-inflamatoria de la COX-2 con el desarrollo y progresión del cáncer colorrectal. COX-2 se induce en el epitelio del colon en la enfermedad activa del intestino inflamatorio (IBD) [17] y sus resultados de la regulación de los niveles elevados de prostaglandina (PG), en particular PGE
2 que es un mediador aguas abajo de la COX-2 y promueve muchas vías cancerígenas incluyendo la proliferación celular, la inhibición de la apoptosis y la angiogénesis [18]. Esto contribuye al proceso inflamatorio crónico orquestar un microambiente tumoral de apoyo, que une la inflamación adicional a la carcinogénesis.
La unión mecánica entre la inflamación y el cáncer aún no está completamente claro. La evidencia creciente sugiere que las micro-ARN (miARN) están involucrados en la regulación de procesos inflamatorios y se desregula en condiciones inflamatorias [19], incluyendo la colitis ulcerosa [20]. Por lo tanto miRNAs desregulación representa un mecanismo molecular potencial de las vías inflamatorias para mediar en el desarrollo y progresión del cáncer [21]. En particular, los niveles de expresión de miR-21 se incrementan en la inflamación en la colitis ulcerosa activa, que puede estar asociada con el aumento del riesgo de desarrollo de cáncer con esta condición [22]. Sobre regulación de miR-21 también ha sido reportado en otros estados inflamados incluyendo la inflamación alérgica de las vías respiratorias [23], las condiciones inflamatorias de la piel [19] y el cáncer gástrico
Helicobacter pylori servicios asociados [24]. miR-21 se ha demostrado recientemente ser un oncogén genuina en el linfoma de células pre-B [25] y se encontró que sobre-expresan en la mayoría de los tipos de tumores [26]. miR-21 es un potente estimulador de tejido y la invasión vascular en el cáncer colorrectal y estos efectos aparecen en parte mediada por su capacidad para prevenir la traducción de uno de los miR-21 genes diana, la muerte celular programada 4 (PDCD4) [27]. Más recientemente, un estudio ha mostrado también significativa la baja regulación de PDCD4 en la EII activa en comparación con inactiva la EII, que también se correlacionó con la sobre regulación de miR-21 [28], más el apoyo a la relación entre la inflamación, el miR-21 y la carcinogénesis.
Nuestro objetivo era investigar si existe una interacción funcional entre la COX-2 (enzima proinflamatoria con una mayor expresión en CRC) y miR-21 (MIR oncogénico sobreexpresado en CRC) vías que conducen a la regulación por disminución del tumor supresor de PDCD4 en el cáncer colorrectal no asociado con enfermedad inflamatoria crónica anterior.
Materiales y Métodos
los tejidos humanos
Este estudio recibió la aprobación ética del Comité ético de Investigación para la recogida de Derbyshire tejido de cáncer colorrectal e igualó la mucosa normal de los pacientes que fueron sometidos a resección quirúrgica para el cáncer colorrectal entre agosto y diciembre de 2010 en el hospital Royal Derby, Derby, Reino Unido.
a todos los pacientes con diagnóstico de cáncer colorrectal se discutieron en el Derby hospital Real colorrectal Reunión del Equipo Multidisciplinar después de la estadificación radiológica, y las que crea conveniente para la resección con intención curativa fueron elegibles para su inclusión. consentimiento informado por escrito fue tomado y pacientes que no pueden o no están dispuestos a dar su consentimiento informado fueron excluidos del estudio, al igual que aquellos retirar el consentimiento en cualquier momento.
Cell Cultura y
La línea celular HCA-7 se obtuvo de la Colección de Cultivos Agencia de Protección Sanitaria (HPACC, Porton Down, Reino Unido). Las células se cultivaron en Eagle Modificado de medios de Dulbecco (DMEM) (Gibco, Paisley, UK) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido), 2 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich, Poole, UK), penicilina ( 50 unidades /ml) y estreptomicina (50 mg /ml) (Sigma-Aldrich). Las células fueron cultivadas en 75 cm
3 matraces ventilados (ZTS Científicas, Framingham, MA, EE.UU.) en incubadoras humidificadas a 37 ° C con 5% de CO
2 (Sanyo, Osaka, Japón).
Línea celular y transfecciones tratamientos
Las células se sembraron a 500.000 células /pocillo en una placa de 6 pocillos y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 hasta que alcanzaron el 70% de confluencia.
Para los estudios de miR-21 de inhibición, las células fueron transfectadas con el miR-21 inhibidor (100 nM) o una negativa revueltos de control (100 nM) (miRIDIAN, Dharmacon Lafayette, CO, EE.UU.), utilizando Dharmafect 2 reactivo de transfección de lípidos (Dharmacon Lafayette, CO, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
para la inhibición de COX-2, las células se trataron con medio libre de suero que contiene el control (0,1% DMSO) o 100 NS398 mu M (inhibidor selectivo de la COX-2, Cayman Chemical, Michigan , EE.UU.) durante 72 horas. Para prostaglandina E tratamiento
2 (PGE
2), las células se cultivaron 24 horas con medio libre de suero que contienen vehículo DMSO solo o 1 mM PGE
2 de modo que la concentración final de DMSO en ambas condiciones era la misma (0,1%). Para la inhibición de miR-21 combinado y PGE
2 de tratamiento, se añadió PGE
2 al cultivo 48 horas después de la transfección de miR-21 y el inhibidor de las células se cultivaron durante 24 horas más.
análisis de ARN
extracción de ARN total se realizó utilizando el reactivo TRI siguiendo el protocolo del fabricante (Sigma-Aldrich) y se cuantificó usando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, dE, EE.UU.)
.
Para el MIR -21 estudios, con un total de 6 ng de ARN total fue utilizado para transcripción inversa de miR-21 y el control RNU44 en ADNc siguiendo el protocolo TaqMan miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), utilizando cebadores dirigidos a la horquilla de miR-21 y RNU44 como control en un termociclador (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) durante 30 minutos a 16 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 min a 85 ° C. a continuación, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real se realizó mediante ensayos de miRNAs TaqMan sonda específica (miR-21, ID 000397; RNU44, ID 001094; Applied Biosystems) en un termociclador Chromo4 (Bio-Rad Laboratories Ltd, Hemel Hempstead, Reino Unido). miR-21 niveles de expresión se normalizaron a RNU44 y se calculan utilizando la 2
-ΔΔCt método [29] utilizando comercialmente disponible ARN normal del colon como calibrador.
En
de la COX-2 y
PDCD4
análisis, 30 ng de ARN total fue convertido a cDNA con hexámeros aleatorios usando los ADNc de alta capacidad TaqMan transcripción reversa protocolo (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). PCR en tiempo real se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante en un termociclador en tiempo real Chromo4 (Bio-Rad Laboratories Ltd) utilizando comercialmente disponibles 20x ensayos TaqMan (Applied Biosystems) para
PDCD4 gratis (Hs00377253_m1) y
COX 2 gratis (PTGS2 - Hs00153133_m1), junto con los genes de control
GAPDH gratis (Hs02258991_g1),
PGK1 gratis (Hs00943178_g1) y
HPRT gratis (Hs01003267_m1). Para los experimentos en líneas celulares, la cuantificación se realizó de acuerdo a MIQE (Información mínima para Publicación de experimentos cuantitativa en tiempo real PCR) directrices [30] con respecto a la media geométrica de los genes de referencia
GAPDH
,
PGK1
,
HPRT
usando el software Genex (Análisis multid; Göteborg, Suecia). Debido a las cantidades de muestra limitada, en la expresión de los tejidos humanos se cuantificó con relación a
GAPDH
solo como se describe anteriormente para el miR-21 análisis.
análisis de proteínas
extracciones y cuantificación de proteínas eran realizado como se describe anteriormente [31]. Western Blot se realizó utilizando el anticuerpo anti-actina beta de control de carga (1:1000 dilución; Abcam, Cambridge, Reino Unido) en combinación con anti-anticuerpo PDCD4 (1:500 dilución; Sigma-Aldrich) o anti-COX-2 (1 :1000 dilución; Abcam). anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina se usó como anticuerpo secundario (dilución 1:30,000; DAKO, Ely, Reino Unido) para la detección de la unión del anticuerpo primario. Los inmunocomplejos se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada utilizando el kit ECL (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El sistema ChemiDoc se utiliza para capturar imágenes y un software Cantidad (Bio-Rad) se utilizó para la cuantificación de las intensidades de las bandas.
Análisis Elisa
PGE
2 niveles se midieron en el medios de HCA-7 células tratadas y no tratadas utilizando el kit de PGE
2 ELISA de detección (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las placas se leyeron con un photocytometer placa a 450 nm (Wallac 1420 Victor; Perkin-Elmer, Waltham, MA, EE.UU.).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism versión 5.03 ( GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). La prueba de Kolmogorov-Smirnov demostró todos los datos de la muestra de tejido a ser no paramétrico y todos los datos de la línea celular sea paramétrico. Por lo tanto los datos del paciente se expresa como mediana y rango, mientras que los datos línea de células se expresa como media y error estándar de la media. El signo de Wilcoxon-rank test (datos apareados); la prueba de Mann-Whitney (sin pareja) y la prueba de Kruskall-Wallis se utilizaron para el análisis comparativo de los datos del paciente. La prueba t pareada (datos apareados); el t-test (sin pareja) y la prueba de ANOVA se utilizaron para el análisis comparativo de los datos de la línea celular.
La significación estadística se determinó a p = 0.05 para los datos tanto de líneas celulares de pacientes y de.
Resultados
aumento de miR-21 se relaciona directamente con aumento de los niveles de ARNm de la COX-2 en pacientes de CRC
Hemos realizado nuestro estudio sobre el tejido de cáncer colorrectal primario y mucosa normal pareados recogidos entre agosto y diciembre de 2010 de 45 pacientes electivos con casos esporádicos de CRC. Una base de datos mantenida prospectivamente se rellena con datos demográficos del paciente, terapias neoadyuvante y las características del tumor. La histopatología del tumor se clasifica de acuerdo con el conjunto mínimo de datos nacional para el cáncer colorrectal diseñado por el Real Colegio de Patólogos, Reino Unido [32]. Ningún paciente fue excluido o se habían retirado del estudio y ninguno tenía enfermedad benigna. La mediana de edad fue de 69 (51-88) años alcance y la mayoría eran pacientes del sexo masculino. Cuatro pacientes con cáncer de recto que recibieron quimio-radioterapia neoadyuvante también se incluyeron basan en estudios previos que demuestran que la expresión de miR-21 es equivalente entre el tejido irradiado no irradiado y [33]. Todos los pacientes tenían una resección completa e histología confirmaron todos los tumores fueron adenocarcinomas. (Tabla S1 y S2 en S1 Archivo)
El uso por tiempo real RT-PCR se estudió la expresión de
de la COX-2
y miR-21 en los tejidos tumorales en comparación con la mucosa normal en nuestra cohorte de pacientes con CRC. Relativo expresión de miR-21 fue significativamente hasta reguladas en el tejido CRC en comparación con la mucosa normal correspondiente (p & lt; 0,0001, Wilcoxon-rank test pares firmados; Fig. 1A). Por otra parte, los niveles de expresión de miR-21 se correlacionaron con las características clínico-patológicas de uso común para el CRC (Tabla 1). De la expresión de miR-21 en los tejidos tumorales correlaciona significativamente con la etapa peor de Dukes (p & lt; 0,0001, prueba de Kruskall-Wallis; Fig. 1B), metástasis a los ganglios linfáticos (p & lt; 0,0001, prueba de Mann-Whitney; Fig. 1C) , y la profundidad de la invasión tumoral (estadio pT; p & lt; 0,0001, Mann-Whitney U test; Fig. 1D). Estos resultados están de acuerdo con los informes anteriores [34], [35], y confirme que el miR-21 es hasta reguladas en el CCR con el aumento de los niveles de expresión se correlaciona con una mayor gravedad de la enfermedad.
gráficos de barras que indican la columna la mediana y los bigotes demuestran la RIC de miR-21 expresión. Tenga en cuenta que un aumento significativo en la expresión de miR-21 se observa en los tumores, y esto aumenta aún más con el empeoramiento etapa, compromiso de ganglios linfáticos y la profundidad de la invasión. La significación estadística se calculó mediante la prueba de Wilcoxon signed-rank en A, la prueba de Kruskall-Wallis en B, y la prueba de Mann-Whitney U en C y D.
Expresión relativa de
PDCD4
fue significativamente las reguladas en los tejidos de CRC en comparación con la mucosa normal correspondiente (p & lt; 0,0001, prueba de rangos de Wilcoxon de pares relacionados firmado; Fig. 2A). Sin embargo, no hubo correlación entre el
PDCD4
expresión en tejidos tumorales y la etapa de los duques, con la expresión en la etapa Dukes'A ya ser significativamente reducido en comparación con el tejido normal y no más allá disminución observada en las fases más avanzadas ( la Fig. 2B). Es poco probable que la regulación a la baja observada de
PDCD4
a nivel del ARN es causada por miR-21 dado que este micro-ARN actúa para prevenir la traducción del ARNm PDCD4 en lugar de inducir su degradación o represión transcripcional [27]. Dado que todos los pacientes estudiados realizaron los tumores malignos con una etapa de Dukes asignado ', los datos sugieren que durante la progresión de la malignidad cantidades crecientes de miR-21 conduce a la inhibición de la traducción de la ya disminución de los niveles de
PDCD4
ARNm. Ética limitaciones nos impidieron el análisis de los niveles de proteína PDCD4 en estos pacientes para confirmar esta hipótesis y que recurrieron a
in vitro
estudios para obtener conocimientos sobre mecánica (véase la sección siguiente).
Combinado expresión relativa de PDCD4 y COX-2 se analizó en el tumor primario en comparación emparejado mucosa normal adyacente (n = 45; a y C, respectivamente) los tejidos, y, en normal (N) y tumorales (T) de un Dukes '(n = 9), B (n = 23) y C (n = 13) etapas (B y D respectivamente). El gráfico de barras columna indica la mediana y los bigotes demostrar la IQR de expresión mRNA. La significación estadística se calculó mediante la prueba de Wilcoxon signed-rank en A y C; la prueba de Kruskall-Wallis en B y D. Tenga en cuenta que
PDCD4
está regulado por disminución en el tumor en comparación con lo normal, pero no se observan diferencias en la expresión que queda en tumores de diferentes etapas de Dukes. Por el contrario
de la COX-2
niveles aumentan en el tumor y con el estadio de la enfermedad.
Curiosamente, la expresión relativa de
de la COX-2
mRNA fue significativamente hasta regulado en tejidos tumorales en comparación con su mucosa emparejado normal (p & lt; 0,0001, Wilcoxon de pares relacionados firmados prueba de rangos; Fig. 2C). Por otra parte, de manera similar a lo observado con el miR-21, la expresión relativa de
de la COX-2
mRNA en tejidos tumorales se correlacionaron significativamente con la etapa peor de Dukes (p & lt; 0,0001, prueba de Kruskall-Wallis; Fig. 2D) . Dado que el miR-21 y la inflamación ambos se han demostrado disminuir los niveles de proteína PDCD4 [27], [36], una posible interpretación de estos resultados es que el aumento de miR-21 y
de la COX-2 puede ser funcionalmente
relacionadas y que podrían conducir a la regulación a la baja de PDCD4 a través de una vía común.
células HCA-7 son un sistema adecuado para el análisis de la relación entre el miR-21 y la COX-2 sobreexpresión en CRC
para investigar más a fondo el potencial de una relación funcional entre la COX-2 y miR-21 en la baja regulación de PDCD4 en el CCR que se recurrió a un
in vitro
sistema de cultivo celular in. Elegimos la línea de colon células de adenocarcinoma humano HCA-7 aislado de tumores B de Dukes [37], ya que tiene altos niveles endógenos de la COX-2 [38] y después del tratamiento con el inhibidor de la COX-2 NS398 aumenta la expresión de
PDCD4
[39]. Con el fin de determinar si las células HCA-7 son un buen sistema para estudiar la relación funcional entre el miR-21 y la COX-2 vías, primero necesitamos determinar si el miR-21 se expresa y es responsable de
PDCD4
regulación a la baja en estas células. Para lograr estos se utilizó RT-PCR para estudiar los niveles de miR-21 en las células no tratadas HCA-7 o en células tratadas con 100 nM de un inhibidor o scramble control de miR-21 basado en el trabajo publicado que muestra que esta concentración es no citotóxico y eficaces en estudios de inhibición [40]
Hemos encontrado que miR-21 se expresa en altos niveles en las células HCA-7 y estos niveles no están afectadas por el tratamiento con scramble ARN pequeños pero se redujo significativamente (p & lt;. 0,0001 , t-test no pareado) después de un tratamiento de 72 horas con un miR-21 pequeño inhibidor específico de ARN (Fig. 3A). No hay diferencias significativas en los niveles de ARNm de PDCD4 se observaron mediante RT-PCR cuantitativa en cualquiera de las condiciones de tratamiento (Fig 3B.); por el contrario, se observó un aumento significativo (p = 0,002, prueba t no pareada) en PDCD4 a nivel de proteínas por transferencia de western en las células-21 de miR inhibidor tratados en comparación con las células tratadas de control no tratadas o revueltos. Estos resultados son consistentes con miR-21 que actúa para inhibir la traducción de ARNm PDCD4 en lugar de dirigir su degradación y confirman que miR-21 juega un papel en la regulación a la baja en las células PDCD4 HCA-7. Por lo tanto, tanto los de la COX-2 y miR-21 vías contribuyen a la regulación a la baja de PDCD4 en las células HCA-7, por lo que un sistema adecuado en el que estudiar si existe una relación funcional entre las dos vías.
Después de 72 horas de transfección disminución significativa en los niveles de miR-21 se observan sólo en las células transfectadas con el miR-21 inhibidor (a).
PDCD4
niveles de ARNm no se vieron afectados por la inhibición de miR-21 (B). El análisis de transferencia Western de PDCD4 (panel superior C para una transferencia representativa) revela un aumento significativo en los niveles de proteína en las células transfectadas con el inhibidor en comparación con las células tratadas de control no tratadas o revueltos, cuando cuantificar relativamente a la proteína beta actina (BACT) como una carga de control (panel inferior C). El gráfico de barras columna indica la media y los bigotes demostrar el error estándar de la media (SEM). La significación estadística se calculó usando la prueba t no pareada. Los experimentos se repitieron tres veces y se analizaron por duplicado. Si no se trata la cultura = células en los medios de comunicación; scramble = células transfectadas con inhibidores de ARN scramble; miR-21 = inhibidor de las células tratadas con el inhibidor de ARN de miR-21.
Relación entre el miR-21 y la COX-2 en la regulación a la baja de PDCD4 en las células HCA-7
Para investigar más a fondo la interacción funcional entre los miR-21 y COX-2 vías, se analizaron primero COX-2 mRNA y los niveles de proteína en las células HCA-7 después de un tratamiento de 72 horas con el miR-21 inhibidor en comparación con el control de mezcla aleatoria y las células no tratadas. No se observó ninguna diferencia en la expresión COX-2 ni en el mRNA ni en los niveles de proteína (p = 0,62 y p = 0,83, respectivamente, prueba t no pareada), mostrando que la COX-2 no es un objetivo de miR-21 (Fig. S1 en S1 File).
a continuación trataron HCA-7 células con 100 mM NS398, un inhibidor específico de la COX-2 informado de que no citotóxico y eficaz a esta concentración en cultivo celular [41], o con vehículo solo (0,1% DMSO). COX-2 juega un papel crítico durante la inflamación en los pasos iniciales de la conversión del ácido araquidónico en prostaglandinas, incluyendo la prostaglandina E (PGE
2) y la regulación de la COX-2 en el cáncer colorrectal se ha demostrado asociarse con marcado aumento en la producción de PGE
2 [42]. Usando Elisa para medir los niveles de PGE
2 que se encontró una disminución significativa (p = 0,006, prueba de t no pareada) en los medios de las células tratadas con NS398 en comparación con las células no tratadas o células tratadas con vehículo solo, consistente con la inhibición de la COX- 2 actividad catalítica (Fig. S2 en archivo S1).
Tener establecida la eficacia del tratamiento que después se midió la expresión relativa de miR-21 y se podría detectar una disminución significativa en el miR-21 después del tratamiento durante 72 NS398 hora (p & lt; 0,01, prueba de la t no apareado; Fig. 4A). Por el contrario, el tratamiento de HCA 7-células con NS398 no alteró la expresión de PDCD4 mRNA (p = 0,74, prueba t no pareada) (Fig. 4B), una observación que está en contraste con el anteriormente informó 1,5 upregulation pliegue de PDCD4 mRNA siguiente tratamiento de las células HCA-7 con NS398 [39]. La diferencia podría ser debido a los métodos utilizados: el último estudio analizó la expresión PDCD4 ARNm mediante northern blot y cuantificado que sea relativamente a GAPDH, mientras que en nuestro estudio hemos medido los niveles de ARNm utilizando RT-PCR cuantitativa y normalizar los datos utilizando la media geométrica de tres genes de referencia (GAPDH, PGK y HPRT), de conformidad con las directrices MIQE [30] (véase métodos). Nuestra datos en tiempo real PCR sugiere que el tratamiento NS398 conduce a una disminución en los niveles de GAPDH (Fig. S3 en S1 de archivos) y este cambio daría lugar a un aumento aparente en los niveles de PDCD4 si se utilizó GAPDH como el gen de referencia único. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el tratamiento NS398 no altera la tasa de transcripción PDCD4 o la estabilidad del ARNm; Sin embargo, consistente con la disminución observada en miR-21, importantes sobre regulación en la expresión de proteínas PDCD4; se observó en células NS398 tratados en comparación con células solas sin tratar o vehículo (p & lt; 0,001, prueba de la t no apareado) (figura 4C.). Estos datos indican que la baja regulación de PDCD4 por COX-2 no es una consecuencia de la disminución de la síntesis o la estabilidad PDCD4 ARNm, sino más bien que la COX-2 pueden actuar mediante la promoción de un aumento de miR-21 que a su vez inhibe la traducción de PDCD4 mRNA.
Después del tratamiento de 72 horas disminución significativa en los niveles de miR-21 se observó en las células tratadas NS398 (a).
PDCD4
niveles de ARNm no se ven afectados por el tratamiento NS398 (B). El análisis de transferencia Western de PDCD4 (panel superior C para una transferencia representativa) revela un aumento significativo en los niveles de proteína en NS398 células tratadas en comparación con no tratados o vehículo solo (DMSO) células tratadas, cuando cuantificado relativamente a la proteína beta actina (BACT) como una control de carga (panel inferior C). El gráfico de barras columna indica la media y los bigotes demostrar el error estándar de la media (SEM). La significación estadística se calculó usando la prueba t no pareada. Los experimentos se repitieron tres veces y se analizaron por triplicado. Sin tratar = células cultivadas en medios de comunicación; DMSO = células cultivadas en medio suplementado con vehículo DMSO 0,1%; NS398 = células cultivadas en medio suplementado con NS398 preparado en DMSO a una concentración final de 100 mM NS398 y 0,1% de DMSO.
COX-2 de activación de miR-21 en las células HCA-7 está mediada por PGE
2
Dado el papel de la COX-2 en la producción de prostaglandinas, para investigar el mecanismo de activación subyacente de miR-21 por la COX-2 se trató HCA-7 con 1 M de PGE
2 durante 24 horas como esta concentración fue mostrado para trabajar con eficacia en estas células [38]. Encontramos que el miR-21 expresión fue significativamente hasta reguladas (p = 0,019, prueba t no pareada)
2 células tratadas PGE en comparación con vehículo (DMSO al 0,1%) tratados o las células no tratadas (Fig. 5A). No se observaron cambios en los niveles de mRNA en PDCD4 PGE
2 células tratadas (Fig. 5B); sin embargo, una disminución significativa (p & lt; 0,05, prueba t no pareada) se observó en los niveles de proteína PDCD4 que paralelo al aumento de miR-21 (Fig 5C.). El tratamiento combinado con PGE
2 y el inhibidor de miR-21 llevó a los niveles de miR-21 a niveles comparables con los de las células no tratadas (Fig. S1 S4 en archivos), y el tratamiento con aspirina también dio lugar a una disminución de miR 21 niveles (Fig. S5 en archivo S1). Estos datos sugieren que la COX-2 regulación a la baja de PDCD4 impulsado en este sistema modelo se debe principalmente a la regulación positiva de PGE
2 inducida de miR-21.
Después de 24 horas se considera el tratamiento aumento significativo en los niveles de miR-21 en PGE
2 células tratadas (A).
PDCD4
niveles de ARNm no se ven afectados por la PGE
2 de tratamiento (B). El análisis de transferencia Western de PDCD4 (panel superior C para una transferencia representativa) revela una disminución significativa en los niveles de proteína en
2 células tratadas PGE en comparación con no tratados o vehículo solo (DMSO) células tratadas, cuando cuantificado relativamente a la proteína beta actina ( BACT) como control de carga (panel inferior C). El gráfico de barras columna indica la media y los bigotes demostrar el error estándar de la media (SEM). La significación estadística se calculó usando la prueba t no pareada. Los experimentos se repitieron tres veces y se analizaron por duplicado. Sin tratar = células cultivadas en medios de comunicación; DMSO = células cultivadas en medio suplementado con vehículo DMSO 0,1%; PGE
2 = células cultivadas en medio suplementado con PGE
2 preparado en DMSO a una concentración final de 1 mM PGE
2 y 0,1% de DMSO.
Discusión
la desregulación de miRNAs es un paso reconocido en la patogénesis de muchos tipos de cáncer, incluyendo CRC. miR-21 es un miARN frecuencia aumentada en CCR, cuyo incremento en la expresión niveles están asociados con pobres resultados terapéuticos en el CCR [34]. Hemos confirmado que la sobre expresión de miR-21 se correlaciona significativamente con una peor estadificación patológica en la cohorte de nuestro paciente CRC (Fig. 1), que consta de pacientes que presentaban tumores de un estadio de Dukes asignado, lo que sugiere un papel importante de miR-21 en la invasión y la diseminación del cáncer.
Pocos de los objetivos de abajo potenciales regulados por miR-21 se han confirmado, y éstos incluyen la muerte celular programada 4 (PDCD4) gen supresor de tumores que inhibe la transformación neoplásica [43]. Estudios recientes han demostrado una reducción progresiva de la expresión PDCD4 de mucosa normal, al pólipo, a un tumor colorrectal [33]. Curiosamente un aumento significativo de miR-21 se observó en CRC en comparación a la normalidad, pero no entre pólipos adenomatosos y normales, aunque una disminución de la expresión PDCD4 fue evidente en esta transición [33]. En nuestra cohorte se observó una disminución en los niveles de mRNA en PDCD4 los tumores en relación con los tejidos normales, pero no hay cambios como enfermedad progresó por estadio de Dukes (Fig. 2A). En conjunto, estas observaciones sugieren que en la transición de normal a regulación a la baja la hiperproliferación de PDCD4 podría ser debido a la regulación a nivel de transcripción y /o ARN y estabilidad de la proteína. Sin embargo, en la transición a la malignidad miR-21 mediada por la inhibición de la traducción de PDCD4 niveles de proteína de la ya disminución de los niveles de
PDCD4
mRNA vuelve predominante, promoviendo así la progresión de la malignidad. Por lo tanto, la determinación de los factores que influyen en aguas arriba de miR-21 expresión es fundamental para establecer si y cómo el miR-21 contribuye a la progresión maligna y para proporcionar a los posibles dianas terapéuticas
.
Dado que en nuestra cohorte de pacientes de CRC regulación al alza de miR 21 está positivamente relacionada con la de la COX-2 mRNA y con una peor estadificación patológica (Fig. 1 y 2B), la hipótesis de que el miR-21 upregulation en el CCR podría estar vinculado a una respuesta inflamatoria.